Mikroskopia poklatkowa wczesnej embriogenezy u Caenorhabditis elegans
August 25th, 2011
Ten artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych wydarzeń embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zarejestrowanie zdarzeń subkomórkowych podczas wczesnej embriogenezy elegancji Insino Ratu. Osiąga się to dzięki zastosowaniu szczepów transgenicznych z wieloma białkami znakowanymi fluorescencyjnie, które umożliwiają wizualizację DNA, a także podzbiorów pęcherzyków We wczesnym zarodku określone organelle są znakowane przez mikrowstrzyknięcie barwników fluorescencyjnych, takich jak Lyo tracker lub MIT tracker do gonady dorosłego robaka. Następnie zarodki są wycinane z dorosłych robaków i obserwowane pod mikroskopem konfokalnym w celu uzyskania poklatkowych zapisów ruchów znakowanych białek w organellach.
Ostatecznie protokół ujawnia interesujący ruch lizosomów i pęcherzyków znakowanych GFP podczas wczesnego rozwoju alerganów CL. Nazywam się Connie Hedger i dzisiaj pokażę wam, jak wykonujemy mikroskopię poklatkową w naszym laboratorium, laboratorium Boyda na Uniwersytecie Alabama w Huntsville. W tym eksperymencie nicienie gro nebra na płytkach rolniczych NGM, osadzone na trawniku bakteryjnym OP 50 w temperaturze 25 stopni Celsjusza dzień przed eksperymentem, wybierają co najmniej 40 litrowe cztery larwy na siedzące płytki i inkubują je przez noc w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
Te robaki będą młodymi dorosłymi. Do eksperymentu. Przygotuj podkładkę do wstrzykiwań, umieszczając dwie krople 2%aros w wodzie z poprzedniej pipety między dwoma szkiełkami ze szkła nakrywkowego i wywierając nacisk, aby uformować agros w okrąg o średnicy 1,5 centymetra.
Zdejmij górną szkiełko nakrywkowe i osusz podkładkę, umieszczając ją w piekarniku o temperaturze 80 stopni Celsjusza na godzinę lub pozostaw na noc na blacie. W dniu wstrzyknięcia należy przygotować rozcieńczony roztwór barwnika MIT tracker lub lyo tracker i wyciągnąć igły do wstrzykiwań ze szklanej kapilary o średnicy 1,2 od. Napełnij igły rozcieńczonym roztworem barwnika i przechowuj je w ciemnej, nawilżonej komorze zamontuj igłę iniekcyjną na mikromanipulatorze i podłącz igłę do regulatora ciśnienia z rurką o średnicy wewnętrznej 1,2 milimetra.
Teraz umieścić dwie krople ciężkiego oleju mineralnego na końcówce iniekcyjnej. Umieścić końcówkę iniekcyjną na mikroskopie i zanurzyć igłę w oleju. Zastosować ciśnienie iniekcji i obserwować, czy płyn wypływa z igły.
W przeciwnym razie należy delikatnie złamać końcówkę igły, delikatnie wbijając końcówkę w niewielki kawałek potłuczonego szkła nakrywkowego umieszczonego na końcówce iniekcyjnej. Po tym, jak igła zacznie płynąć, należy przystąpić do wstrzyknięcia na godzinę przed oglądaniem zarodków. Za pomocą zdjęcia przenieś młode dorosłe robaki do kropli oleju na podkładce iniekcyjnej.
Ułóż od trzech do 10 robaków równolegle i nieco mniej niż jedną długość robaka od siebie. Teraz ważne jest, aby szybko wstrzyknąć robaki, zanim robaki wyschną. Przenieś podkładkę z robakami na stolik mikroskopu.
Skoncentruj się na centralnej części dystalnej gonady. Następnie za pomocą mikromanipulatora przesuń końcówkę igły w tę samą płaszczyznę ogniskowej. Nakłuj robaka, przesuwając stolik w poziomie.
Gdy końcówka igły znajdzie się w kuźni, zastosuj nacisk, aby wypełnić gonadę mieszanką barwników. Gonada rozszerza się wraz z objętością wstrzyknięcia. Kontynuować wstrzykiwanie.
Oba przechodzą przez ramiona sieciowe każdego robaka po wstrzyknięciu. Przykryj robaki nałożonymi 0,5 mililitra buforu do jaj. Za pomocą wyciągniętej pipety pastwiskowej pozwól robakom zregenerować się przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej w lekko nawilżonej komorze.
Zacznij od przygotowania nowej podkładki agros do oglądania wstrzykniętych zarodków za pomocą poprzedniej pipety. Umieść trzy krople stopionego agros na czystym szkiełku mikroskopowym i umieść to szkiełko między dwoma innymi szkiełkami owiniętymi jedną warstwą etykiety. Taśma taśma kontroluje grubość podkładki.
Następnie dociśnij czysty szkiełko mikroskopowe w dół do kropli agros, tak aby spoczywało na szkiełkach taśmy. Nie zdejmuj górnego szkiełka, dopóki zarodki nie będą gotowe do zamontowania. Teraz upuść 20 mikrolitrów buforu jajowego na środek szkła nakrywkowego i przenieś wstrzyknięte robaki do buforu Pod mikroskopem preparacyjnym rozetnij robaki w pobliżu sromu.
Za pomocą igły podskórnej o rozmiarze 26 zarodki wyleją się z robaka. Teraz zdejmij górny szkiełko do obrazowania i opuść podkładkę aros do góry nogami na szkło nakrywkowe z zarodkami. Jeśli zarodki będą obrazowane przez dłuższy czas, należy uszczelnić krawędzie szkła nakrywkowego wazeliną, aby zapobiec wysuszeniu.
