Znakowanie bromodeoksyurydyną (BrdU) oraz następujące po nim sortowanie komórek metodą fluorescencji w celu niezależnej od hodowli identyfikacji bakterioplanktonu degradującego rozpuszczony węgiel organiczny

Mikroby pośredniczą w degradacji licznych substratów rozpuszczonego węgla organicznego lub związków DOC, takich jak te występujące w środowiskach wodnych. Aby w pełni zrozumieć rolę mikrobów w transformacji DOC, konieczna jest jednoczesna identyfikacja ich taksonomii i funkcji. W niniejszym filmie przedstawiono procedurę identyfikacji taksonomicznej wolno żyjących bakterii lub planktonu bakteryjnego, które transformują określone pulle DOC w środowiskach wodnych.

Próbki wody pobrane ze środowiska testowego są przetwarzane i inkubowane z badanym związkiem oraz bromo-deoksyurydyną, BRDU, która wbudowuje się w nowo syntetyzowany DNA i aktywnie rosnące komórki. Następnie plankton bakteryjny znakowany BRDU jest znakowany przeciwciałami anty-BRDU skoniugowanymi z ZI. Plankton bakteryjny o wysokim poziomie znakowania BRDU jest izolowany metodą fluorescencyjnego sortowania komórek.

Następnie z posortowanych komórek ekstrahuje się DNA, a identyfikację taksonomiczną przeprowadza się w oparciu o wyniki analizy genu 16 s rRNA metodą PCR. Dzień dobry, nazywam się Steven Robbins i reprezentuję laboratorium dr. Chen Mao w Katedrze Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Kent State. Dzisiaj wraz z Lu zaprezentujemy Państwu niezależną od hodowli metodę identyfikacji bakterii planktonicznych degradujących DOC w środowiskach wodnych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak dodatki odżywcze, a następnie analiza DNA społeczności bakteryjnej, jest to, że koncentruje ona analizę na bakteriach wysoce aktywnych i wyklucza komórki uśpione oraz wolno rosnące. Przedstawiamy tutaj identyfikację planktonu bakteryjnego wykorzystującego jeden konkretny związek DOC. Metoda ta może być jednak zastosowana również do badania planktonu bakteryjnego wykorzystującego inny pojedynczy związek DOC lub grupę DLC, takich jak eksudaty glonów.

Pobierzmy więc próbki wody i zacznijmy. Przed analizą próbek wody pod kątem planktonu bakteryjnego degradującego DOC, próbki te muszą zostać odpowiednio przygotowane. Próbki przedstawione tutaj zostały pobrane z wybrzeża Georgii, aby usunąć z nich duże cząstki oraz ER VRE.

Użyj pompy perystaltycznej, aby przenieść wodę z bani zbiorczej do jednostki filtrującej z filtrem o rozmiarze porów 1 µm. Następnie przenieś 36 ml alikwoty filtratu do trzech sterylnych polipropylenowych probówek o pojemności 50 ml. Każda z nich powinna zawierać 4 ml świeżo przygotowanego 10% roztworu paraformaldehydu. Inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki po inkubacji.

Wlej wodę do kolumny filtracyjnej szklanego zestawu do filtracji próżniowej z białymi filtrami membranowymi o rozmiarze porów 0,22 µm i zastosuj podciśnienie, aby przeciągnąć roztwór przez membranę. Przepłucz filtr, przepuszczając 10 ml PBS przez filtr próżniowy. Oznacz filtry jako kontrole negatywne i przechowuj je w temperaturze -20 °C.

Aby stworzyć eksperymentalny ekosystem lub mikrokosmos, należy rozpocząć od napełnienia sześciu uprzednio wypłukanych jednolitrowych kolb szklanych 800 mililitrami przefiltrowanej próbki wody. Do każdego mikrokosmosu należy dodać BRDU do stężenia końcowego 10 micromolar. Kolbę należy szybko obrócić ręcznie, aby wymieszać zawartość.

