Name: Mikroskopia poklatkowa wczesnej embriogenezy u Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-25T12:03:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj mikroskopię poklatkową wczesnej embriogenezy u Caenorhabditis elegans. Ta metoda wykorzystuje transgeniczne szczepy z fluorescencyjnie znakowanymi białkami do wizualizacji dynamiki organelli i DNA w żywych zarodkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować za finansowanie z National Institutes of Health (R15 GM065444-03 dla L.B.), Intramural Research Program of the National Institutes of Health (NIH) oraz National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (K. O.). Grant z NSF (DBI-0923402) sfinansował zakup mikroskopu konfokalnego LSM700. Chcielibyśmy również podziękować dr. Andy’emu Goldenowi za ogólną pomoc i pomocne uwagi do manuskryptu. Wyrazy wdzięczności kierujemy do całej społeczności badawczej C. elegans za udostępnianie zasobów, protokołów i pomysłów.

1. Hodowle nicieni
<ol>
	<li>Pozyskaj odpowiedni szczep C. elegans z Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) lub od współpracownika.</li>
	<li>Hoduj nicienie na płytkach z agarem NGM zaszczepionych trawnikiem bakteryjnym OP50 (3). W przypadku analizy szczepów GFP zaleca się wzrost w temperaturze 25°C.</li>
	<li>Dzień przed eksperymentem mikroskopowym przenieś co najmniej 40 larw w stadium L4 na zaszczepione płytki i inkubuj je w temperaturze 25°C przez noc. Nicienie te będą w stadium młodych dorosłych w momencie przeprowadzenia eksperymentu.</li>
</ol>
2. Iniekcje
Jeśli pożądana jest wizualizacja struktur takich jak lizosomy lub mitochondria, osobnikom dorosłym można wstrzyknąć barwnik fluorescencyjny przed przystąpieniem do obrazowania.
<ol>
	<li>Przygotuj wysuszone podkładki agarozowe do iniekcji. (można to zrobić od jednego do wielu dni wcześniej)
		<ol>
			<li>Przygotuj stopioną 2% agarozę w wodzie. Za pomocą pipety Pasteura nanieś 2 krople na szkiełko nakrywowe o wymiarach 2X54 mm. Połóż drugie szkiełko nakrywowe na krzyż na kropli. Aby uzyskać odpowiednią grubość, naciśnij górne szkiełko, aż średnica podkładki wyniesie około 1,5 cm. Pozostaw na 5-10 minut.</li>
			<li>Usuń górne szkiełko nakrywowe. Odwodnij podkładkę agarozową, umieszczając ją w piecu w temperaturze 80°C przez 1 godzinę lub pozostawiając na blacie na noc.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór Mitotrackera lub Lysotrackera.
		<ol>
			<li>Rozcieńcz czynnik fluorescencyjny w buforze do jaj (Egg Buffer). Zazwyczaj stosujemy rozcieńczenie Mitotrackera lub Lysotrackera w stosunku 1:10.</li>
			<li>Igła do iniekcji jest wykonana z kapilary szklanej o średnicy zewnętrznej (OD) 1,2. Wyciągnij igłę do iniekcji za pomocą wyciągacza igieł.</li>
			<li>Użyj wyciągniętej pipety Pasteura, aby napełnić igłę od tyłu rozcieńczonym barwnikiem.</li>
			<li>Umieść igłę w komorze wilgotnościowej, chronionej przed światłem, do momentu użycia.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Przed iniekcją: Konfiguracja mikroskopu i igły.
		<ol>
			<li>Zamocuj igłę do iniekcji w aparacie do iniekcji. Nasz aparat to mikromanipulator z bezpośrednim napędem firmy Narishige, zamontowany na stoliku odwróconego mikroskopu Nikon TE200 wyposażonego w system obrazowania DIC.</li>
			<li>Połącz igłę z rurką o średnicy wewnętrznej (ID) 1,2 mm, która jest podłączona do regulatora ciśnienia. Jako zewnętrzne źródło ciśnienia można zastosować sprężone powietrze lub azot. Ustaw regulator na 20-25 psi.</li>
			<li>Nanieś 2 krople ciężkiego oleju mineralnego (oleju parafinowego) na podkładkę do iniekcji.</li>
			<li>Umieść podkładkę do iniekcji na mikroskopie i opuść igłę do oleju. Sprawdź, czy ciecz swobodnie wypływa z igły po przyłożeniu ciśnienia. Przyłóż ciśnienie wtryskowe i zaobserwuj, czy ciecz wypływa z igły. Jeśli nie, należy delikatnie złamać końcówkę igły. Można to zrobić, delikatnie wbijając końcówkę w mały kawałek rozbitego szkiełka nakrywowego umieszczonego na podkładce do iniekcji. Gdy ciecz zacznie wypływać, przejdź do następnego kroku.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja.
		<ol>
			<li>Około 1 godziny przed obserwacją embrionów przenieś młode dorosłe nicienie do kropli oleju na podkładce do iniekcji. Wykonaj ten transfer za pomocą mikroskopu stereotypowego. Do przenoszenia nicieni używaj platynowego drutu z zaostrzoną końcówką.</li>
			<li>Ułóż od 3 do 10 nicieni tak, aby leżały bezpośrednio na podkładce. Dla ułatwienia iniekcji najlepiej ustawić nicienie równolegle do siebie, w odległości nieco mniejszej niż długość jednego nicienia. Po umieszczeniu nicieni na podkładce ważne jest, aby pracować szybko i zakończyć proces iniekcji, zanim nicienie zginą z powodu odwodnienia.</li>
