Name: Metoda opracowywania nowych leków przeciwnowotworowych przy użyciu eksplantatów guza w próbkach chirurgicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj metodę eksplantatów guza do testowania skuteczności leków przeciwnowotworowych na żywych tkankach chirurgicznych glejaków. Technika zachowuje mikrośrodowisko nowotworu, umożliwiając wiarygodną ocenę leków in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

American Cancer Society (MRSG-08-108-01), Vincent J. Sgro/The American Brain Tumor Association oraz Khan Family Foundation dla I Nakano.

1. Przygotowanie pożywek
<ol>
<li>Pożywkę przygotowano, stosując 10% FBS (16140-071- GIBCO) w DMEM/F-12 (1X), Liquid 1:1 (10565-042- Invitrogen) z 0,6% roztworem Agar solution Purified, Granulated (1.01614.1000- EMD). Przez cały czas trwania eksperymentu zachowano warunki sterylne.</li>
<li>W celu przygotowania pożywki do 45 mL DMEM/F-12 (1X), Liquid 1:1 (10565-042- Invitrogen) dodano 5 mL FBS (16140-071- GIBCO), uzyskując objętość końcową 50 mL. Przygotowaną pożywkę utrzymywano w kąpieli wodnej w temperaturze 37°C.</li>
<li>Roztwór agaru przygotowano metodą podgrzewania w kuchence mikrofalowej. 0,3 g agaru granulowanego rozpuszczono w 50 mL wody destylowanej za pomocą mikrofalówki. Roztwór agaru schłodzono do temperatury 37°C, umieszczając go w kąpieli wodnej.</li>
<li>Przygotowano roztwór stokowy, mieszając w równych objętościach pożywki z etapu 1.2 oraz 1.3. Stosunek 0,6% agaru (0,5 mL) do pożywki 10% FBS-D-MEM/F-12 (0,5 mL) wynosił 1:1, co dało całkowitą objętość 1 mL w każdym dołku płytek 6-dołkowych.</li>
</ol>
2. Obróbka tkanki
<ol>
<li>Tkanki glejaka wielopostaciowego (GBM) otrzymano bezpośrednio po operacji z Zakładu Patomorfologii. Tkanka została zaklasyfikowana jako GBM przez Zakład Patomorfologii.</li>
<li>Tkankę ostrożnie przeniesiono pęsetą na płytkę Petriego i przemyto 3 razy 5 mL lodowatego 1XPBS.</li>
<li>Z rozczłonkowanych próbek wycięto seryjne sekcje, aby utworzyć bloki guza (o średnicy ok. 10 mm), używając skalpela (Feather-2976#10) i pęsety (fisher scientific).</li>
<li>Bloki przeniesiono do płytki 6-dołkowej. Każdy dołek zawierał 1 mL pożywki wspomnianej w kroku 1.4. Tkanka miała wystarczający dostęp do powietrza, aby zachować żywotność.</li>
<li>Następnie do bloków guza wstrzyknięto DMSO (5%) lub TMZ (2.5 nM) i inkubowano przez 16 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnym powietrzu zawierającym 5% CO2. W celu zapewnienia jednorodnej terapii, 0.1 mL DMSO (5%) lub TMZ wstrzyknięto 3 razy w różnych miejscach bloków guza. Lek wstrzykiwano za pomocą strzykawki insulinowej 1mL 0.37X12.7mm 28G1/2 (Comfort point-26027).</li>
<li>Po 16 godzinach bloki przemyto 3 razy 5 mL 1XPBS. Po przemyciu bloki utrwalono w 10 mL 10 % v/v formaliny (Ricca chemical company) przez 24 godziny w probówkach 50 mL (Basix-5539802), a następnie poddano procesowi zatapiania w parafinie w celu wykonania przekrojów o grubości 4μm.</li>
<li>Przekroje utrwalone w formalinie umieszczono w zlewce na mieszadle magnetycznym w trybie „NO HEAT” (bez ogrzewania) i poddano działaniu następujących roztworów przez 30 minut w każdym z nich: 30% etanolu, 50% etanolu, 75% etanolu, 80% etanolu, 95% etanolu, 100% etanolu oraz ksylenu.</li>
<li>Tkankę osuszono ręcznikami papierowymi i umieszczono w roztopionej parafinie (58 do 60 °C, parafina Fisher Paraplast) na 30 minut.</li>
<li>Tkankę zatopiono w formach przy użyciu parafiny Surgipath Blue Ribbon, a następnie schłodzono do temperatury pokojowej.</li>
<li>Wykonano przekroje tkankowe o grubości 4μm zatopione w parafinie i umieszczono je na szkiełkach Fisher Plus.</li>
</ol>
3. Immunohistochemia
Immunohistochemię przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem. 1 
<ol>
<li>Deparafinizacja i rehydratacja
Umieścić preparaty na szkiełkach w koszyczku i przeprowadzić następujące etapy: ksylen 3x5 minut, etanol 100% 3x5 minut, etanol 95% 1x5 minut, etanol 70% 1x5 minut, płukanie pod bieżącą wodą z kranu przez 3 minuty.
</li>
<li>Ujawnianie antygenów metodą HIER (Heat Induced Epitope Retrieval)
Zanurzyć szkiełka w 1X buforze cytrynianowym (Thermo scientific-AP9003-500) rozcieńczonym w wodzie destylowanej w zlewce szklanej. Gotować przez 15 minut na płycie grzejnej (należy upewnić się, że skrawki nie oddzielają się od szkiełka). Chłodzić roztwór przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Płukać szkiełka w 1X PBS 3x5 minut.
</li>
<li>Inhibicja endogennego nadtlenku
Zanurzyć szkiełka w metanolu (Fisher Scientific-A-452-4) z 0,3% nadtlenkiem wodoru (Fisher Scientific- BP2633-500- rozcieńczonym w wodzie destylowanej) w zlewce szklanej przez 15 minut. Płukać w 1X PBS 3x5 minut.
</li>
<li>Blokowanie
Przykryć tkanki 10% normalnym surowicą kozią. Przenieść szkiełka do komory wilgotnościowej i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć szkiełka w 1X PBS 3x5 minut.
</li>
<li>Przeciwciało pierwszorzędowe
Skrawki inkubowano przez noc w 4°C z przeciwciałami pierwszorzędowymi w następujących stężeniach: swoiste dla człowieka przeciwciało przeciwko Caspase-3 (1:1,000, R&amp;D systems, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15626) rozcieńczone w 1X PBS. Następnego dnia płukać szkiełka w 1X PBS 3x10 minut.
</li>
<li>Reakcja z przeciwciałem drugorzędowym
Przykryć tkanki 2-3 kroplami przeciwciała drugorzędowego znakowanego HRP (envision systems). Umieścić szkiełka w komorze wilgotnościowej i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć w 1X PBS 3x10 minut.
</li>
<li>Detekcja
Przeprowadzić reakcję z zestawem chromogenem DAB (Vector laboratories-SK-4100) w celu detekcji przeciwciała pierwszorzędowego zgodnie z protokołem producenta.
</li>
<li>Kontrastowanie