Każda próbka zostanie poddana analizie w trzech powtórzeniach. Dlatego do trzech mikrokosmosów należy dodać modelowy związek DOC. W tym przypadku do mikrokosmosów dodaje się reine w końcowym stężeniu 100 nM.

Następnie do pozostałych trzech mikrokosmosów należy dodać sterylny PBS. Będą one służyć jako kontrole bez DOC. Wszystkie mikrokosmosy należy umieścić w inkubatorze z wytrząsarką przy 100 RPM w ciemności, w temperaturze in situ, która wynosi 25 °C. Próbki pobierane będą w punktach czasowych 0, 8, 16 i 24 godziny.

Pobrać 36 ml z każdego mikrokosmosu do sterylnej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml zawierającej cztery ml świeżego 10%paraform aldehyde; inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia komórek. Następnie przefiltrować utrwalone komórki przez białe filtry membranowe o rozmiarze porów 0,22 µm. Przepuścić 10 ml PBS przez filtr próżniowy, aby wypłukać pozostałości PFA.

Przejdź niezwłocznie do detekcji immunocytochemicznej in situ lub przechowuj filtry w temperaturze minus 20 °C w celu przeprowadzenia analizy wbudowania BRDU do planktonu bakteryjnego. Rozpocznij od doprowadzenia filtrów z próbkami do temperatury pokojowej, aby naruszyć ścianę komórkową bakterii. Umieść filtr w jednostce filtracyjnej, a następnie nanieś pipetą 1 mL roztworu lizozymu na filtr, aby pokryć komórki, i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Po inkubacji zastosuj próżnię, aby usunąć roztwór. Gdy roztwór przejdzie przez filtr, przemyj komórki, dodając 10 mililitrów PBS, i ponownie zastosuj próżnię. Następnie, aby dodatkowo uszkodzić ścianę komórkową, dodaj na filtr jeden mililitr roztworu proteinazy K, aby pokryć komórki.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przemyć buforem PBS, aby uzyskać pojedynczą warstwę DNA. Dodać jeden mililitr roztworu egzonukleazy, aby pokryć komórki na filtrze.

Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji przemyć filtr, przepuszczając przez filtr próżniowy 10 ml PBS. Następnie odciąć krawędzie filtra, aby usunąć fragmenty pozbawione komórek.

Następnie na suchej powierzchni oczyszczonej alkoholem, za pomocą sterylnego ostrza, należy pociąć filtr na osiem równych części. Dla każdej próbki wymagane są osiem komór inkubacyjnych z uszczelnieniem ramkowym; jedną ósmą część filtra należy umieścić w zmontowanej komorze inkubacyjnej z uszczelnieniem ramkowym stroną z próbką do góry. Po zmontowaniu komór należy użyć zestawu do wykrywania proliferacji komórek Roche Intu w celu wykrycia komórek znakowanych A-B-R-D-U in situ.

Po zakończeniu procedur oczekujących wyjmij sekcję filtra z komory inkubacyjnej i umieść ją na sterylnej powierzchni; za pomocą sterylnego ostrza potnij sekcję filtra na małe kawałki. Przenieś fragmenty filtra do probówki do mikrocentrifugowania o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml PBS, szczelnie zamknij probówkę i zabezpiecz ją parafilmem. Następnie inkubuj probówkę w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 37 °C przy 200 RPM przez 10 minut.

Po inkubacji zabezpiecz probówkę i wymieszaj ją w wortexie z maksymalną prędkością. Przez pięć minut przenoś pipetą nadpływ SUP do sterylnej polipropylenowej probówki o pojemności 15 ml. Następnie resuspenduj filtr w PBS i powtórz etapy wymieszania w wortexie oraz inkubacji jeszcze dwa razy, za każdym razem dodając nadpływ do tej samej probówki 15 ml dla każdej próbki.

Przechowywać resuspendowane komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Próbkę należy przeanalizować za pomocą FACS w ciągu dwóch dni. Na koniec przeprowadzić sortowanie komórek w celu uzyskania populacji o wysokim poziomie wbudowania BRDU.