			<li>Umieść szkiełko nakrywowe z nicieniami na stoliku mikroskopu do iniekcji. Ustaw ostrość na część centralną (rachis) dystalnej części przewodu gonadnego. Następnie za pomocą mikromanipulatora przesuń końcówkę igły do tej samej płaszczyzny ogniskowania. Przesuń stolik poziomo tak, aby igła przebiła nicienia. Gdy końcówka igły znajdzie się wewnątrz rachis, przyłóż ciśnienie i pozwól, aby gonada wypełniła się mieszaniną barwnika. Wykonaj iniekcję w oba ramiona gonady u wszystkich nicieni na podkładce.</li>
			<li>Po iniekcji użyj wyciągniętej pipety Pasteura, aby dostarczyć nicieniom około 0,5 ml buforu do jaj (Egg Buffer). Zapobiegnie to ich śmierci z odwodnienia i pozwoli na regenerację po procedurze iniekcji.</li>
			<li>Pozostaw nicienie do regeneracji na 1-2 godziny w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej, chronionej przed światłem.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
3. Podkładka agarozowa do obserwacji zarodków
<ol>
	<li>Przygotować stopioną 2% agarozę w buforze jajecznym (Egg Buffer).</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura nanieść 3 krople stopionej agarozy na czyste szkiełko mikroskopowe.</li>
	<li>Umieścić szkiełko pomiędzy dwoma innymi szkiełkami, które są oklejone jedną warstwą taśmy opisowej. Służą one jako dystansory, które zapewnią odpowiednią grubość podkładki agarowej.</li>
	<li>Położyć drugie czyste szkiełko mikroskopowe prostopadle na kroplach agarozy. Docisnąć, aż górne szkiełko oprze się na taśmie szkiełek prowadzących.</li>
	<li>Bezpośrednio przed przystąpieniem do montażu embrionów do obserwacji, zdjąć górne szkiełko.</li>
</ol>
4. Montaż zarodków do obserwacji
<ol>
	<li>Jeśli nicienie nie zostały poddane iniekcji, należy wykonać dwa następne kroki. W przeciwnym razie należy je pominąć.
		<ol>
			<li>Wybierz młode dorosłe nicienie z płytki przygotowanej dzień wcześniej. Wewnątrz młodych osobników powinny być widoczne embriony.</li>
			<li>Przenieś 5-20 nicieni na nieobsianą płytkę NGM. Pozostaw nicienie na kilka minut na nieobsianej płytce, aby pozbyły się większości przywierających do nich bakterii.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Pozyskiwanie młodych embrionów z dorosłych nicieni
		<ol>
			<li>Nanieś kroplę 5-20 μl buforu do jaj (Egg Buffer) na środek szkiełka podstawowego o wymiarach 18 mm2 (preferowana grubość szkiełka to 1,5).</li>
			<li>Przenieś nicienie z nieobsianej płytki lub podkładki do iniekcji do kropli buforu do jaj.</li>
			<li>Rozetnij nicienie za pomocą igły hipodermicznej o rozmiarze 26 gauge. Rozetnij nicienia w pobliżu wulwy. Powinno dojść do wydostania się embrionów z organizmu nicienia.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Montowanie na szkiełku mikroskopowym
		<ol>
			<li>Odwróć szkiełko mikroskopowe z przygotowaną podkładką agarozową i opuść je na szkiełko nakrywkę z embrionami.</li>
			<li>W przypadku konieczności wykonania długotrwałego time-lapse, użyj wazeliny do uszczelnienia krawędzi szkiełka nakrywki, aby zapobiec wysychaniu.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
5. Mikroskopia
<ol>
	<li>Wyszukanie odpowiednich embrionów.
		<ol>
			<li>Umieść preparat na stoliku mikroskopu. Przeskanuj go obiektywem 10X, aby zlokalizować embriony.</li>
			<li>Aby znaleźć embriony we wczesnym stadium, szukaj tych, które są w procesie kończenia mejozy macierzystej. Embriony meiotyczne można odróżnić od późniejszych stadiów po tym, że nie uległy one jeszcze skróceniu. (Po zakończeniu mejozy w embrionach widoczna jest znaczna przerwa między błoną komórkową a skorupką jaja na końcu przednim).</li>
			<li>Po zidentyfikowaniu embrionu w odpowiednim stadium, przejdź na obiektyw o większym powiększeniu w celu rejestracji embriogenezy.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie
		<ol>
			<li>W tym przykładzie obrazujemy embriony wykazujące ekspresję białek znakowanych mCherry::H2B oraz GFP::Ub. Używamy konwencjonalnego skaningowego mikroskopu laserowego Zeiss LSM70.</li>
			<li>Obrazy są zbierane przy użyciu obiektywu 63X 1.4NA. Lasery 48 i 5 są wykorzystywane przy minimalnej mocy lasera i maksymalnym wzmocnieniu. Seria obrazów Z-stack jest zbierana co 10-15 sekund. W zależności od stopnia fotoblaknięcia zbiera się od 30 do 60 punktów czasowych. Obrazy Z-stack są łączone w obraz projekcji maksymalnej do końcowego filmu time-lapse.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig1.jpg" alt="Schemat procesu mejozy; fazy z wynikami mikroskopii fluorescencyjnej mCherry H2B oraz GFP Ubiquitin." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Od zapłodnienia do pierwszej mitozy w C. elegans.
<img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig2.jpg" alt="Proces wstrzykiwania do gonad, obrazy mikroskopowe: widok powierzchniowy, rachis, wprowadzenie igły, wynik po wstrzyknięciu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Procedura mikrowstrzykiwania.
Wideo dodatkowe 1. Film poklatkowy z obrazowaniem GFP:ubiquitin oraz Lysotracker Blue w embrionie meiotycznym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2852/2852fig3.avi">Kliknij tutaj, aby wyświetlić wideo.</a>

