Name: In vivo (in vivo) Elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Naucz się elektroporacji in vivo rozwijającej się siatkówki myszy w celu wprowadzenia materiału genetycznego do komórek. Ta metoda umożliwia badania gain-of-function i loss-of-function w neuronauce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu NIH R01EY020560-01 oraz z nagrody W.M. Keck Young Scholar in Medical Research Award. Autorzy chcieliby podziękować Josephowi Bedontowi za pomoc podczas obrazowania preparatów siatkówki oraz wykonywania iniekcji.

1. Przygotowanie plazmidu do elektroporacji
Stężenie DNA wymagane do elektroporacji wynosi 5μg/μl. Zazwyczaj wymaga to amplifikacji pożądanych plazmidów przy użyciu metody Maxi-prep (Qiagen) lub równoważnej, a następnie oczyszczenia i zagęszczenia DNA do ilości roboczej. Poniższe kroki opisują przygotowanie DNA do ilości roboczej.
<ol>
<li>Odpowiedzieć 100 μg DNA (z Maxi-prep lub odpowiednika) i rozcieńczyć do objętości 100 μL w celu ułatwienia manipulacji.</li>
<li>Dodać fenol; ilość fenolu należy obliczyć tak, aby uzyskać stosunek DNA/objętość wynoszący około 60% (μg DNA:objętość całkowita), np.: 100 μg DNA (w 100 μL) plus 67 μL fenolu (100 μg:167 μL). Wymieszać dokładnie; nie pipetować w górę i w dół, ponieważ może to spowodować nadmierne ścinanie DNA.</li>
<li>Wirować DNA przez 5 minut przy 14000 RPM w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Zebrać nadsącz i dodać chloroform, stosując ten sam stosunek DNA:objętość całkowita, co w kroku 1.2; wymieszać zgodnie z opisem w kroku 1.2 i wirować przy 14000 RPM przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Zebrać nadsącz, dodać do roztworu DNA octanu sodu 3 M w ilości stanowiącej 10% objętości nadsączu, delikatnie wymieszać, a następnie dodać 100% etanol w objętości 2,5 razy większej niż objętość nadsączu. Wymieszać przez odwracanie probówki. DNA powinno wytrącić się z roztworu podczas mieszania.</li>
<li>Wirować DNA w temperaturze 4°C przez 10 minut przy 14000 RPM.</li>
<li>Przepłukać 350 μl 70% etanolu, wirować przy 14000 RPM przez 5 minut w temperaturze 4°C.</li>
<li>Osuszyć osad na powietrzu, a następnie rozpuścić DNA w 1 X PBS (klasy biologii komórki) do stężenia 5μg/μL. Nie wysuszać próbki nadmiernie, ponieważ utrudni to jej rozpuszczenie w PBS.</li>
<li>Do roztworu DNA dodać barwnik Fast Green (stok 10%) tak, aby końcowe stężenie barwnika wynosiło 0,1%, aby pełnił on rolę znacznika wstrzyknięcia.</li>
</ol>
2. Iniekcja podsiatkówkowa DNA
Następne kroki wykonuje się przy pomocy stereomikroskopu. Po przećwiczeniu proces otwierania oka, nacięcia i iniekcji zajmuje mniej niż 1,5 minuty, co jest czasem zbyt krótkim, aby prawidłowo znieczulone szczenię odzyskało przytomność. Używając ostrej igły o rozmiarze 30G, ostrożnie otwórz oko, przecinając zrośnięty nabłonek połączenia (Rys. 1C). Nie przykładaj nadmiernej siły, ponieważ może to doprowadzić do przecięcia gałki ocznej. Unikaj nacinania poza obszarem połączenia powiek, gdyż spowoduje to krwawienie, które może utrudnić wykonanie iniekcji.
<ol>
<li>Zanurzyć noworodki myszy w lodzie na kilka minut w celu znieczulenia (Rys. 1A); nie należy zakopywać młodych w lodzie, ponieważ może to doprowadzić do ich śmierci. Czas ekspozycji na lód jest zmienny dla każdego osobnika; zazwyczaj wystarcza 5 minut, jednak należy uważnie monitorować myszy, gdyż niektóre mogą zareagować bardzo szybko, a inne mogą wymagać dłuższego czasu w celu zapewnienia odpowiedniego poziomu znieczulenia. Sprawdzić odruch wycofania, wykonując ucisk łapy kleszczykami hemostatycznymi.</li>