Zanurzyć szkiełka w hematoksylinie (10-15 sekund, należy upewnić się, że nie przysłonięto sygnału DAB). Płukać pod bieżącą wodą z kranu przez 3 minuty.
</li>
<li>Dehydratacja
Zanurzać szkiełka w następującej kolejności: etanol 70% przez 5 minut, etanol 95% przez 5 minut, etanol 100% 3x5 minut, ksylen 3x5 minut.
</li>
<li>Przykryć szkiełka szkiełkami zakrywkowymi, używając medium montażowego permount (Fisher Scientific-SP-15-100). </li>
<li>Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Olympus (DP-72).3.11). We wszystkich eksperymentach swoistość znakowania potwierdzono za pomocą kontroli negatywnej bez przeciwciała pierwszorzędowego.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Zebrano próbki chirurgiczne glejaka wielopostaciowego (GBM). Pacjenci przeszli pierwszą operację bez uprzedniej chemioterapii, w tym bez podawania temozolomidu (TMZ). Obraz MRI w obrazowaniu T1 z kontrastem gadolinowym przedstawiony na Ryc. 1a wykazał obecność wzmocnionego sygnału guza w prawym płacie czołowym przed operacją. Obraz pooperacyjny (Ryc. 1b) potwierdził subtotalną resekcję zmiany po zabiegu. Tkanki chirurgiczne przekazano do Zakładu Patomorfologii w celu postawienia diagnozy klinicznej, a pozostałe próbki poddano procedurze pozyskiwania tkanek zgodnie z zatwierdzonym protokołem Instytucjonalnej Rady Recenzenckiej (IRB) w Ohio State University Medical Center. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) wykazało obecność martwicy, komórek tworzących pseudopalisady oraz proliferację mikro naczyniową (Ryc. 1-c). W związku z powyższym guzy te zdiagnozowano histopatologicznie jako GBM. Należy zauważyć, że eksplanty guza po inkubacji bez TMZ do 48 godzin zachowały cytoarchitekturę GBM. W przeciwieństwie do tego, przy inkubacji trwającej 72 godziny lub dłużej, zaobserwowano zwiększoną liczbę skondensowanych jąder w próbkach, co sugeruje rozpoczęcie procesu apoptozy w niektórych komórkach nowotworowych. W rezultacie tkanki guza po dłuższej inkubacji zawierały ogniskowe obszary utraty komórek nowotworowych, które obserwowane były głównie w obrębie i wokół obszarów martwiczych (dane nieprzedstawione). 
Aby zbadać, czy te próbki eksplantów nowotworowych mogą być wiarygodnie wykorzystywane do testowania skuteczności leków, przebadaliśmy efekt leczenia TMZ. Rycina 2 przedstawia przebieg eksperymentów w niniejszym badaniu. Niedawne badanie wykazało, że wewnątrznowotworowe wstrzykiwanie TMZ wykazuje silniejszy efekt w kontroli wzrostu złośliwego glejaka niż systemiczne podawanie tego leku 2. Po inkubacji przez 16 godzin eksplanty te zatopiono w parafinie i przygotowano seryjne skrawki do barwienia. Immunohistochemia tkanek GBM leczonych TMZ wykazała znaczny spadek liczby komórek nowotworowych wykazujących pozytywną reakcję na Ki-67 w porównaniu z próbkami kontrolnymi. Z kolei immunohistochemia z użyciem markera apoptozy, kaspazy-3, nie wykazała żadnej istotnej różnicy między preparatami glejaka leczonymi TMZ a próbkami kontrolnymi (Rycina 3).
Efekt działania TMZ scharakteryzowano dalej, łącząc ten test eksplantów z hodowlą in vitro lub cytometrią przepływową. W szczególności dążono do określenia wpływu na nowotworowe komórki o charakterystyce komórek macierzystych (SCLTC). W związku z tym, po leczeniu wewnątrznowotworowym TMZ, przeprowadzono test tworzenia sfer oraz cytometrię przepływową tych eksplantów nowotworowych. Próbki traktowane TMZ rozdzielono na pojedyncze komórki, które następnie wysiano z niską gęstością (1 komórka na mikrolitr lub mniej) w płytkach 96-dołkowych w medium bezsurowiczym uzupełnionym o bFGF i EGF. W grupie kontrolnej, po 7-dniowej inkubacji, zaobserwowano tworzenie sfer nowotworowych z eksplantów nowotworowych. Biorąc pod uwagę, że zdolność do tworzenia sfer jest właściwością SCLTC3 4, zmiany w liczbie sfer nowotworowych wywołane leczeniem lekiem wskazują na wpływ na SCLTC. Podobnie, w celu weryfikacji efektu na SCLTC, przeprowadzono cytometrię przepływową rozdzielonych eksplantów nowotworowych z użyciem markera powierzchniowego CD133. Jeśli SCLTC w heterogenicznych komórkach nowotworowych w GBM są selektywnie eliminowane przez leczenie lekiem, można przewidywać, że cytometria przepływowa powinna wykazać zmniejszenie frakcji CD133-dodatnich w wyniku leczenia (dane nie pokazano).
<img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig1.jpg" alt="MRI mózgu i histologia; analiza guza; MRI przed i po kontrastem, obraz histopatologiczny tkanki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Obrazy rezonansu magnetycznego (MRI) pacjenta z GBM. Reprezentatywne obrazy sprzed operacji (Rysunek 1a) oraz po operacji (Rysunek 1b). Rysunek 1c przedstawia barwienie H&amp;E świeżej próbki tkanki GBM. Powiększenie oryginalne, 40X.
<img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig2.jpg" alt="Eksperyment z kulturą tkankową przedstawiający przenoszenie próbki pęsetą do płytki wielodołkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Schemat eksperymentu z hodowlą blokową. Rycina 2a. Zdjęcie świeżego materiału chirurgicznego GBM otrzymanego z oddziału patomorfologii. Rycina 2b przedstawia sekcję bloku guza na małe fragmenty o wielkości 10 mm przy użyciu skalpela chirurgicznego. Rycina 2c przedstawia traktowanie bloków guza lekiem (TMZ) za pomocą strzykawki insulinowej.
<img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig3.jpg" alt="Analiza histologiczna, barwienie na kaspazę-3/Ki-67, traktowanie DMSO/TMZ, obraz mikroskopowy, apoptoza komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Immunohistochemia. Immunohistochemia bloków tkanek GBM po wstrzyknięciu DMSO lub TMZ z wykazaniem aktywnej kaspazy-3 oraz Ki67. Do barwienia jąder komórkowych użyto hematoksyliny. Powiększenie oryginalne, 40X.