<ol><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833-e833 (2008).</li>
<li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Transgenic+C.+elegans+by+Biolistic+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation.</a> J Vis Exp. (42), e2090-e2090 (2010).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetics+of+Caenrohabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Genetics of Caenrohabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Cell division WormBook. Oegema, K., Hyman, A. A. , WormBook. (2006).</li>
<li>McNally, K. L., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+initiates+the+transition+from+anaphase+I+to+metaphase+II+during+female+meiosis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fertilization initiates the transition from anaphase I to metaphase II during female meiosis in C. elegans.</a> Dev Biol. 282, 218-230 (2005).</li>
<li>Sato, K., Sato, M., Audhya, A., Oegema, K., Schweinsberg, P., Grant, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+caveolin-1+trafficking+in+the+germ+line+and+embryo+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of caveolin-1 trafficking in the germ line and embryo of Caenorhabditis elegans.</a> Mol Biol Cell. 17, 3085-3094 (2006).</li>
<li>Stitzel, M. L., Pellettieri, J., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+DYRK+Kinase+MBK-2+Marks+Oocyte+Proteins+for+Degradation+in+Response+to+Meiotic+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The C. elegans DYRK Kinase MBK-2 Marks Oocyte Proteins for Degradation in Response to Meiotic Maturation.</a> Curr Biol. 16, 56-62 (2006).</li>
<li>Schetter, A., Askjaer, P., Piano, F., Mattaj, I., Kemphues, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoporins+NPP-1%2C+NPP-3%2C+NPP-4%2C+NPP-11+and+NPP-13+are+required+for+proper+spindle+orientation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleoporins NPP-1, NPP-3, NPP-4, NPP-11 and NPP-13 are required for proper spindle orientation in C. elegans.</a> Dev. Biol. 289, 360-371 (2006).</li>
<li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1, (2001).</li>
<li>Badrinath, A. S., White, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+patterns+of+mitochondrial+redistribution+in+the+early+lineages+of+Caenorhabditis+elegans+and+Acrobeloides+sp.+PS1146%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Contrasting patterns of mitochondrial redistribution in the early lineages of Caenorhabditis elegans and Acrobeloides sp. PS1146.</a> Dev. Biol. 258, 270-275 (2003).</li>
<li>Johnston, W. L., Krizus, A., Dennis, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eggshell+is+required+for+meiotic+fidelity%2C+polar-body+extrusion+and+polarization+of+the+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The eggshell is required for meiotic fidelity, polar-body extrusion and polarization of the C. elegans embryo.</a> BMC Biol. 4, 35-35 (2006).</li>
<li>Parry, J. M., Velarde, N. V., Lefkovith, A. J., Zegarek, M. H., Hang, J. S., Ohm, J., Klancer, R., Maruyama, R., Druzhinina, M. K., Grant, B. D., Piano, F., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGG-4+and+EGG-5+Link+Events+of+the+Oocyte-to-Embryo+Transition+with+Meiotic+Progression+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans.</a> Curr Biol. 19, 1752-1757 (2009).</li>
<li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys J. 75, 2015-2024 (1998).</li>