<li>Aby umożliwić wstrzyknięcie DNA do przestrzeni podsiatkówkowej, należy najpierw otworzyć oko. Przetrzeć oko przeznaczone do iniekcji gazikiem nasączonym 70% alkoholem izopropylowym (Tyco healthcare) i zlokalizować zrośnięty nabłonek łączny w miejscu styku obu powiek (Rys. 1B).</li>
<li>Używając ostrej igły o rozmiarze 30G, ostrożnie otworzyć oko, wykonując nacięcie wzdłuż zrośniętego nabłonka łącznego (Rys. 1C). Nie należy używać nadmiernej siły, aby uniknąć przecięcia gałki ocznej. Należy unikać nacinania obszarów poza zakresem połączenia powiek, ponieważ spowoduje to krwawienie, które może utrudnić wykonanie iniekcji.</li>
<li>Aby ułatwić penetrację oka przez tępe igły do iniekcji, należy za pomocą czubka igły o rozmiarze 30G wykonać niewielkie nacięcie w twardówce w pobliżu jej połączenia z rogówką (Rys. 1E). Nie należy wprowadzać igły zbyt głęboko, aby nie przebić soczewki.</li>
<li>Pobrać 0.3 μl roztworu DNA do tępej igły do iniekcji o rozmiarze 33G, korzystając ze skali strzykawki do indywidualnego pomiaru objętości dla każdej iniekcji (średnica zewnętrzna igły 0.52 mm, średnica wewnętrzna 0.13 mm; mikrostrzykawka Exmire; Ito corp). Wprowadzić igłę do nacięcia, aż do momentu odczucia oporu przeciwległej ściany twardówki. Należy zachować ostrożność, aby nie przebić soczewki podczas przechodzenia igły przez komorę witreoidalną (Rys. 2B).</li> 
<li>Powoli wstrzyknąć 0.3 μl roztworu DNA do przestrzeni podsiatkówkowej, naciskając tłok strzykawki palcem wskazującym lub kciukiem. Eksperymentator musi precyzyjnie kontrolować szybkość dociskania tłoka, tak aby tempo wstrzykiwania roztworu DNA do przestrzeni podsiatkówkowej nie przekraczało tempa jego rozprzestrzeniania się w tej przestrzeni (Rys. 2C). Roztwór DNA jest lepki, dlatego ważne jest, aby nie dociskać igły zbyt mocno do przeciwległej ściany twardówki, gdyż może to uniemożliwić wstrzyknięcie DNA lub spowodować jego nierównomierne rozprowadzenie. Prawidłowo wykonana iniekcja skutkuje równomiernym rozprzestrzenieniem się roztworu DNA w części przestrzeni podsiatkówkowej. Podczas obracania zwierzęcia po iniekcji powinny być widoczne obszary siatkówki z zielonym znacznikiem oraz obszary go pozbawione.</li>
</ol>
3. Elektroporacja
<ol>
<li>Elektroporację przeprowadza się przy użyciu elektrody pęsetowej o średnicy 10 mm (Model #522; BTX Instruments). Elektrodę pęsetową należy namoczyć w PBS w celu zmaksymalizowania przewodnictwa elektrycznego między elektrodą a zwierzęciem, a następnie umieścić głowę wstrzykniętego szczenięcia między elektrodami tak, aby wstrzyknięte oko znajdowało się obok elektrody dodatniej, a oko niewstrzyknięte obok elektrody ujemnej (Rys. 3B).</li>
<li>Za pomocą generatora impulsów należy przyłożyć pięć impulsów prostokątnych: każdy impuls ma napięcie 80 V i czas trwania 50 ms, z odstępem 950 ms między impulsami.</li>
<li>Elektroporowane szczenięta należy teraz ogrzewać do czasu wybudzenia z anestezji lodowej. Można to zrobić, umieszczając szczenięta pod lampą grzewczą lub na podgrzewaczu do szkiełek. W przypadku korzystania z podgrzewacza do szkiełek należy upewnić się, że między metalową powierzchnią a budzącym się szczenięciem znajduje się odpowiednia podkładka. Po wybudzeniu należy zwrócić elektroporowane szczenięta matce.</li>
</ol>
4. Przygotowanie oczu do analizy
<ol>
<li>Czas pobrania i analizy elektroporowanych siatkówek zależy od celów eksperymentu. Ekspresję GFP można zwizualizować w sposób ogólny 3 dni po elektroporacji. W celu zamrożenia w medium i wykonania przekrojów należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.</li>