<ol><li>Hemmati, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancerous+stem+cells+can+arise+from+pediatric+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15178-15183 (2003).</li>
<li>Heimberger, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temozolomide+delivered+by+intracerebral+microinfusion+is+safe+and+efficacious+against+malignant+gliomas+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Temozolomide delivered by intracerebral microinfusion is safe and efficacious against malignant gliomas in rats.</a> Clin Cancer Res. 6, 4148-4153 (2000).</li>
<li>Nakano, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+embryonic+leucine+zipper+kinase+is+a+key+regulator+of+the+proliferation+of+malignant+brain+tumors%2C+including+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Maternal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors, including brain tumor stem cells.</a> J Neurosci Res. 86, 48-60 (2008).</li>
<li>Laks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+formation+is+an+independent+predictor+of+clinical+outcome+in+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Neurosphere formation is an independent predictor of clinical outcome in malignant glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li>
<li>Phillips, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+subclasses+of+high-grade+glioma+predict+prognosis%2C+delineate+a+pattern+of+disease+progression%2C+and+resemble+stages+in+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis.</a> Cancer Cell. 9, 157-173 (2006).</li>
<li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteomic+Analysis+of+Glioblastoma+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycoproteomic Analysis of Glioblastoma Stem Cell Differentiation.</a> J Proteome Res. , (2010).</li>
<li>Ma, Y. H., Xu, Q. S., Zheng, J. S., Zhou, Y. Q., Zhan, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+stem+cell+markers+and+proliferative+labeling+on+glioma+cell+lines%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Bing+Li+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Expression of stem cell markers and proliferative labeling on glioma cell lines].</a> Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 37, 333-334 (2008).</li>
<li>Vik-Mo, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cells+maintain+overall+phenotype+and+tumorigenicity+after+in+vitro+culturing+in+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cells maintain overall phenotype and tumorigenicity after in vitro culturing in serum-free conditions.</a> Neuro Oncol. 12, 1220-1230 (2010).</li>
<li>Hovinga, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+notch+signaling+in+glioblastoma+targets+cancer+stem+cells+via+an+endothelial+cell+intermediate.+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells.</a> 28, 1019-1029 (2010).</li>
<li>de Groot, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+invasion+after+treatment+of+glioblastoma+with+bevacizumab%3A+radiographic+and+pathologic+correlation+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor invasion after treatment of glioblastoma with bevacizumab: radiographic and pathologic correlation in humans and mice.</a> Neuro Oncol. 12, 233-242 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Istnieje rozbieżność między skutecznością leków w obecnych przedklinicznych modelach doświadczalnych a ich skutecznością u pacjentów. W szczególności w dziedzinie badań nad guzami mózgu wymagane są nowe i niezawodne metody, które pomogłyby wypełnić istniejącą lukę między oceną leków za pomocą obecnych metod a ich skutecznością u pacjentów. Opisany w niniejszym badaniu test stanowi dodatkowe wsparcie, jeśli nie rozwiązanie, ułatwiające niwelowanie rozbieżności między danymi eksperymentalnymi a wynikami u chorych pacjentów. 


