Mikroskopia poklatkowa wczesnej embriogenezy u Caenorhabditis elegans

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zarejestrowanie zdarzeń subkomórkowych podczas wczesnej embriogenezy elegancji Insino Ratu. Osiąga się to dzięki zastosowaniu szczepów transgenicznych z wieloma białkami znakowanymi fluorescencyjnie, które umożliwiają wizualizację DNA, a także podzbiorów pęcherzyków We wczesnym zarodku określone organelle są znakowane przez mikrowstrzyknięcie barwników fluorescencyjnych, takich jak Lyo tracker lub MIT tracker do gonady dorosłego robaka. Następnie zarodki są wycinane z dorosłych robaków i obserwowane pod mikroskopem konfokalnym w celu uzyskania poklatkowych zapisów ruchów znakowanych białek w organellach.

Ostatecznie protokół ujawnia interesujący ruch lizosomów i pęcherzyków znakowanych GFP podczas wczesnego rozwoju alerganów CL. Nazywam się Connie Hedger i dzisiaj pokażę wam, jak wykonujemy mikroskopię poklatkową w naszym laboratorium, laboratorium Boyda na Uniwersytecie Alabama w Huntsville. W tym eksperymencie nicienie gro nebra na płytkach rolniczych NGM, osadzone na trawniku bakteryjnym OP 50 w temperaturze 25 stopni Celsjusza dzień przed eksperymentem, wybierają co najmniej 40 litrowe cztery larwy na siedzące płytki i inkubują je przez noc w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Te robaki będą młodymi dorosłymi. Do eksperymentu. Przygotuj podkładkę do wstrzykiwań, umieszczając dwie krople 2%aros w wodzie z poprzedniej pipety między dwoma szkiełkami ze szkła nakrywkowego i wywierając nacisk, aby uformować agros w okrąg o średnicy 1,5 centymetra.

Zdejmij górną szkiełko nakrywkowe i osusz podkładkę, umieszczając ją w piekarniku o temperaturze 80 stopni Celsjusza na godzinę lub pozostaw na noc na blacie. W dniu wstrzyknięcia należy przygotować rozcieńczony roztwór barwnika MIT tracker lub lyo tracker i wyciągnąć igły do wstrzykiwań ze szklanej kapilary o średnicy 1,2 od. Napełnij igły rozcieńczonym roztworem barwnika i przechowuj je w ciemnej, nawilżonej komorze zamontuj igłę iniekcyjną na mikromanipulatorze i podłącz igłę do regulatora ciśnienia z rurką o średnicy wewnętrznej 1,2 milimetra.

Teraz umieścić dwie krople ciężkiego oleju mineralnego na końcówce iniekcyjnej. Umieścić końcówkę iniekcyjną na mikroskopie i zanurzyć igłę w oleju. Zastosować ciśnienie iniekcji i obserwować, czy płyn wypływa z igły.

W przeciwnym razie należy delikatnie złamać końcówkę igły, delikatnie wbijając końcówkę w niewielki kawałek potłuczonego szkła nakrywkowego umieszczonego na końcówce iniekcyjnej. Po tym, jak igła zacznie płynąć, należy przystąpić do wstrzyknięcia na godzinę przed oglądaniem zarodków. Za pomocą zdjęcia przenieś młode dorosłe robaki do kropli oleju na podkładce iniekcyjnej.

Ułóż od trzech do 10 robaków równolegle i nieco mniej niż jedną długość robaka od siebie. Teraz ważne jest, aby szybko wstrzyknąć robaki, zanim robaki wyschną. Przenieś podkładkę z robakami na stolik mikroskopu.

Skoncentruj się na centralnej części dystalnej gonady. Następnie za pomocą mikromanipulatora przesuń końcówkę igły w tę samą płaszczyznę ogniskowej. Nakłuj robaka, przesuwając stolik w poziomie.

Gdy końcówka igły znajdzie się w kuźni, zastosuj nacisk, aby wypełnić gonadę mieszanką barwników. Gonada rozszerza się wraz z objętością wstrzyknięcia. Kontynuować wstrzykiwanie.

Oba przechodzą przez ramiona sieciowe każdego robaka po wstrzyknięciu. Przykryj robaki nałożonymi 0,5 mililitra buforu do jaj. Za pomocą wyciągniętej pipety pastwiskowej pozwól robakom zregenerować się przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej w lekko nawilżonej komorze.

Zacznij od przygotowania nowej podkładki agros do oglądania wstrzykniętych zarodków za pomocą poprzedniej pipety. Umieść trzy krople stopionego agros na czystym szkiełku mikroskopowym i umieść to szkiełko między dwoma innymi szkiełkami owiniętymi jedną warstwą etykiety. Taśma taśma kontroluje grubość podkładki.

Następnie dociśnij czysty szkiełko mikroskopowe w dół do kropli agros, tak aby spoczywało na szkiełkach taśmy. Nie zdejmuj górnego szkiełka, dopóki zarodki nie będą gotowe do zamontowania. Teraz upuść 20 mikrolitrów buforu jajowego na środek szkła nakrywkowego i przenieś wstrzyknięte robaki do buforu Pod mikroskopem preparacyjnym rozetnij robaki w pobliżu sromu.

Za pomocą igły podskórnej o rozmiarze 26 zarodki wyleją się z robaka. Teraz zdejmij górny szkiełko do obrazowania i opuść podkładkę aros do góry nogami na szkło nakrywkowe z zarodkami. Jeśli zarodki będą obrazowane przez dłuższy czas, należy uszczelnić krawędzie szkła nakrywkowego wazeliną, aby zapobiec wysuszeniu.

Teraz rozpocznij obrazowanie od zlokalizowania zarodków w ramach celu 10 x, aby znaleźć zarodki we wczesnym stadium, poszukać zarodków, które są w trakcie kończenia mejozy matczynej. Zarodki miotyczne można odróżnić od późniejszych zarodków, ponieważ nie uległy skróceniu. Po zakończeniu mejozy istnieje znaczna przerwa między błoną komórkową a skorupką jaja na przednim końcu zarodka.

Po zidentyfikowaniu odpowiednio zaawansowanego zarodka należy przenieść go do soczewki o większym powiększeniu w celu zarejestrowania embriogenezy. Ten zarodek wykazuje ekspresję zarówno białek znakowanych ubikwityną M wiśni, histonu wiśniowego, dwóch, B, jak i GFP. DNA matki i ojca jest widoczne przez M cherry H dwa B, a tym samym pokazuje etapy wczesnego rozwoju.

Temu zarodkowi wstrzyknięto niebieski OC Tracker, w którym występuje ekspresja ubikwityny GFP. Obrazy zostały zebrane za pomocą obiektywu 63 x 1,4 NA z 4 laserami 88 i 5 5 55 ustawionymi na minimalną moc i maksymalne wzmocnienie. Zazwyczaj Zacks są zbierane co 10 do 15 sekund przez maksymalnie 60 punktów czasowych, zanim nastąpi fotowybielanie.

W tym filmie poklatkowym stosy Z zostały zwinięte do maksymalnych obrazów projekcyjnych podczas wykonywania filmu poklatkowego. Zarodki pod mikroskopem powinny rozpocząć migrację przedjądrową w ciągu kilku minut od zakończenia miozy drugiej i w ciągu 20 minut. Powinna rozpocząć się pierwsza cytokineza.

Jeśli zauważysz zahamowanie rozwoju swoich zarodków, spróbuj zmniejszyć intensywność lasera lub użyj grubszej podkładki wróżbiącej.