<li>Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+and+multidimensional+analysis+of+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics.</a> Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Po fuzji z plemnikiem zygota przechodzi szereg dynamicznych zdarzeń. Procesy te przekształcają oocyt z komórki relatywnie statycznej w szybko rozwijający się embrion. U wielu organizmów reorganizacje cytoplazmatyczne są kluczowe dla ustanowienia polarności embrionalnej oraz aktywacji komórki jajowej. Embrion C. elegans stwarza doskonałą okazję do obserwacji tych wczesnych etapów aktywacji jaja i embriogenezy. Embrion jest przezroczysty, a wczesne zdarzenia rozwojowe następują stosunkowo szybko po zapłodnieniu. Badacze C. elegans stworzyli wiele użytecznych szczepów transgenicznych wykazujących ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie, które biorą udział we wczesnym rozwoju. Wykorzystanie tych szczepów wraz z RNAi lub mutantami zapewnia potężny system do analizy szlaków molekularnych leżących u podstaw rozwoju organizmu wielokomórkowego (5, 6, 7, 8). Niniejszy artykuł wideo przedstawia praktyczne podejście do wykorzystania tych narzędzi i technik w celu rejestracji zdarzeń podczas wczesnej embriogenezy u C. elegans. 
Dojrzały oocyt C. elegans jest zatrzymany w profazie mejozy I i zostaje zapłodniony w spermatece dorosłego hermafrodyty. Po zapłodnieniu oocyt przechodzi przez pozostałe etapy mejozy I i II. Etapy te można obserwować, wykorzystując histonę H2B znakowaną fluorescencyjnie (5). Podczas kończenia mejozy macierzystej DNA plemnika pozostaje skondensowane (patrz Rysunek 1). Po zakończeniu mejozy DNA macierzyste i ojcowskie ulegają dekondensacji i formują się dwa prądzierze. Prądzierz macierzysty migruje w stronę prądzierza ojcowskiego, a następnie łączą się one w pobliżu centrum embrionu. Po spotkaniu prądzierzy szybko następuje mitoza. Wszystkie te zdarzenia zachodzą w czasie krótszym niż godzina. W związku z tym mikroskopia poklatkowa tej sekwencji zdarzeń może zostać łatwo przeprowadzona. Wykonanie tej techniki wymaga pewnej biegłości w hodowli nicieni oraz podstawowych umiejętności mikroskopowych, a także dostępu do mikroskopu konfokalnego.
Przykład przedstawiony w niniejszej pracy wykorzystuje transgeniczny szczep C. elegans, który wykazuje ekspresję dwóch białek fluorescencyjnych: GFP::ubiquitin oraz mCherry::H2B. Do obserwacji dynamicznej lokalizacji tych dwóch białek wykorzystano konfokalny skaningowy mikroskop laserowy. Ponadto wykazano, że wstrzyknięcie fluorescencyjnie znakowanego Lysotracker pozwala na śledzenie losów lizosomów w zarodku po zapłodnieniu. Wstrzyknięcie znakowanego znacznika może być również zastosowane w celu wizualizacji mitochondriów lub lokalnych stężeń wapnia (9). Teoretycznie protokół wstrzykiwania mógłby zostać wykorzystany do obserwacji dowolnego rodzaju fluorescencyjnie znakowanej cząsteczki w zarodku. Mogą to być m.in. znakowane małe cząsteczki, białka, lipidy itp. W niektórych przypadkach faktyczne wstrzykiwanie znaczników może nie być konieczne, ponieważ nicienie chętnie pobierają niektóre barwniki, takie jak mitotracker (10). Niemniej jednak, po przetestowaniu zarówno metody namaczania, jak i wstrzykiwania lysotracker, stwierdzono, że wstrzykiwanie daje znacznie lepsze wyniki w wizualizacji w zarodkach.
Uwagi techniczne:
Wyzwania techniczne związane z tą procedurą obejmują technikę mikroiniekcji, a także trudności w obrazowaniu embrionów we wczesnych stadiach rozwoju. W odniesieniu do mikroiniekcji, kluczowe dla sukcesu zabiegu jest uzyskanie odpowiedniej grubości podkładki z agarozy. Jeśli podkładka będzie zbyt gruba, nicienie szybko wyschną i zginą. Jeśli natomiast podkładka będzie zbyt cienka, nicienie nie będą się do niej przylegać podczas procesu iniekcji.
Wczesne embriony mogą być wrażliwe na warunki środowiskowe, takie jak temperatura i skład buforu. Embriony typu dzikiego powinny rozpocząć dekondensację DNA plemnika oraz migrację pronukleusów w ciągu około minuty od zakończenia mejozy II (4). W ciągu 20 minut powinna rozpocząć się pierwsza cytokineza. Jeśli embriony zostaną poddane działaniu bardzo wysokiej intensywności lasera, przegrzeją się lub zostaną zmiażdżone podczas montażu, proces ten może zostać zakłócony. W takich przypadkach rozwój embrionów zostanie zatrzymany. Jeśli tak się stanie, należy powtórzyć eksperyment, zmniejszając moc lasera lub stosując grubszą podkładkę agarozową.