Hodowle komórkowe in vitro preferencyjnie namnażają określone typy komórek nowotworowych niezależnie od warunków hodowli i reprezentują jedynie subpopulację całego guza. 5 Dodatkowo w przypadku długotrwałych hodowli komórkowych nieunikniona jest transformacja genetyczna i fenotypowa podczas sztucznego namnażania komórek. Jedną z głównych przeszkód w leczeniu złośliwego glejaka jest heterogenność komórek nowotworowych, zarówno w obrębie pojedynczego guza, jak i pomiędzy próbkami nowotworowymi 6, 7. W związku z tym selektywne wzbogacanie określonej populacji komórek nowotworowych, niezależnie od ich typu, może nie być odpowiednią metodą określania skuteczności środków chemioterapeutycznych wobec heterogennych komórek nowotworowych. 8 9 Każdy model zwierzęcy guzów mózgu pochodzący z subpopulacji komórek nowotworowych rzuca światło na skuteczność leku w odniesieniu do tej subpopulacji, a nie do całego guza. 


Z drugiej strony, metoda ta z wykorzystaniem eksplantów guza wciąż posiada kilka ograniczeń. Jednym z nich jest stosunkowo krótki okres leczenia. Ponieważ uważa się, że komórki nowotworowe z czasem nabywają oporności na większość, jeśli nie wszystkie terapie, początkowa kontrola krótkoterminowego wzrostu komórek guza może nie odzwierciedlać długoterminowego rokowania pacjenta, co niedawno zgłoszono w przypadku bevacizumabu, czynnika antyangiogennego 10. Zatem w toku dalszych badań konieczne jest usprawnienie protokołu tego testu z eksplantami w celu dłuższej konserwacji tkanek. Inną kwestią jest specyficzny wpływ badanego leku na SCLTC w guzie. Biorąc pod uwagę, że SCLTC są stosunkowo oporne na obecne terapie złośliwego glejaka, uzasadnione jest poszukiwanie nowych leków przeciwnowotworowych, które skutecznie eliminują SCLTC. W związku z tym obecnie dążymy do połączenia tego testu z eksplantami z późniejszymi badaniami in vitro, takimi jak test tworzenia neurosfer (dane nie pokazano). Spodziewamy się, że dzięki tym połączonym testom dowiemy się więcej o efektach, o ile takie wystąpią, kandydata na lek w stosunku do SCLTC. Wreszcie, użycie małych bloków próbek guza może nie odzwierciedlać całej populacji komórek nowotworowych, co ma miejsce w przypadku konwencjonalnych linii komórkowych nowotworu lub kultur pierwotnych z preparatów chirurgicznych. Pomijając te kwestie, zachowanie zrębu guza, w tym niszy naczyniowej, jest pomocne w charakteryzacji czynników środowiskowych dla komórek nowotworowych. Dlatego test ten może mieć potencjał do oceny dowolnych strategii terapeutycznych w warunkach bardziej zbliżonych fizjologicznie. 