W niniejszym protokole wykorzystano cytometr przepływowy BD FACS oraz odpowiednie oprogramowanie. Po posortowaniu komórek można przeprowadzić analizę populacji wzbogaconej w BrdU w celu ustalenia jej tożsamości taksonomicznej. Aby przeprowadzić PCR w celu amplifikacji genów 16S rRNA posortowanych bakterii, należy nanieść posortowane komórki na biały filtr membranowy z poliwęglanu o rozmiarze porów 0.22 µm i uruchomić pompę próżniową, a następnie za pomocą sterylnego skalpela odciąć krawędzie filtra wolne od komórek.

Podziel filtr na cztery równe części dla każdego z warunków, a następnie umieść pojedynczy fragment filtra w każdej z trzech probówek do reakcji PCR, tak aby komórki były skierowane do wnętrza probówki. Dodaj 45 µL wody klasy PCR. Pozostaw fragment filtra do całkowitego zanurzenia w wodzie.

Następnie należy dodać dwie kulki PCR Roche illustra pure T ready to go i krótko wymieszać w wirówce, aby pomóc w rozpuszczeniu kulek. Następnie dodaje się po 2 µL starterów forward i reverse genu 16 s rRNA.

Należy dodać jeden mikrolitr BSA w celu neutralizacji inhibitorów amplifikacji lub jeden mikrolitr wody. Przeprowadzić amplifikację PCR w termocyklerze. Zalecany jest program touchdown PCR, w którym temperatura przyłączania chronologicznie spada od 62 do 52 °C o jeden stopień Celsjusza w każdym cyklu, a następnie następuje 15 cykli w temperaturze 52 °C.

Potwierdź amplifikację PCR za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych 1% barwionych bromkiem etydinium, wytnij amplikony PCR z żelu i oczyść je za pomocą zestawu KaiGen cayo quick gel extraction. Po oczyszczaniu produktów PCR z żelu połącz amplikony z tej samej próbki. Oczyszczone amplikony 16 s rybosomalnego DNA są teraz gotowe do szeregu analiz molekularnych.

Próbki pobrano z obszaru wybrzeża Georgii i poddano procesom w celu zbadania bakterii degradujących racinę zgodnie z procedurami opisanymi w tym filmie. Racina jest związkiem poliamidowym, który powszechnie występuje w środowiskach morskich. Jak pokazano tutaj, może on służyć jako źródło składników odżywczych i energii dla bakterii morskich.

Analiza faktów dotycząca próbek wykazała, że po 24-godzinnej inkubacji w mikrokosmosach wzbogaconych o Racine wykształciła się grupa bakterii o wyższej intensywności fluorescencji FXI, która była dodatnio skorelowana ze stopniem wbudowywania BRDU. Komórki te określono jako komórki o wysokim wbudowywaniu BRDU (HI) i oczekiwano, że będą one składać się głównie z bakterii degradujących Racine. Brak HI.

W kontrolach bez dodatków stwierdzono obecność komórek, które wykazywały niższy poziom wbudowywania BRDU (tzw. komórki lii); oczekiwano, że będą one zawierać głównie plankton bakteryjny, który nie był w stanie go wykorzystać. Dodane komórki Racine HI zostały posortowane do osobnych probówek, a następnie zebrane na filtry membranowe. Częściowe amplikony genu 16S rRNA uzyskano po przeprowadzeniu reakcji PCR z filtra, a następnie potwierdzono ich obecność za pomocą elektroforezy w żelu.

Po zastosowaniu filtra sortującego można przeprowadzić amplifikację PCR genów funkcjonalnych, aby zbadać różnorodność funkcjonalną wśród posortowanych komórek. Przedstawiliśmy sposób fizycznego oddzielania i identyfikacji funkcjonalnych komórek bakteryjnych w środowisku wodnym z wykorzystaniem podejścia łączącego sortowanie komórek aktywowane fluorescencją oraz wbudowywanie BrDU. Pamiętajmy, że BrDU jest szkodliwy, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić fartuch laboratoryjny i rękawiczki.

To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.