C. elegans nie wydzielają skorupki jaja aż do czasu krótkiego po zapłodnieniu. W krótkim odstępie czasu między zapłodnieniem a wydzieleniem skorupki jaja zarodki nie są zdolne do przeżycia poza organizmem matki (11). Niektóre laboratoria unikają tego problemu, obrazując zarodki in utero (5, 12). Obrazowanie in utero oferuje pewne zalety, takie jak możliwość uchwycenia zdarzeń występujących w trakcie lub tuż po zapłodnieniu. Technika ta wymaga jednak zastosowania systemu mikroskopowego umożliwiającego obrazowanie głębokich tkanek. Szczególnie odpowiednie do tego celu są systemy dwufotonowe lub wielofotonowe (13, 14). Przy użyciu konwencjonalnego konfokalnego mikroskopu laserowo-skanującego lub z dyskiem wirującym najlepsze obrazy uzyskuje się z zarodków wyciętych z dorosłego nicienia, zgodnie z opisaną tutaj procedurą.
Uwagi dotyczące systemu obrazowania:
Rodzaj zastosowanego systemu obrazowania konfokalnego zależy od potrzeb użytkownika. Generalnie systemy skanowania laserowego są zalecane, gdy celem jest uzyskanie obrazów o najwyższej możliwej rozdzielczości. Z kolei systemy z dyskiem obrotowym (spinning disk) lepiej nadają się do obrazowania procesów o wysokiej dynamice, ponieważ akwizycja obrazu jest stosunkowo szybka, a fotobleaching i fototoksyczność są zredukowane.
Konkretne parametry obrazowania będą się różnić w zależności od projektu eksperymentalnego i zastosowanego systemu obrazowania konfokalnego. W obrazowaniu wielowymiarowym należy uwzględnić liczbę kanałów, płaszczyzn ogniskowania i punktów czasowych poddawanych akwizycji. Ze względu na ograniczający wpływ fotobleachingu i fototoksyczności, w każdym eksperymencie można pozyskać ograniczoną liczbę obrazów. Zatem w przypadku decyzji o zwiększeniu liczby rejestrowanych kanałów, prawdopodobnie konieczne będzie zmniejszenie liczby płaszczyzn ogniskowania i/lub punktów czasowych i odwrotnie. Całkowita liczba obrazów, które można pozyskać, będzie zależeć od intensywności obrazowanego fluoroforu, a także od czułości używanego mikroskopu konfokalnego. Bardziej intensywne fluorofory i czulsze urządzenia wymagają krótszych czasów ekspozycji, co skutkuje mniejszym fotobleachingiem i fototoksycznością.
Dostępnych jest wiele systemów obrazowania. Przedstawimy szczegółowe informacje o systemach wykorzystywanych w naszych własnych laboratoriach. Do obrazowania embrionów nicieni za pomocą konfokalnej mikroskopii z dyskiem wirującym używamy odwróconego mikroskopu Nikon TE2000U wyposażonego w obiektyw 60X/1.4 N.A. Plan Apo. Mikroskop jest połączony z jednostką dysku wirującego Yokogawa CSU10, kamerą EM CCD Hamamatsu C9100-13 oraz modułem łączenia laserów Spectral Applied Research LMM5 zawierającym cztery lasery półprzewodnikowe o długości fali 405, 491, 561 i 655 nm. Korzystając z tego systemu, możemy rejestrować jeden lub dwa kanały, od sześciu do dwunastu płaszczyzn ogniskowania oraz od 25 do 50 punktów czasowych (w odstępach od 30 do 60 sekund). Typowy czas ekspozycji wynosi od 100 do 200 milisekund.
Do obrazowania zarodków za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej używamy systemu Zeiss LSM700 wyposażonego w 2 kanały i cztery lasery półprzewodnikowe (405, 488, 555 i 635 nm). System ten jest połączony z odwróconym mikroskopem Zeiss Axio Observer z obiektywem Plan-Apo 63X/1.4NA wykorzystywanym do obrazowania zarodków. System wykorzystuje oprogramowanie Zeiss ZEN do akwizycji obrazów, które zapewnia również ograniczone możliwości przetwarzania i analizy obrazu. Podczas obrazowania z użyciem dwóch fluorochromów zazwyczaj rejestrujemy 1-5 płaszczyzn ogniskowych (w odstępach ok. 0,5 μm) i zbieramy stosy Z (Z stack) co 15 sekund. Akwizycję kontynuujemy do momentu wystąpienia znacznego fotowybielania. Aby stworzyć końcowy film poklatkowy, obrazy ze stosów Z są konsolidowane za pomocą narzędzia maksymalnej projekcji (maximum projection) w oprogramowaniu ZEN. Filmy są eksportowane z oprogramowania jako pliki avi.