W niniejszej pracy opracowaliśmy test skuteczności leków z wykorzystaniem eksplantów z chirurgicznych preparatów GBM. W przypadku badanych preparatów chirurgicznych stwierdzono, że bezpośrednie wstrzyknięcie TMZ ogranicza proliferację w próbkach GBM. Metoda ta, oparta na eksplantach tkankowych, jest teoretycznie możliwa do zastosowania w przypadku innych nowotworów litych i stanowi narzędzie do określania skuteczności leku w odniesieniu do guza konkretnego pacjenta, co w nadziei pomoże uniknąć kolejnych niepowodzeń w badaniach klinicznych nad nowotworami.

<table><tbody><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), kwalifikowana, inaktywowana ciepłem</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1X) ciecz 1:1 </td><td>Invitrogen</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>Agar-agar oczyszczony, granulowany </td><td>EMD Millipore</td><td>1.01614.1000</td><td></td></tr><tr><td>DPBS do barwienia </td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>7211</td><td></td></tr><tr><td>10% w/v formalina Caspase-3 </td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3810</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-3</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF835</td><td></td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Dako</td><td>15626</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>System Envision – anty-mysi</td><td>Dako</td><td>2012-07</td><td></td></tr><tr><td>System Envision – anty-króliczy</td><td>Dako</td><td>2011-12</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DAB</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Materiały.</td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko Petriego</td><td>VWR international</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna</td><td>Axygen Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapturki z filtrem</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wkładka Netwell z siatką poliestrową 500 &amp;mu;m</td><td>Costar</td><td>3480</td><td></td></tr><tr><td>Macierz Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka BD 10 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Igła podskórna z aluminiowym piastem </td><td>Tyco Healthcare, Covidien</td><td>2000029</td><td></td></tr><tr><td>Flask do hodowli tkankowych </td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>Basix</td><td>&lt;span&gt;5539800&lt;/span&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Probówki o cienkich ściankach </td><td>Eton</td><td>1107A</td><td></td></tr><tr><td> Chirurgiczne ostrze ze stali nierdzewnej </td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2976#10</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa </td><td>Comfort point</td><td>26027</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 50 mL z płaskim dnem i zakrętką</td><td>Basix</td><td>5539802</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus Corporation</td><td>DP-72</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 2.&lt;/strong&gt; Sprzęt.</td></tr></tbody></table>

metoda opracowywania nowych leków przeciwnowotworowych z wykorzystaniem eksplantatów guzów z materiału chirurgicznego

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Obecne terapie glejaka złośliwego wykazują jedynie działanie paliatywne. Przeszkodą w rozwoju terapeutycznym jest rozbieżność między skutecznością określaną przez obecne testy efektywności leków a skutecznością u pacjentów. W związku z tym, w fazie przedklinicznej niezbędne są nowe i niezawodne metody oceny skuteczności leków. Hodowle in vitro tkanek nowotworowych, w tym linie komórkowe, wykazują znaczne zmiany fenotypowe, genetyczne i epigenetyczne komórek rakowych spowodowane sztucznym środowiskiem hodowli komórkowej, co może nie odzwierciedlać biologii oryginalnych guzów in situ. Modele ksenoprzeszczepów u myszy z niedoborem odporności również mają swoje ograniczenia, takie jak brak układu odpornościowego oraz międzygatunkowe rozbieżności genetyczne i epigenetyczne w mikrośrodowisku. W niniejszej pracy prezentujemy nową metodę wykorzystującą preparaty chirurgiczne glejaka złośliwego w formie nierozdzielonych bloków nowotworowych do oceny efektów leczenia. Aby zwalidować tę metodę, opisano dane uzyskane przy zastosowaniu obecnego leku chemioterapeutycznego pierwszego rzutu, temozolomidu (TMZ).


W naszych eksperymentach wykorzystaliśmy świeżo pobrane chirurgiczne preparaty złośliwego glejaka. Przeprowadziliśmy wewnątrznowotworowe wstrzyknięcia TMZ lub innych potencjalnych leków, po czym nastąpiła inkubacja i analiza preparatów chirurgicznych. W niniejszej pracy dążyliśmy do opracowania metody eksplantacji tkanki nowotworowej jako platformy do określania skuteczności nowych terapii przeciwnowotworowych, tak aby umożliwić przezwyciężenie przynajmniej części obecnych ograniczeń i wypełnienie istniejącej luki między aktualnymi danymi eksperymentalnymi a skutecznością działania w guzie rzeczywistego pacjenta. Metoda ta może mieć potencjał przyspieszenia identyfikacji nowych środków chemioterapeutycznych do leczenia nowotworów litych.