<li>Uśmiercić elektroporowane zwierzęta w wybranym punkcie czasowym. Wypreparować elektroporowane oko i utrwalić w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4°C przez 50 minut.</li> 
<li>Ostrożnie usunąć siatkówkę z oka poprzez mikrodysekcję twardówki, rogówki, soczewki, naczyniówki oraz nabłonka pigmentowego siatkówki. Wypreparowane siatkówki można poddać analizie fluorescencyjnej w celu ogólnego określenia wydajności elektroporacji. Przenieść siatkówki do 30% roztworu sacharozy na noc w temperaturze 4°C.</li> 
<li>Zamrozić siatkówki w medium do kriotomii O.C.T. (Sakura Finetek USA) i przechowywać w temperaturze -80°C. Siatkówki można teraz pociąć na kriotomie i nanieść na szkiełka przedmiotowe.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki: 
Przykłady siatkówek noworodków P0 poddanych elektroporacji plazmidem ekspresyjnym pCAG-EGFP przedstawiono na rysunku 4 w 3. dniu po elektroporacji (P3) oraz w 14. dniu po elektroporacji (P14). Obszar tkanki siatkówki poddanej elektroporacji jest zmienny w zależności od eksperymentu, co zależy od zakresu uszkodzeń tkanki powstałych podczas wstrzykiwania oraz równomierności rozprzestrzeniania się roztworu DNA w przestrzeni podsiatkówkowej. Zazwyczaj w 90-100% elektroporowanych siatkówek występują komórki, które skutecznie włączyły i wyekspresowały wprowadzony plazmid. Jednakże, uwzględniając morfologię tkanki i wydajność elektroporacji, tylko 40-60% elektroporowanych siatkówek nadaje się do analizy porównawczej. W miejscu penetracji igły niemal zawsze obserwuje się tworzenie rozet i odwarstwienie siatkówki; obszar ten nie powinien być wykorzystywany do analizy. Prawidłowe rozprzestrzenienie się DNA podczas mikroiniekcji skutkuje efektywną elektroporacją tkanki bocznie względem miejsca penetracji igły, która jest wolna od rozet i odwarstwień. Gliosis jest również istotnym problemem eksperymentalnym i niemal zawsze występuje w miejscu penetracji igły. Jednak, podobnie jak w przypadku tworzenia rozet i odwarstwienia siatkówki, gliosis zazwyczaj nie jest znacząca w tkance poddanej elektroporacji bocznej. Do określenia, czy poziom reaktywnej gliozy w analizowanych obszarach mieści się w dopuszczalnych progach, można wykorzystać markery immunohistochemiczne, takie jak gliałkowe kwaśne białko włókniste (GFAP). Przedstawiono przekroje siatkówek wykazujące, że morfologia elektroporowanej siatkówki pozostaje nienaruszona, a ekspresja EGFP znakuje poszczególne elektroporowane komórki. Zaprezentowano przykłady 3 dni po elektroporacji P0 (Rys. 4A-C) oraz 14 dni po elektroporacji P0 (Rys. 4D-F).
W siatkówkach P3 większość elektroporowanych komórek znajduje się w warstwie neuroblastycznej (NBL) siatkówki i nie wykazuje wyraźnych cech morfologicznych żadnej z zróżnicowanych komórek neuronalnych lub glejowych siatkówki (Ryc. 4B, C). Do P14 elektroporowane komórki można znaleźć w zewnętrznej warstwie jądrowej (ONL) oraz wewnętrznej warstwie jądrowej (INL) siatkówki. Co więcej, różne znakowane komórki wykazują obecnie charakterystyczne cechy morfologiczne zróżnicowanych neuronów, w tym interneurony INL, fotoreceptory oraz glej Müllera (Ryc. 4E, F).