<table><tbody><tr><td>Bufor do jaj</td><td></td><td></td><td>5mM Hepes pH 7.2, 110mM NaCl, 4mM KCl, 5mM octanu Mg, 5mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Mitotracker</td><td>Invitrogen</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Lysotracker</td><td>Invitrogen</td><td>L-7525</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara do mikroiniekcji</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC120F-10</td><td></td></tr><tr><td>Wyciągacz igieł</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 700C</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do mikroiniekcji</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>regulator mikroiniekcji MINJ-1</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans jest często wykorzystywany jako model w badaniach wczesnych procesów rozwojowych. Przezroczystość embrionów, dostępne zasoby genetyczne oraz wzglatywna łatwość transformacji sprawiają, że C. elegans jest doskonałym modelem wczesnej embriogenezy. Mikroskopia konfokalna oparta na laserze oraz znaczniki fluorescencyjne pozwalają badaczom śledzić specyficzne struktury komórkowe i białka w rozwijającym się embrionie. Przykładowo, można śledzić konkretne organelle, takie jak lizosomy lub mitochondria, przy użyciu barwników fluorescencyjnych. Barwniki te mogą zostać wprowadzone do wczesnego embrionu poprzez mikroiniekcję do gonady dorosłego osobnika. Ponadto lokalizację specyficznych białek można śledzić za pomocą fluorescencyjnych znaczników białkowych. W niniejszej pracy przedstawiono przykłady demonstrujące zastosowanie fluorescencyjnego barwnika lizosomalnego, a także histonów i białek ubikwityny z fluorescencyjnymi znacznikami. Znakowany histon służy do wizualizacji DNA, a tym samym do identyfikacji fazy cyklu komórkowego. Ubikwityna z tagiem GFP ujawnia dynamikę ubikwitynowanych pęcherzyków we wczesnym embrionie. Obserwacje znakowanych lizosomów oraz GFP::ubikwityny mogą być wykorzystane do ustalenia, czy występuje kolokalizacja między pęcherzykami ubikwitynowanymi a lizosomami. Przedstawiono technikę mikroiniekcji barwnika lizosomalnego. Techniki tworzenia szczepów transgenicznych zostały opisane w innych opracowaniach (1, 2). W celu obrazowania embriony są wycinane z dorosłych hermafrodytycznych nicieni i montowane na 2% podkładach agarozowych, po czym przeprowadzana jest mikroskopia time-lapse przy użyciu standardowego laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego lub konfokalnego mikroskopu z dyskiem rotującym (spinning disk). Metodyka ta umożliwia wysokorozdzielczą wizualizację wczesnej embriogenezy.