Teraz rozpocznij obrazowanie od zlokalizowania zarodków w ramach celu 10 x, aby znaleźć zarodki we wczesnym stadium, poszukać zarodków, które są w trakcie kończenia mejozy matczynej. Zarodki miotyczne można odróżnić od późniejszych zarodków, ponieważ nie uległy skróceniu. Po zakończeniu mejozy istnieje znaczna przerwa między błoną komórkową a skorupką jaja na przednim końcu zarodka.
Po zidentyfikowaniu odpowiednio zaawansowanego zarodka należy przenieść go do soczewki o większym powiększeniu w celu zarejestrowania embriogenezy. Ten zarodek wykazuje ekspresję zarówno białek znakowanych ubikwityną M wiśni, histonu wiśniowego, dwóch, B, jak i GFP. DNA matki i ojca jest widoczne przez M cherry H dwa B, a tym samym pokazuje etapy wczesnego rozwoju.
Temu zarodkowi wstrzyknięto niebieski OC Tracker, w którym występuje ekspresja ubikwityny GFP. Obrazy zostały zebrane za pomocą obiektywu 63 x 1,4 NA z 4 laserami 88 i 5 5 55 ustawionymi na minimalną moc i maksymalne wzmocnienie. Zazwyczaj Zacks są zbierane co 10 do 15 sekund przez maksymalnie 60 punktów czasowych, zanim nastąpi fotowybielanie.
W tym filmie poklatkowym stosy Z zostały zwinięte do maksymalnych obrazów projekcyjnych podczas wykonywania filmu poklatkowego. Zarodki pod mikroskopem powinny rozpocząć migrację przedjądrową w ciągu kilku minut od zakończenia miozy drugiej i w ciągu 20 minut. Powinna rozpocząć się pierwsza cytokineza.
Jeśli zauważysz zahamowanie rozwoju swoich zarodków, spróbuj zmniejszyć intensywność lasera lub użyj grubszej podkładki wróżbiącej.
Przegląd
Ten artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych zdarzeń embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans. Metoda wykorzystuje szczepy transgeniczne z białkami oznaczonymi fluorescencyjnie, aby obserwować dynamikę subkomórkową.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Embriologia
- Biologia komórki
Tło
- Zrozumienie wczesnej embriogenezy jest kluczowe dla biologii rozwoju.
- Oznaczanie fluorescencyjne umożliwia wizualizację procesów komórkowych w czasie rzeczywistym.
- Caenorhabditis elegans służy jako organizm modelowy ze względu na swoją prostotę i przejrzystość.
- Mikroskopia time-lapse zapewnia wgląd w ruchy komórkowe podczas rozwoju.
Cel badania
- Zapisywanie zdarzeń subkomórkowych w czasie wczesnej embriogenezy.
- Wizualizacja dynamiki organelli i wezykuł w rozwijających się zarodkach.
- Poprawa rozumienia ruchów lizosomowe i wezykularne we wczesnym rozwoju.
Stosowane metody
- Mikrowstrzyknięcie barwników fluorescencyjnych do gonady dorosłych robaków.
- Zdjęcia time-lapse przy użyciu mikroskopu konfokalnego.
- Przygotowanie szczepów transgenicznych wytwarzających białka fluorescencyjne.
- Obserwacja zarodków na różnych etapach rozwoju.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja dynamiki DNA i organelli podczas wczesnej embriogenezy.
- Identyfikacja kluczowych etapów rozwoju zarodkowego, w tym migracji jąder i cytokineza.
- Wgląd w zachowanie lizosomowe i oznaczonych wezykuł podczas wczesnego rozwoju.
- Demonstracja skutecznych technik mikroskopi time-lapse w żywych zarodkach.
Wnioski
- Badanie dostarcza wartościowego protokołu do obserwacji embriogenezy u C. elegans.
- Techniki oznaczania fluorescencyjnego są skuteczne w śledzeniu procesów komórkowych.
- Wyniki przyczyniają się do szerszej wiedzy na temat biologii rozwoju.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-resolution time-lapse microscopy in Caenorhabditis elegans enables direct visualization of subcellular dynamics during early embryogenesis, supporting mechanistic de-risking in discovery-stage research. This approach provides predictive confidence for target validation and pathway interrogation by allowing real-time tracking of organelle and protein localization. The methodology is strategically positioned for early discovery and assay development pipelines where functional validation and quantitative imaging are critical.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of protein and organelle dynamics in a genetically tractable model.
- Supports functional target validation by visualizing subcellular events in real time.
- Facilitates mechanistic de-risking through quantitative imaging of developmental processes.
- Provides predictive confidence for pathway and target interrogation in early discovery.
Screening & Assay Development
- Establishes validated imaging assays for quantifying protein localization and organelle behavior.
- Supports reproducible and standardized workflows for fluorescently tagged protein analysis.
- Enables preparation of robust biological systems for downstream screening applications.
- Delivers quantitative outputs suitable for comparative analysis across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanistic studies by modeling conserved developmental pathways.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation via quantitative imaging readouts.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying subcellular mechanisms in vivo.
- Offers predictive de-risking for translational biomarker identification when supported by imaging data.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging methodology integrates into the early discovery-to-lead identification continuum, enabling hypothesis testing and pathway clarification in live embryos.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of protein and organelle dynamics during embryogenesis.
- Screening: Provides standardized, reproducible imaging assays for quantitative analysis of fluorescently labeled targets.
- Analytics: Delivers high-content imaging data for statistical comparison of developmental phenotypes.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights from model systems to preclinical validation when imaging outputs align with disease pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse protein and organelle tracking studies in early development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by clarifying early developmental mechanisms.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and pathways for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and microinjection techniques.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and fluorescent labeling reagents.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis workflows.
- May require adaptation for different model systems or protein targets.
- Photobleaching and embryo viability are practical limitations that must be managed during imaging.