<img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig1.jpg" alt="Disekcja nabłonka soczewki; powiększone widoki tkanki; mikroskopia; badanie anatomii nabłonka." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Znieczulenie noworodka (P0) myszy i otwarcie oka w celu podania podsiatkówkowego zastrzyku z roztworem DNA. A) Noworodek umieszczony na warstwie kruszonego lodu w celu znieczulenia. Oko, w które zostanie wykonany zastrzyk, jest skierowane w dół, w stronę lodu. B) Lokalizacja zrośniętego nabłonka połączeniowego (B, strzałka) powiek, które należy rozciąć w celu otwarcia oka. C) Rozcięcie powiek wzdłuż zrośniętego nabłonka połączeniowego (C, strzałka) w celu odsłonięcia oka. D) Otwarte oko po rozcięciu w miejscu zrostu. E) W twardówce oka, pod rogówką, wykonuje się nacięcie, aby ułatwić wprowadzenie tępej strzykawki do mikroiniekcji. Paski skali, B, C, D, E: 4mm.
<img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig2.jpg" alt="Edycja genów; schemat, zestaw do iniekcji w celu dostarczenia DNA do organizmu przy powiększeniu 16X." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wprowadzenie tępokątowej strzykawki do mikroiniekcji i wstrzykiwanie roztworu plazmidu DNA do przestrzeni podsiatkówkowej. A) Schemat ilustrujący prawidłowe wprowadzenie strzykawki do mikroiniekcji do oka i umieszczenie końcówki strzykawki w przestrzeni podsiatkówkowej. Wstrzyknięcie roztworu DNA do komory ciała szklistego, przejście strzykawki przez oko do oczodołu lub iniekcja do soczewki spowodują niepowodzenie eksperymentów i obecność niewielkiej liczby lub całkowity brak komórek elektroporowanych. B) Przebicie strzykawką nacięcia wykonanego w ścianie twardówki i umieszczenie końcówki strzykawki w przestrzeni podsiatkówkowej. C) Iniekcja roztworu DNA do przestrzeni podsiatkówkowej. Paski skali, B, C: 4mm. Skróty: R-siatkówka, L-soczewka, V-ciało szkliste, SrS-przestrzeń podsiatkówkowa, BES-tępokątna strzykawka.
<img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig3.jpg" alt="Schemat elektroforezy i eksperyment wstrzykiwania DNA z użyciem elektrod dodatniej/ujemnej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Orientacja elektrody pęsetowej na myszy do elektroporacji. A) Schemat ilustrujący orientację dodatniej i ujemnej łopatki elektrody pęsetowej względem oka poddanego elektroporacji. Kolor zielony oznacza miejsce wstrzyknięcia DNA do przestrzeni podsiatkówkowej. Przerywane strzałki reprezentują ruch elektroforetyczny ujemnie naładowanego wstrzykniętego DNA w kierunku elektrody dodatniej. Elektroforeza DNA zachodzi z przestrzeni podsiatkówkowej przylegającej do elektrody ujemnej w stronę siatkówki zorientowanej w kierunku elektrody dodatniej. B) Dodatnia łopatka pęsety jest umieszczona obok oka, do którego mikroiniekcyjnie podano DNA, a łopatka ujemna obok oka niepoddanego iniekcji. C) Obraz przy dużym powiększeniu pokazujący rozmieszczenie elektrody pęsetowej na noworodkowej myszy. Linie przerywane reprezentują kierunek ruchu elektroforetycznego DNA w stronę elektrody dodatniej. Pasek skali, C: 5mm.
<img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig4.jpg" alt="Ekspresja markerów komórek neuronalnych, barwienie DAPI i GFP, sekwencja mikroskopii fluorescencyjnej, warstwy siatkówki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Siatkówki noworodków myszy (P0) poddane elektroporacji pCAG-EGFP i analizowane w 3. dniu po urodzeniu (P3) oraz 14. dniu po urodzeniu (P14). A-C) Obrazy konfokalne przekroju siatkówki P3 poddanej elektroporacji pCAG-EGFP w dniu P0. Większość elektroporowanych komórek znajduje się w neuroblastycznej warstwie siatkówki (NBL). (D-F) Obrazy konfokalne przekroju siatkówki P14 poddanej elektroporacji pCAG-EGFP w dniu P0. Elektroporowane komórki można zidentyfikować w zewnętrznej warstwie jądrowej (ONL) oraz wewnętrznej warstwie jądrowej (INL) siatkówki. Paski skali, A-F: 50 μm.