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

*Caenorhabditis elegans* jest często wykorzystywany jako model w badaniach nad wczesnymi procesami rozwojowymi. Przezroczystość zarodków, genetyczna...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest rejestracja zdarzeń subkomórkowych podczas wczesnego embrionogenezy u Ca. elegans. Osiąga się to poprzez wykorzystanie szczepów transgenicznych z wieloma białkami znakowanymi fluorescencyjnie, co umożliwia wizualizację DNA, a także podzbiorów pęcherzyków. We wczesnym embrionie konkretne organelle są znakowane poprzez mikroiniekcję barwników fluorescencyjnych, takich jak LysoTracker lub MitoTracker, do gonady dorosłego nicienia. Następnie embriony są wycinane z dorosłych osobników i obserwowane za pomocą mikroskopu konfokalnego w celu uzyskania nagrań poklatkowych ruchów znakowanych białek w organellach.Ostatecznie protokół ten ujawnia interesujący ruch lizosomów i pęcherzyków znakowanych GFP podczas wczesnego rozwoju w CL allergans. Nazywam się Connie Hedger i dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzamy mikroskopię time-lapse w naszym laboratorium – laboratorium Boyda na University of Alabama w Huntsville. Do tego eksperymentu, dzień przed jego rozpoczęciem, należy wyhodować nicienie na płytkach agarowych NGM z zasianym trawnikiem bakterii OP 50 w temperaturze 25 °C; następnie przenieść co najmniej 40 larw w stadium L4 na zasiane płytki i inkubować je przez noc w temperaturze 25 °C.Robaki te będą w stadium młodych osobników dorosłych. Do eksperymentu należy przygotować podkładkę do iniekcji, umieszczając dwie krople 2% agarozy w wodzie z pipety pasty pomiędzy dwiema szkiełkami nakrywkowymi i przykładając nacisk, aby uformować agarozę w okrąg o średnicy 1,5 centymetra.Zdejmij górne szkiełko przykrywcze i odwodnij podkładkę, umieszczając ją w piekarniku w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez jedną godzinę lub pozostawiając ją na blacie laboratoryjnym przez noc. W dniu iniekcji przygotuj rozcieńczony roztwór barwnika MIT tracker lub lyo tracker i wytnij igły do iniekcji z kapilary szklanej o średnicy zewnętrznej 1,2 od. Napełnij igły rozcieńczonym roztworem barwnika i przechowuj je w ciemnej, nawilżanej komorze. Zamocuj igłę do iniekcji na mikromanipulatorze i podłącz igłę do regulatora ciśnienia za pomocą rurki o średnicy wewnętrznej 1,2 milimetra.Następnie nanieś dwie krople ciężkiego oleju mineralnego na podkładkę do iniekcji. Umieść podkładkę na mikroskopie i opuść igłę do oleju. Przyłóż ciśnienie iniekcyjne i sprawdź, czy z igły wypływa ciecz.Jeśli nie, należy delikatnie ułamać końcówkę igły, lekko wbijając jej czubek w mały odłamek szkła kryształkowego umieszczony na podkładce do iniekcji. Po uzyskaniu przepływu w igle, przystąp do iniekcji na jedną godzinę przed obserwacją embrionów. Użyj picka, aby przenieść młode dorosłe nicienie do kropli oleju na podkładce do iniekcji.Ułóż od trzech do 10 nicieni równolegle, zachowując odstęp nieco mniejszy niż długość jednego nicienia. Ważne jest, aby szybko wykonać iniekcję, zanim nicienie wyschną. Przenieś podkładkę z nicieniami na stolik mikroskopu.Ustaw ostrość na środkową część dystalnej gonady. Następnie za pomocą mikromanipulatora przesuń końcówkę igły do tej samej płaszczyzny ogniskowania. Przebij organizm, przesuwając stolik poziomo.Gdy końcówka igły znajduje się wewnątrz cus, należy wywrzeć nacisk, aby wypełnić gonadę mieszaniną barwnika. Gonada powiększy się wraz z objętością wstrzykiwanej cieczy. Kontynuuj wstrzykiwanie.Następnie przenieś każdego nicienia do ramienia sieci po iniekcji. Przykryj nicienie 0.5 ml naniesionego buforu do jaj. Używając dociągniętej pipety pastoralnej, pozwól nicieniom regenerować się przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej w nawilżonej komorze bez dostępu światła.Zacznij od przygotowania nowej podkładki z agrosu do obserwacji wstrzykniętych embrionów za pomocą pipety Pasteura. Nanieś trzy krople stopionego agrosu na czystą laminkę mikroskopową, a następnie umieść tę laminkę pomiędzy dwiema innymi, owiniętymi jedną warstwą folii etykietującej. Przyklej je taśmą; taśma kontroluje grubość podkładki.Następnie dociśnij czyste szkiełko przedmiotowe do kropel agarozy tak, aby spoczywało na szkiełkach z taśmą. Nie zdejmuj górnego szkiełka, dopóki embriony nie będą gotowe do zamontowania. Teraz nanieś 20 µL buforu do jaj na środek szkiełka nakrywkowego i przenieś wstrzyknięte nicienie do buforu. Pod mikroskopem stereoskopowym rozetnij nicienie w pobliżu vulvy.Za pomocą igły hipodermicznej o rozmiarze 26 G zarodki zostaną wypuszczone z organizmu nicienia. Następnie należy zdjąć górny preparat z zestawu do obrazowania i położyć podkładkę aros odwróconą do góry dnem na szkiełko nakrywkowe z zarodkami. Jeśli obrazowanie zarodków ma trwać przez dłuższy czas, należy uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowe wazeliną, aby zapobiec wysychaniu.Następnie rozpocznij obrazowanie, lokalizując embriony pod obiektywem 10 x w celu znalezienia embrionów we wczesnym stadium; szukaj embrionów, które są w procesie kończenia mejozy macierzyńskiej. Embriony w fazie mejozy można odróżnić od embrionów w późniejszych stadiach po tym, że nie przeszły one jeszcze skrócenia. Po zakończeniu mejozy w przedniej części embrionu pojawia się znaczna przerwa między błoną komórkową a skorupką jaja.Po zidentyfikowaniu zarodka na odpowiednim etapie rozwoju, należy przełączyć na obiektyw o większym powiększeniu w celu rejestracji embriogenezy. Zarodek ten wykazuje ekspresję białek M cherry histone two B oraz GFP z tagiem ubikwityny. DNA matczyne i ojcowskie jest widoczne dzięki M cherry H two B, co pozwala na obserwację etapów wczesnego rozwoju.Zarodek ten został wstrzyknięty barwnikiem OC Tracker blue i wykazuje ekspresję GFP Ubiquitin. Obrazy zebrano przy użyciu obiektywu 63 x 1.4 NA z laserami 4 88 i 5 55 ustawionymi na minimalną moc i maksymalne wzmocnienie. Zazwyczaj stosy Z są zbierane co 10 do 15 sekund przez maksymalnie 60 punktów czasowych, aż do wystąpienia fotobielenia.W przypadku tego filmu TimeLapse, stosy Z zostały zredukowane do obrazów maksymalnej projekcji podczas wykonywania mikroskopii time-lapse. W embrionach migracja pronukleusów powinna rozpocząć się w ciągu kilku minut od zakończenia drugiej mejozy, a pierwsza cytokineza powinna rozpocząć się w ciągu 20 minut.Jeśli zaobserwują Państwo zahamowanie rozwoju embrionów, należy spróbować zmniejszyć intensywność lasera lub zastosować grubszą podkładkę podległą.