W niniejszej pracy opracowaliśmy metodę badania skuteczności leków z wykorzystaniem chirurgicznych preparatów guzów mózgu, nazwaną „metodą eksplantatu guza”. Dzięki tej metodzie możemy ocenić skuteczność leków bez naruszania mikrośrodowiska guzów litych. Aby potwierdzić wiarygodność tej metody, przedstawiamy reprezentatywne dane z badania naszego preparatu glejaka traktowanego obecnie stosowanym w pierwszej linii chemioterapii temozolomidem.

Metoda opracowywania nowych leków przeciwnowotworowych z wykorzystaniem eksplantatów guzów z materiału chirurgicznego

Obecne terapie złośliwego glejaka wykazują jedynie efekt paliatywny. W opracowywaniu nowych metod terapeutycznych jedną z przeszkód jest rozbieżność w skuteczności określonej...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie nowej metody badania skuteczności leków z wykorzystaniem preparatów chirurgicznych guzów mózgu, nazwanej metodą tumor X explan. Jest to realizowane poprzez wstępne pozyskanie świeżo usuniętych preparatów chirurgicznych złośliwych glejaków podczas operacji na potrzeby eksperymentów przedklinicznych. Następnie próbki są transportowane do centralnego laboratorium pozyskiwania tkanek w celu ich rozdzielenia na cele diagnostyki klinicznej oraz badawczej.Następnie w laboratorium badawczym eksplanty nowotworowe są dzielone na mniejsze fragmenty tkanek i przenoszone do zoptymalizowanego medium. Na koniec wykonuje się wewnątrznowotworowe wstrzyknięcia kandydatów na leki, a eksplanty inkubuje się przez 16 godzin. W rezultacie można uzyskać wyniki ujawniające skuteczność leczenia poprzez barwienie hematoksyliną i eozyną oraz immunohistochemię z zastosowaniem markerów specyficznych dla danego typu komórek.Możemy również oceniać skuteczność leków in vitro, wykorzystując cytometrię przepływową oraz testy tworzenia neurosfer. Większość obecnych testów skuteczności leków wykazuje rozbieżność między skutecznością leku w aktualnych modelach eksperymentalnych przedklinicznych a skutecznością u pacjentów. W szczególności, testując kandydaty na leki w przypadku nowotworów litych, takich jak złośliwe glejaki, nie możemy lekceważyć wymian sygnałowych zarówno międzykomórkowych, jak i wewnątrzkomórkowych.Aby uniknąć naruszenia mikrośrodowiska guzów litych, opracowaliśmy metodę hodowli eksplantów nowotworowych. Po usunięciu guzów u pacjentów próbki są transportowane z lub do Zakładu Patomorfologii. Dzielimy fragmenty guza na dwie części. Próbka guza z jednej części jest wykorzystywana do mrożenia i zatapiania w parafinie w celu postawienia diagnozy klinicznej, natomiast pozostała część tkanki nowotworowej jest przesyłana do laboratoriów badawczych do wykorzystania przez naukowców.Stosując tę metodę, możemy zachować mikrośrodowisko guza wraz z przyległymi śródbłonkowymi komórkami naczyniowymi i komórkami odpornościowymi guza, a także normalne komórki mózgu, które otaczają guz lub migrują do jego jam. Przed przetworzeniem tkanki glejaka przygotuj roztwór ciekły, medium oraz roztwór agaru. Wymieszaj je w stosunku jeden do jednego.Następnie dodaj jeden mililitr do każdej studni płytek sześciostudzienkowych. Po otrzymaniu świeżej tkanki glejaka wielopostaciowego przenieś ją pęsetą do szalki Petriego i ostrożnie przemyj trzykrotnie pięcioma mililitrami lodowatego 1x PBS, używając skalpela i pęsety. Wykonaj seryjne cięcia preparatów o średnicy około 10 mm z wypreparowanych próbek w celu utworzenia bloków guza, a następnie przenieś każdy blok do jednej studni płytki sześciostudzienkowej z podłożem agarowym, zapewniając odpowiednią ekspozycję na powietrze w celu zachowania żywotności tkanki.Następnie, używając strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml i igły o rozmiarze 28G i długości pół cala, wstrzyknij w bloki nowotworowe trzykrotnie 5% DMSO, 2,5 nM temozolomidu lub nowego kandydata na lek przeciwnowotworowy, a następnie inkubuj przez 16 h w temperaturze 37 °C w wilgotnym powietrzu zawierającym 5% CO2. Po inkubacji przemyj bloki trzykrotnie 5 ml 1× PBS. Następnie, w probówkach o pojemności 50 ml, utrwal bloki w 10 ml 10% v/v formaliny przez 24 h.Tkankę zablokuj w parafinie, a następnie wykonaj skrawki o grubości czterech mikronów, odparafinizuj i rehydratuj preparaty. Umieść szkiełka w statywie i inkubuj je w następujących roztworach: ksylen trzykrotnie po pięć minut.100% etanol trzy razy po pięć minut. 