<ol><li>Neumann, E., Rosenheck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+changes+induced+by+electric+impulses+in+vesicular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes.</a> J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).</li>
<li>Turnbull, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Letter%3A+Letter%3A+An+alternate+explanation+for+the+permeability+changes+induced+by+electrical+impulses+in+vesicular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes.</a> J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).</li>
<li>Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+ion+flow+in+Escherichia+coli+B+and+electrical+sizing+of+bacterias%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias.</a> Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).</li>
<li>Kinosita, K., Tsong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-induced+pore+formation+and+hemolysis+of+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparking+new+frontiers%3A+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).</li>
<li>Onishi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pias3-dependent+SUMOylation+directs+rod+photoreceptor+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pias3-dependent SUMOylation directs rod photoreceptor development.</a> Neuron. 61, 234-246 (2009).</li>
<li>Onishi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+hormone+receptor+ERRbeta+controls+rod+photoreceptor+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).</li>
<li>Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Core+Paired-Type+and+POU+Homeodomain-Containing+Transcription+Factor+Program+Drives+Retinal+Bipolar+Cell+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression.</a> J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

In vivo elektroporacja stanowi szybką i wydajną metodę transformacji komórek siatkówki za pomocą plazmidów ekspresyjnych DNA. Metoda ta pozwala badaczowi na przeprowadzenie badań nad uzyskaniem funkcji (gain of function) poprzez ektopową wprowadzenie genu zainteresowania pod kontrolą powszechnie eksponowanego promotora lub na przeprowadzenie badań nad utratą funkcji (loss of function) z wykorzystaniem konstruktów shRNA celujących w interesujące geny. Ponadto, jednocześnie można elektroporować wiele plazmidów DNA...