time-lapse-microscopy-of-early-embryogenesis-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przeskalowany czasowo mikroskopia wczesnej embriogenezy u Caenorhabditis elegans

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Łatwość utrzymania i propagacji nicieni C. elegans sprawia, że są one doskonałym organizmem modelowym. Możliwość synchronizacji nicieni pozwala na pracę ze znaczną liczbą osobników w tym samym stadium rozwojowym, co ułatwia badanie konkretnego procesu u wielu zwierząt.

Podstawowe metody pracy z Caenorhabditis elegans: Synchronizacja i obserwacja

Opisano tutaj technikę in vivo obrazowania struktur podkomórkowych u zwierząt poddanych anoksji, z wykorzystaniem komory mikroinkubacyjnej z przepływem gazu w połączeniu z konfokalnym mikroskopem z wirującym dyskiem. Metoda ta jest prosta i wystarczająco elastyczna, aby dostosować ją do różnych parametrów eksperymentalnych i systemów modelowych.

Wykorzystanie mikroskopii poklatkowej do wizualizacji anoksji-indukowanego stanu zawieszenia animacji w embrionach C. elegans

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

W tym artykule demonstrujemy obrazowanie na żywo poszczególnych robaków za pomocą niestandardowego urządzenia mikroprzepływowego. W urządzeniu wiele robaków jest indywidualnie zamkniętych w oddzielnych komorach, co pozwala na wielokrotny nadzór podłużny nad różnymi procesami biologicznymi.

Platforma mikroprzepływowa do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i montażu zarodków Caenorhabditis elegans, rejestrowania rozwoju pod mikroskopem 4D i śledzenia linii komórkowej.

Mikroskopia 4D: odkrywanie rozwoju embrionalnego Caenorhabditis elegans za pomocą mikroskopii Nomarskiego

Tutaj prezentujemy protokoły i narzędzia do wizualizacji wapnia podczas zapłodnienia i wczesnej embriogenezy za pomocą genetycznie kodowanego reportera wapnia wyrażonego w linii zarodkowej modelowego nicienia C. elegans.

Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Poznaj mikroskopię poklatkową wczesnej embriogenezy u Caenorhabditis elegans. Ta metoda wykorzystuje transgeniczne szczepy z fluorescencyjnie znakowanymi białkami do wizualizacji dynamiki organelli i DNA w żywych zarodkach.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów