Metoda opracowywania nowych leków przeciwnowotworowych z wykorzystaniem eksplantatów guzów z materiału chirurgicznego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie nowej metody badania skuteczności leków z wykorzystaniem preparatów chirurgicznych guzów mózgu, nazwanej metodą tumor X explan. Jest to realizowane poprzez wstępne pozyskanie świeżo usuniętych preparatów chirurgicznych złośliwych glejaków podczas operacji na potrzeby eksperymentów przedklinicznych. Następnie próbki są transportowane do centralnego laboratorium pozyskiwania tkanek w celu ich rozdzielenia na cele diagnostyki klinicznej oraz badawczej.

Następnie w laboratorium badawczym eksplanty nowotworowe są dzielone na mniejsze fragmenty tkanek i przenoszone do zoptymalizowanego medium. Na koniec wykonuje się wewnątrznowotworowe wstrzyknięcia kandydatów na leki, a eksplanty inkubuje się przez 16 godzin. W rezultacie można uzyskać wyniki ujawniające skuteczność leczenia poprzez barwienie hematoksyliną i eozyną oraz immunohistochemię z zastosowaniem markerów specyficznych dla danego typu komórek.

Możemy również oceniać skuteczność leków in vitro, wykorzystując cytometrię przepływową oraz testy tworzenia neurosfer. Większość obecnych testów skuteczności leków wykazuje rozbieżność między skutecznością leku w aktualnych modelach eksperymentalnych przedklinicznych a skutecznością u pacjentów. W szczególności, testując kandydaty na leki w przypadku nowotworów litych, takich jak złośliwe glejaki, nie możemy lekceważyć wymian sygnałowych zarówno międzykomórkowych, jak i wewnątrzkomórkowych.

Aby uniknąć naruszenia mikrośrodowiska guzów litych, opracowaliśmy metodę hodowli eksplantów nowotworowych. Po usunięciu guzów u pacjentów próbki są transportowane z lub do Zakładu Patomorfologii. Dzielimy fragmenty guza na dwie części. Próbka guza z jednej części jest wykorzystywana do mrożenia i zatapiania w parafinie w celu postawienia diagnozy klinicznej, natomiast pozostała część tkanki nowotworowej jest przesyłana do laboratoriów badawczych do wykorzystania przez naukowców.

Stosując tę metodę, możemy zachować mikrośrodowisko guza wraz z przyległymi śródbłonkowymi komórkami naczyniowymi i komórkami odpornościowymi guza, a także normalne komórki mózgu, które otaczają guz lub migrują do jego jam. Przed przetworzeniem tkanki glejaka przygotuj roztwór ciekły, medium oraz roztwór agaru. Wymieszaj je w stosunku jeden do jednego.

Następnie dodaj jeden mililitr do każdej studni płytek sześciostudzienkowych. Po otrzymaniu świeżej tkanki glejaka wielopostaciowego przenieś ją pęsetą do szalki Petriego i ostrożnie przemyj trzykrotnie pięcioma mililitrami lodowatego 1x PBS, używając skalpela i pęsety. Wykonaj seryjne cięcia preparatów o średnicy około 10 mm z wypreparowanych próbek w celu utworzenia bloków guza, a następnie przenieś każdy blok do jednej studni płytki sześciostudzienkowej z podłożem agarowym, zapewniając odpowiednią ekspozycję na powietrze w celu zachowania żywotności tkanki.

Następnie, używając strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml i igły o rozmiarze 28G i długości pół cala, wstrzyknij w bloki nowotworowe trzykrotnie 5% DMSO, 2,5 nM temozolomidu lub nowego kandydata na lek przeciwnowotworowy, a następnie inkubuj przez 16 h w temperaturze 37 °C w wilgotnym powietrzu zawierającym 5% CO2. Po inkubacji przemyj bloki trzykrotnie 5 ml 1× PBS. Następnie, w probówkach o pojemności 50 ml, utrwal bloki w 10 ml 10% v/v formaliny przez 24 h.

Tkankę zablokuj w parafinie, a następnie wykonaj skrawki o grubości czterech mikronów, odparafinizuj i rehydratuj preparaty. Umieść szkiełka w statywie i inkubuj je w następujących roztworach: ksylen trzykrotnie po pięć minut.

100% etanol trzy razy po pięć minut. 95% etanol raz przez pięć minut oraz 70% etanol raz przez pięć minut. Na koniec płukanie pod bieżącą wodą przez trzy minuty.

Szczegóły dotyczące odsłaniania antygenów oraz hamowania endogenicznego nadtlenku zawiera dołączony protokół pisemny. Aby zablokować przekroje, pokryć tkanki 10% normalnym surowicą kozią, następnie przenieść slajdy do komory wilgotnościowej i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć slajdy trzykrotnie w 1x PBS przez pięć minut każdego mycia.

Następnie dodaj przeciwciała pierwszorzędowe, takie jak specyficzne dla człowieka przeciwciała przeciwko kaspazie 3 lub KI 67, rozcieńczone w 1× PBS, a następnie inkubuj przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia przemyj preparaty 1× PBS trzy razy, po 10 minut each. Następnie pokryj tkanki dwiema do trzech kropli przeciwciał wtórnych znakowanych HRP.

Umieścić preparaty na szkiełkach w wilgotnej komorze i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć raz w roztworze PBS, powtarzając czynność 3 razy po pięć minut. Próbki wywołać przy użyciu zestawu chromogenu DAB zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie przeprowadzić barwienie kontrastowe.

Zanurzyć preparaty w hematynie na 10 do 15 sekund. Następnie płukać pod bieżącą wodą z kranu przez trzy minuty. Odwodnić próbki, zanurzając preparaty w następujących roztworach, a następnie nanieść medium montażowe i przykrywkę.

Następnie należy wykorzystać mikroskop fluorescencyjny do obrazowania preparatów. Obraz MRI ważony w czasie T1 z kontrastem gadolinowym na tej rycinie przedstawia wzmocniony nowotwór glejaka wielopostaciowego lub GBM w prawym płacie czołowym pacjenta przed operacją. Obraz pooperacyjny potwierdził częściowe usunięcie zmiany po zabiegu.

Barwienie hematoksyliną i eosiną wykazuje obecność martwicy, komórek tworzących pseudo-palisady oraz proliferację mikro naczyniową. W związku z tym guzy te zdiagnozowano histopatologicznie jako GBM, aby zbadać, czy próbki eksplantów tych guzów mogą być wiarygodnie wykorzystane. W celu przeprowadzenia testu skuteczności leku zbadaliśmy efekt działania temozolomidu (TMZ); immunohistochemia tkanek GBM leczonych TMZ wykazuje znaczny spadek liczby komórek nowotworowych pozytywnych pod kątem KI 67 w porównaniu z próbkami kontrolnymi.

Z kolei immunohistochemia z zastosowaniem markera apoptozy, kaspazy 3, nie wykazała żadnej istotnej różnicy między preparatami glejaków traktowanymi TMZ a próbkami kontrolnymi. Efekt terapeutyczny temozolomidu można dodatkowo scharakteryzować, łącząc ten test ex explan z hodowlą in vitro lub cytometrią przepływową. Metodę ex explan można porównać z transplantacją ksenograftów oraz testem tworzenia sfer in vitro w celu przesiewowego badania nowych środków przeciwnowotworowych.

Po dostarczeniu tkanek nowotworowych do laboratorium, procedurę tego eksperymentu można ukończyć w ciągu jednej godziny. Ten nowy test jest stosunkowo łatwy do wykonania i powtarzalny po dysocjacji potraktowanych implantów nowotworowych. Można go łączyć z eksperymentami in vitro.

Główną zaletą tego testu jest zachowanie mikrośrodowiska guza. Uzyskaliśmy pozytywne wyniki w przypadku eksplantów guzów leczonych Temodarem, które były zgodne z efektami u tych samych pacjentów, u których zastosowano leczenie Temodarem po operacjach. Wreszcie, metoda ta ma zastosowanie w przypadku innych nowotworów litych, a zatem może mieć potencjał do przyspieszenia identyfikacji nowych środków chemioterapeutycznych do leczenia nowotworów litych.