<table><tbody><tr><td>Fenol nasycony buforem</td><td>Invitrogen</td><td>15513-039</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>JT Baker</td><td>3470-05</td><td>stok 3 M</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP123-10</td><td>stok 10 %</td></tr><tr><td>Preparat alkoholu izopropylowego</td><td>Tyco Healthcare, Covidien</td><td>6918</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Igła 30G</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>SG2-3013</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Mikrosstrzykawka Exmire</td><td>Ito Corporation</td><td>MS*E05</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tweezertrode (elektroda szczypcowa)</td><td>BTX Technologies</td><td>522</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Electro Square Porator (elektroporator)</td><td>BTX Technologies</td><td>ECM 830</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Związek O.C.T.</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

in vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Funkcjonalna charakterystyka genów eksprymowanych podczas rozwoju siatkówki ssaków nadal stanowi istotne wyzwanie. Targetowanie genów w celu generowania konstytutywnych lub warunkowych knockoutów z utratą funkcji pozostaje kosztowne, pracochłonne oraz czasochłonne. Dodatkowo, geny eksprymowane w siatkówce mogą pełnić kluczowe role poza nią, co prowadzi do niezamierzonych czynników zakłócających przy zastosowaniu podejścia knockout. Co więcej, możliwość ektopowej ekspresji genu w eksperymencie z zyskiem funkcji może być niezwykle wartościowa przy próbie zidentyfikowania jego roli w specyfikacji losu komórek i/lub różnicowaniu końcowym.
Przedstawiamy metodę szybkiej i wydajnej inkorporacji plazmidów DNA do siatkówki noworodka myszy za pomocą elektroporacji. Przyłożenie krótkich impulsów elektrycznych o natężeniu pola powyżej określonej wartości prowadzi do przejściowego wzrostu przepuszczalności błony plazmatycznej, co ułatwia transport materiału przez błonę 1,2,3,4. Przełomowe prace wykazały, że elektroporacja może być wykorzystywana jako metoda transferu genów do komórek ssaków poprzez indukowanie powstawania hydrofilowych porów w błonie plazmatycznej, co umożliwia przejście silnie naładowanego DNA przez dwuwarstwę lipidową 5. Ciągły rozwój techniczny sprawił, że elektroporacja stała się możliwa do zastosowania jako metoda transferu genów in vivo w wielu tkankach myszy, w tym w siatkówce, a metoda ta została opisana w niniejszym opracowaniu 6, 7, 8, 9, 10.
Roztwór DNA wstrzykuje się do przestrzeni podsiatkówkowej, tak aby DNA znalazło się pomiędzy nabłonkiem barwnikowym siatkówki a siatkówką noworodka myszy (P0), a następnie przy użyciu elektrody pęsetowej aplikuje się impulsy elektryczne. Boczne rozmieszczenie oczu u myszy umożliwia łatwą orientację elektrody pęsetowej w niezbędnym układzie: biegun ujemny-DNA-siatkówka-biegun dodatni. Szeroka inkorporacja i ekspresja przetransferowanych genów mogą być zidentyfikowane do 2. dnia po urodzeniu (P2). Ze względu na brak znaczącej migracji bocznej komórek w siatkówce, powstają obszary elektroporowane i nieelektroporowane. Obszary nieelektroporowane mogą, w zależności od potrzeb, służyć jako wewnętrzne kontrole histologiczne.
Elektroporacja siatkówki może być wykorzystana do ekspresji genu pod kontrolą promotora powszechnego, takiego jak CAG, lub do zaburzenia funkcji genu przy użyciu konstruktów shRNA lub rekombinazy Cre. Bardziej ukierunkowaną ekspresję można osiągnąć, projektując konstrukty z promotorami genów specyficznymi dla danej komórki. Wizualizację elektroporowanych komórek uzyskuje się za pomocą konstruktów bicistronicznych ekspresujących GFP lub poprzez współelektroporację konstruktu ekspresyjnego GFP. Ponadto można przeprowadzić elektroporację wielu konstruktów w celu badania kombinatorycznych efektów genetycznych lub jednoczesnego uzyskania funkcji (gain of function) i utraty funkcji (loss of function) różnych genów. Elektroporacja siatkówki może być również wykorzystana do analizy genomowych elementów cis-regulatorowych poprzez tworzenie odpowiednich konstruktów ekspresyjnych i mutantów z delecjami. Takie eksperymenty mogą służyć do identyfikacji regionów cis-regulatorowych wystarczających lub niezbędnych do specyficznej dla komórki ekspresji genu 11. Potencjalne eksperymenty są ograniczone jedynie dostępnością konstruktów.

Przedstawiono metodę wprowadzania plazmidowego DNA do komórek siatkówki myszy w celu przeprowadzenia badań nad przyrostem lub utratą funkcji in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściowy wzrost przepuszczalności błon plazmatycznych komórek wywołany przyłożeniem zewnętrznego pola elektrycznego.

In vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

Funkcjonalna charakterystyka genów ekspresowanych podczas rozwoju siatkówki ssaków pozostaje istotnym wyzwaniem. Celowanie genowe w celu wygenerowania ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie eksperymentu z elektroporacją in vivo u noworodków myszy w celu stabilnego wprowadzenia materiału genetycznego do komórek siatkówki. Osiąga się to poprzez najpierw znieczulenie noworodka myszy poprzez umieszczenie go na lodzie przez około 5 do 10 minut. Drugim krokiem procedury jest zidentyfikowanie miejsca zrośnięcia powiek i otwarcie oka poprzez przecięcie wzdłuż tego połączenia.Następnie w oku wykonuje się nacięcie, aby ułatwić wprowadzenie strzykawki do mikroiniekcji. Strzykawkę do mikroiniekcji wprowadza się przez nacięcie, a roztwór DNA wstrzykuje do przestrzeni podsiatkowej. Na koniec na głowę kijowca umieszcza się elektrodę w formie pęsety i podaje serię impulsów elektrycznych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transdukcja retrowirusowa, jest fakt, że elektroporacja in vivo nie wymaga generowania i manipulowania biologicznymi wektorami jako narzędziami do dostarczania genów. W rezultacie technika ta wymaga mniej pracy i mniej odczynników, a może być przeprowadzana na dowolnym stanowisku zatwierdzonym do procedur na zwierzętach. Zazwyczaj osoby początkujące w tej technice napotykają trudności, ponieważ wypracowanie odpowiedniego wyczucia przy umieszczaniu strzykawki do mikroiniekcji w przestrzeni podsiatkowej wymaga czasu i wielokrotnych powtórzeń.Procedurę zaprezentuje Jimmy DeMilo, stażysta podoktorski w moim laboratorium. Ponieważ stężenie DNA wymagane do elektroporacji jest stosunkowo wysokie, pożądane DNA plazmidowe jest najpierw namnażane w komórkach niekompetentnych wyekstrahowanych za pomocą maxi prep, a następnie oczyszczane i zagęszczane do stężenia około 5 µg/µL. Jako znacznik wstrzyknięcia dodawany jest barwnik Fast green FCF.Po przygotowaniu plazmidowego DNA, poddaj znieczulone noworodki myszy działaniu lodu przez około pięć minut, monitorując je aż do potwierdzenia utraty przytomności poprzez ucisk poduszki stopy. Przetrzyj obszar oka, w który będzie wstrzykiwany preparat, 70% alkoholem izopropylowym i za pomocą mikroskopu stereoskopowego zlokalizuj zespisany nabłonek spojówkowy w miejscu styku powiek. Używając ostrej igły o rozmiarze 30 G, ostrożnie otwórz oko, przecinając zespisany nabłonek spojówkowy, nie wywierając nadmiernego nacisku w dół i nie przecinając tkanek poza obszarem powieki.Po otwarciu powieki i odsłonięciu oka, należy za pomocą końcówki igły wykonać niewielkie nacięcie w twardówce, w pobliżu miejsca jej połączenia z rogówką, uważając, aby nie wprowadzić się zbyt głęboko i nie przebić soczewki. Do nacięcia należy wprowadzić igłę do wstrzykiwania z tępym zakończeniem. Następnie powoli wstrzyknąć 0,3 µl lepkej roztworu DNA do przestrzeni podsiatkówkowej, aż do momentu wyczucia oporu przeciwległej ściany twardówki.Uważając, aby nie naciskać zbyt mocno ścian twardówki, obróć zwierzę, aby sprawdzić, czy roztwór DNA rozprzestrzenił się równomiernie w obrębie siatkówki. Najpierw zanurz elektrodę pęsetową w PBS, aby zmaksymalizować przewodnictwo elektryczne. Następnie umieść głowę wstrzykniętego szczenięcia pomiędzy elektrodami tak, aby oko po wstrzyknięciu znajdowało się przy elektrodzie dodatniej, a oko niewstrzyknięte przy elektrodzie ujemnej.Wykonaj pięć impulsów prostokątnych za pomocą generatora impulsów, przy czym każdy impuls powinien mieć wartość 80 V i czas trwania 50 ms, z odstępem 950 ms między impulsami. Na koniec ogrzej młode pod lampą grzewczą, aż dojdą do siebie po znieczuleniu lodem. Po wybudzeniu zwróć elektroporowane młode do matki w trzecim dniu po urodzeniu.Większość elektroporowanych komórek EGFP znajduje się w warstwie neuroplastycznej siatkówki i nie wykazuje wyraźnych cech morfologicznych żadnej z zróżnicowanych komórek glejowych siatkówki. Do 14. dnia po urodzeniu elektroporowane komórki można znaleźć w zewnętrznej warstwie jądrowej oraz w wewnętrznej warstwie jądrowej siatkówki, a poszczególne oznakowane komórki wykazują już charakterystyczne cechy morfologiczne zróżnicowanych neuronów.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wszystkie kroki realizować płynnie i jednostajnie. Podczas mikrowstrzykiwania bardzo łatwo jest uszkodzić siatkówki, dlatego niezbędna jest praktyka w celu wypracowania zręczności manualnej koniecznej do uniknięcia uszkodzenia tkanek. Postępuj zgodnie z poniższą procedurą.W celu ustalenia, czy ekspresja interesujących genów w siatkówce oka jest zwiększona czy zmniejszona, można zastosować inne metody, takie jak immunohistochemia lub hybrydyzacja in situ.

in-vivo-electroporation-of-developing-mouse-retina

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki manipulowania ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs) myszy za pomocą elektroporacji in utero oraz ex vivo. Techniki te pozwalają badać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na rozwój RGCs, prowadzenie aksonów oraz właściwości funkcjonalne.

Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Prezentujemy protokół elektroporacji in vivo do transfekcji pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz innych typów komórek siatkówki u myszy postnatalnych w szerokim zakresie wieku. Zdolność do znakowania i genetycznej manipulacji postnatalnymi RGCs in vivo stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rozwojem.

Transfekcja komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Niniejszy protokół opisuje prostą i niedrogą metodę ilościowego określania aktywności elementów cis-regulatorowych (tj. enhancerów/promotorów) w żywych siatkówkach myszy za pomocą elektroporacji eksplantów. Opisano przygotowanie DNA, wycięcie siatkówki, elektroporację, hodowlę eksplantów siatkówki oraz analizę i kwantyfikację po utrwaleniu.

Ilościowe określenie aktywności elementów regulacyjnych cis w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantatu

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Opisano metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego w siatkówce dorosłego danio-zebry, która polega na dokonywaniu iniekcji domięśniowych morfolino antysensownych oraz ich elektroporacji do siatkówki. W wyniku tego procesu ekspresja białka jest wyciszona przez kilka dni, co umożliwia zbadanie roli tego białka w regenerującej się lub nienaruszonej siatkówce.

In vivo elektroporacja morfolin do siatkówki dorosłego danio pręgowanego

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację konstruktów DNA/RNA in ovo do siatkówki zarodka kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Technika ta jest bardzo użyteczna w badaniu ekspresji genów, regulacji genów oraz zmian morfologicznych w rozwijającej się siatkówce kurczaka.

Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

Niniejsza praca opisuje opracowanie techniki elektroporacji in vitro, która umożliwia manipulację ekspresją genów w dolnej części wargi rombowej embrionów w połowie okresu gestacji.

In vitro elektroporacja dolnej wargi rombowej zarodków myszy w połowie okresu gestacji

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Ta procedura pokazuje, jak celować w interneurony w rozwijającym się przodomózgowiu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Technika ta okazała się szczególnie skuteczna w osiąganiu selektywnej ekspresji genów w podtypach interneuronów przeznaczonych do powierzchownych warstw kory mózgowej.

Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych

Ten protokół opisuje metodę preparowania, eksperymentalnego manipulowania i hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka. Kultury eksplantatów są przydatne, gdy potrzebny jest wysoki wskaźnik sukcesu, skuteczność i odtwarzalność w celu przetestowania wpływu plazmidów na elektroporację i/lub substancje odczynnikowe, tj. inhibitory enzymatyczne.

Całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi

Naucz się elektroporacji in vivo rozwijającej się siatkówki myszy w celu wprowadzenia materiału genetycznego do komórek. Ta metoda umożliwia badania gain-of-function i loss-of-function w neuronauce.

In vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

Przeglądaj więcej filmów