95% etanol raz przez pięć minut oraz 70% etanol raz przez pięć minut. Na koniec płukanie pod bieżącą wodą przez trzy minuty.Szczegóły dotyczące odsłaniania antygenów oraz hamowania endogenicznego nadtlenku zawiera dołączony protokół pisemny. Aby zablokować przekroje, pokryć tkanki 10% normalnym surowicą kozią, następnie przenieść slajdy do komory wilgotnościowej i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć slajdy trzykrotnie w 1x PBS przez pięć minut każdego mycia.Następnie dodaj przeciwciała pierwszorzędowe, takie jak specyficzne dla człowieka przeciwciała przeciwko kaspazie 3 lub KI 67, rozcieńczone w 1× PBS, a następnie inkubuj przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia przemyj preparaty 1× PBS trzy razy, po 10 minut each. Następnie pokryj tkanki dwiema do trzech kropli przeciwciał wtórnych znakowanych HRP.Umieścić preparaty na szkiełkach w wilgotnej komorze i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć raz w roztworze PBS, powtarzając czynność 3 razy po pięć minut. Próbki wywołać przy użyciu zestawu chromogenu DAB zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie przeprowadzić barwienie kontrastowe.Zanurzyć preparaty w hematynie na 10 do 15 sekund. Następnie płukać pod bieżącą wodą z kranu przez trzy minuty. Odwodnić próbki, zanurzając preparaty w następujących roztworach, a następnie nanieść medium montażowe i przykrywkę.Następnie należy wykorzystać mikroskop fluorescencyjny do obrazowania preparatów. Obraz MRI ważony w czasie T1 z kontrastem gadolinowym na tej rycinie przedstawia wzmocniony nowotwór glejaka wielopostaciowego lub GBM w prawym płacie czołowym pacjenta przed operacją. Obraz pooperacyjny potwierdził częściowe usunięcie zmiany po zabiegu.Barwienie hematoksyliną i eosiną wykazuje obecność martwicy, komórek tworzących pseudo-palisady oraz proliferację mikro naczyniową. W związku z tym guzy te zdiagnozowano histopatologicznie jako GBM, aby zbadać, czy próbki eksplantów tych guzów mogą być wiarygodnie wykorzystane. W celu przeprowadzenia testu skuteczności leku zbadaliśmy efekt działania temozolomidu (TMZ); immunohistochemia tkanek GBM leczonych TMZ wykazuje znaczny spadek liczby komórek nowotworowych pozytywnych pod kątem KI 67 w porównaniu z próbkami kontrolnymi.Z kolei immunohistochemia z zastosowaniem markera apoptozy, kaspazy 3, nie wykazała żadnej istotnej różnicy między preparatami glejaków traktowanymi TMZ a próbkami kontrolnymi. Efekt terapeutyczny temozolomidu można dodatkowo scharakteryzować, łącząc ten test ex explan z hodowlą in vitro lub cytometrią przepływową. Metodę ex explan można porównać z transplantacją ksenograftów oraz testem tworzenia sfer in vitro w celu przesiewowego badania nowych środków przeciwnowotworowych.Po dostarczeniu tkanek nowotworowych do laboratorium, procedurę tego eksperymentu można ukończyć w ciągu jednej godziny. Ten nowy test jest stosunkowo łatwy do wykonania i powtarzalny po dysocjacji potraktowanych implantów nowotworowych. Można go łączyć z eksperymentami in vitro.Główną zaletą tego testu jest zachowanie mikrośrodowiska guza. Uzyskaliśmy pozytywne wyniki w przypadku eksplantów guzów leczonych Temodarem, które były zgodne z efektami u tych samych pacjentów, u których zastosowano leczenie Temodarem po operacjach. Wreszcie, metoda ta ma zastosowanie w przypadku innych nowotworów litych, a zatem może mieć potencjał do przyspieszenia identyfikacji nowych środków chemioterapeutycznych do leczenia nowotworów litych.

method-for-novel-anti-cancer-drug-development-using-tumor-explants

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Metoda rozwoju nowych leków przeciwnowotworowych z wykorzystaniem eksplantatów guzów z materiału operacyjnego

Ten film demonstruje technikę badania in vivo lokalizacji przeciwciał specyficznych dla nowotworu w modelu ksenoprzeszczepu guza myszy. Po podskórnym wstrzyknięciu komórek rakowych myszom w celu powstania guza, wstrzykuje się fluorescencyjnie znakowane przeciwciała, które wiążą się z receptorami specyficznymi dla guza, umożliwiając ocenę in vivo lokalizacji przeciwciał za pomocą obrazowania.

