In vivo (in vivo) Elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

Przedstawiono metodę inkorporacji plazmidowego DNA do mysich komórek siatkówki w celu przeprowadzenia badań nad zyskiem lub utratą funkcji in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściowy wzrost przepuszczalności błon plazmatycznych komórek wywołany zastosowaniem zewnętrznego pola elektrycznego.

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie eksperymentu elektroporacji in vivo na nowonarodzonych myszach w celu stabilnego wprowadzenia materiału genetycznego do komórek siatkówki. Osiąga się to poprzez pierwsze znieczulenie, nowonarodzoną mysz wyskakują na lód na około pięć do 10 minut. Drugim krokiem zabiegu jest zidentyfikowanie połączenia zrośniętych powiek i otwarcie oka poprzez przecięcie wzdłuż tego połączenia.

Następnie wykonuje się nacięcie w oku, aby ułatwić wprowadzenie strzykawki do mikroiniekcji. Strzykawka do mikroiniekcji jest następnie wprowadzana przez nacięcie, a roztwór DNA wstrzykiwany jest do przestrzeni podsiatkówkowej. Na koniec na głowie popa umieszcza się elektrodę pęsety i dostarczana jest seria impulsów elektrycznych.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak transdukcja retrowirusowa, jest to, że elektroporacja in vivo nie wymaga wytwarzania i obchodzenia się z czynnikami biologicznymi jako narzędziami do dostarczania genów. W rezultacie technika wymaga mniej pracy, mniej odczynników i może być przeprowadzana na dowolnym stanowisku roboczym zatwierdzonym do procedur na zwierzętach. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej technice będą miały trudności, ponieważ potrzeba czasu i powtórzeń, aby wyczuć umieszczanie strzykawki do mikroiniekcji w przestrzeni podsiatkówkowej.

Procedurę zademonstruje Jimmy DeMilo, doktor habilitowany w moim laboratorium. Ponieważ stężenie DNA wymagane do elektroporacji jest stosunkowo wysokie, pożądane plazmidowe DNA jest najpierw amplifikowane niekompetentne komórki ekstrahowane przy użyciu maxi prep, a następnie oczyszczane i zagęszczane do około pięciu mikrogramów na mikrolitr. Szybki zielony barwnik FCF jest dodawany jako znacznik iniekcyjny.

Po przygotowaniu plazmidowego DNA, znieczulanie nowonarodzonych szczeniąt myszy na lodzie przez około pięć minut, monitorując je do momentu potwierdzenia utraty przytomności przez ucisk opuszki stopy. Zamień obszar oka, który ma zostać wstrzyknięty, 70% alkoholem o profilu isop i użyj mikroskopu preparacyjnego, aby zidentyfikować nabłonek połączeniowy FUS, w którym spotykają się powieki. Za pomocą ostrej igły o rozmiarze 30 ostrożnie otwórz oko, przecinając wzdłuż stopionego nabłonka połączeniowego, nie wywierając nadmiernego nacisku w dół ani nie wycinając poza zakres powieki.

Po otwarciu powieki i odsłonięciu oka użyj końcówki igły, aby wykonać małe nacięcie w twardówce w pobliżu połączenia z rogówką, uważając, aby nie wniknąć zbyt głęboko i nie przebić soczewki. Wprowadzić tępo zakończoną igłę do wstrzykiwań w nacięcie. Tylko do momentu, gdy opór przeciwległej ściany twardówki zostanie wyczuwalny, powoli wstrzyknij 0,3 mikrolitra lepkiego roztworu DNA do przestrzeni podsiatkówkowej.

Uważając, aby nie naciskać zbyt mocno na ścianę twardówki, obróć zwierzę, aby sprawdzić, czy roztwór DNA jest równomiernie rozłożony w siatkówce. Najpierw zanurz elektrodę pęsety w PBS, aby zmaksymalizować przewodność elektryczną. Następnie umieść głowę wstrzykniętego szczeniaka między elektrodami, tak aby wstrzyknięte oko przylegało do elektrody z biegunem dodatnim, a oko bez wstrzyknięcia przylegało do elektrody z biegunem ujemnym.

Zastosuj pięć impulsów kwadratowych za pomocą generatora impulsów, z których każdy ma napięcie 80 woltów i trwa 50 milisekund z 950-milisekundowym odstępem między impulsami. Na koniec ogrzej szczenięta pod rozgrzewającą lampą, aż dojdą do siebie po znieczuleniu lodem. Po wyzdrowieniu należy zwrócić wysterylizowane elektrycznie młode matce w trzecim dniu po urodzeniu.

Większość komórek elektroporowanych EGFP znajduje się w warstwie neuroplastycznej siatkówki i nie wykazuje wyraźnych cech morfologicznych żadnej ze zróżnicowanych nerwowych komórek glejowych siatkówki. Do 14 dnia po urodzeniu elektroporowane komórki można znaleźć w zewnętrznej warstwie jądrowej i wewnętrznej warstwie jądrowej siatkówki oraz w różnych znakowanych komórkach. Teraz wykazują charakterystyczne cechy morfologiczne zróżnicowanych neuronów.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wykonać wszystkie kroki płynnie i równomiernie. Bardzo łatwo jest uszkodzić siatkówkę podczas mikroiniekcji, a praktyki wymagane są do rozwinięcia zręczności manualnej potrzebnej do uniknięcia uszkodzenia tkanek. Postępując zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak immunohistochemia lub hybrydyzacja in situ, mogą być wykonane w celu określenia, czy ekspresja genów będących przedmiotem zainteresowania jest regulowana w górę czy w dół w elektrosiatkówkach.