Technika oceny lokalizacji in vivo przeciwciał specyficznych dla nowotworu

Ten film demonstruje technikę lokalizacji immunofluorescencji in vivo (IVIL) do badania biodystrybucji przeciwciał skierowanych przeciwko nowotworowi w mysim modelu raka piersi. Po dożylnym wstrzyknięciu przeciwciała specyficznego dla nowotworu myszy, guz jest izolowany chirurgicznie, a lokalizacja przeciwciała w tkance nowotworowej jest potwierdzana za pomocą barwienia immunologicznego ex vivo.

Metoda lokalizacji immunofluorescencji in vivo do badania biodystrybucji przeciwciał

Uznane linie komórek rakowych i ksenoprzeszczepy były podstawą badań nad rakiem przez ostatnie kilkadziesiąt lat. Jednak najnowsze dowody sugerują, że na odpowiedź terapeutyczną duży wpływ ma mikrośrodowisko komórek nowotworowych. W związku z tym opracowaliśmy analizę ex vivo pierwotnych próbek guzów w celu opracowania leków.

Ex vivo Odpowiedź na leczenie guzów pierwotnych i/lub związanych z nimi przerzutów w przedklinicznym i klinicznym rozwoju terapii

Wykorzystanie guzów pochodzących od pacjentów w podskórnym modelu przedklinicznym to doskonały sposób na badanie skuteczności nowych terapii, predykcyjnego odkrywania biomarkerów i ścieżek oporności na leki. Model ten, w procesie opracowywania leków, ma zasadnicze znaczenie dla określenia losu wielu nowatorskich terapii przeciwnowotworowych przed rozpoczęciem badań klinicznych.

Opracowanie i utrzymanie przedklinicznego modelu ksenoprzeszczepu nowotworu pochodzącego od pacjenta w celu zbadania nowych terapii przeciwnowotworowych

Opisujemy szczegółowy protokół izolacji komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z ludzkim mięsakiem poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, przy użyciu ludzkiego antygenu leukocytów-1 (HLA-1) jako markera ujemnego, oraz dla dalszej walidacji i charakterystyki tych komórek inicjujących HLA-1-ujemny nowotwór.

Izolacja i charakterystyka komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z mięsakiem

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystania wspomaganego ultradźwiękami wstrzykiwania komórek nerwiaka zarodkowego (NB) i mięsaka Ewinga (ES) (ustalone linie komórkowe i komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta) w biologicznie istotnych miejscach do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych do badań nad rakiem.

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Udostępniamy metodę generowania, hodowli i systematycznej analizy wycinków organotypowych pochodzących z mysich guzów płuc. Opisujemy również, jak zoptymalizować grubość plastra i jak dobrać stężenia leków do leczenia plastrów guza.

Ustalenie i analiza eksplantatów plastrów guza jako warunek wstępny do badań diagnostycznych

Metoda lokalizacji immunofluorescencji in vivo (IVIL) może być użyta do badania in vivo biodystrybucji przeciwciał i koniugatów przeciwciał do celów onkologicznych w organizmach żywych przy użyciu kombinacji metod celowania w nowotwory in vivo i barwienia immunologicznego ex vivo.

Lokalizacja immunofluorescencji in vivo do oceny terapeutycznej i diagnostycznej biodystrybucji przeciwciał w badaniach nad rakiem

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalizacji in vivo przeciwciał w modelach ksenoprzeszczepów guza myszy.

Analiza rozmieszczenia nowotworów i tkanek przeciwciała terapeutycznego specyficznego dla antygenu docelowego

Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) oraz genetycznie modyfikowane modele myszy do przeszczepu wiernie odwzorowują ludzką chorobę i są preferowanymi modelami do podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem piersi. W tym miejscu opisano metodę ortotopowego przeszczepiania fragmentów guza piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka w celu zbadania biologii guza i oceny odpowiedzi na lek.

Ortotopowe przeszczepy guzów piersi jako modele przedkliniczne raka piersi

Ten artykuł opisuje metody generowania, leczenia lekami i analizy eksplantatów pochodzących od pacjentów do oceny reakcji na leki nowotworowe w żywym, istotnym dla pacjenta, przedklinicznym systemie modelowym.

Eksplantaty nowotworów pochodzące od pacjentów jako "żywa" platforma przedkliniczna do przewidywania oporności na leki u pacjentów

Poznaj metodę eksplantatów guza do testowania skuteczności leków przeciwnowotworowych na żywych tkankach chirurgicznych glejaków. Technika zachowuje mikrośrodowisko nowotworu, umożliwiając wiarygodną ocenę leków in vivo.

Metoda opracowywania nowych leków przeciwnowotworowych z wykorzystaniem eksplantatów guzów z materiału chirurgicznego

Przeglądaj więcej filmów