Name: Znakowanie bromodeoksyurydyną (BrdU), a następnie sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu identyfikacji niezależnego od hodowli rozpuszczonego organicznego bakterioplanktonu rozkładającego węgiel (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: Poznaj metodę znakowania BrdU i sortowania FACS do identyfikacji bakterioplanktonu rozkładającego węgiel organiczny w środowiskach wodnych. Technika umożliwia izolację aktywnie rosnących komórek degradujących DOC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez granty Narodowej Fundacji Nauki (National Science Foundation) OCE1029607 (dla X.M.) oraz MCB0702125 (dla M.A.M.) a także przez Fundację Gordona i Betty Moore (dla M.A.M.).

1. Przetwarzanie próbek wody
<ol>
 <li>Przefiltruj 10L wody środowiskowej przez filtry membranowe o wielkości porów 1 μm w celu usunięcia dużych cząstek oraz bakteriożerców. Zbierz przefiltrowaną wodę do gąsiorka. </li>
 <li>Przenieś po 36 ml filtratu do 3 sterylnych probówek Eppendorf (50 ml) zawierających 4 ml świeżo przygotowanego roztworu paraformaldehydu (PFA; 10%). Inkubuj przez 2 h w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia komórek. Zbierz komórki na białych filtrach membranowych o wielkości porów 0,2 μm za pomocą filtracji próżniowej. Przemyj filtr, przepuszczając przez niego 10 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) metodą filtracji próżniowej. Oznacz filtry jako kontrole negatywne i przechowuj je w temperaturze -20°C.</li> 
</ol>
Kroki 1.3-1.4 są opcjonalne w celu ustanowienia warunków ograniczenia DOC.
<ol start="3">
 <li>Do gąsiora dodać mieszaninę nieorganicznego azotu i fosforu (stężenie końcowe 5 μM NH4Cl, 5 μM NaNO3 oraz 1μM NaH2PO4).</li> 
 <li>Inkubować w ciemności w temperaturze in situ przez 48 godzin, okazjonalnie mieszając zawiesinę.</li>
</ol>
2. Tworzenie i inkubacja mikrokosmosów
<ol>
<li>Napełnij sześć szklanych kolb o pojemności 1 L próbką wody (po 80 ml) z gąsiora z kroku 1.4, aby utworzyć mikrokosmosy. Do każdego mikrokosmosu dodaj BrdU (stężenie końcowe 10 μM). Wymieszaj dokładnie.</li>
<li>Do trzech mikrokosmosów dodaj 1 ml roztworu modelowego związku DOC; będą one służyć jako próbki z dodatkiem DOC. Do pozostałych trzech mikrokosmosów dodaj 1 ml sterylnego PBS; będą one służyć jako kontrole bez dodatków.</li>
<li>Wszystkie mikrokosmosy inkubuj w inkubatorze z wytrząsarką w ciemności, w temperaturze in situ, przy prędkości wytrząsania 10 rpm.</li>
<li>Pobierz 36 ml próbki wody z każdego mikrokosmosu i przenieś do sterylnych probówek Eppendorf o pojemności 50 ml w punktach czasowych 0, 8, 16 i 24 godziny. Natychmiast dodaj 4 ml świeżego PFA (10%) do probówek z pobranymi próbkami i inkubuj przez 2 h w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki.</li>
<li>Przefiltruj utrwalone komórki przez membrany poliwęglanowe o rozmiarze porów 0,2 μm. Przepłucz filtry 10 ml PBS. Przejdź niezwłocznie do następnego kroku lub przechowuj filtry w temperaturze -20°C.</li>
</ol>
3. Immunodetekcja in situ wbudowania BrdU
<ol>
<li>Rozmrozić filtry (próbki z dodatkiem DOC, kontrole bez dodatków oraz kontrole negatywne) w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Nanieść 1 ml roztworu lizozymu [10 mg/ml lizozymu z białka jaja w 10 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] 4, aby pokryć komórki bakteryjne na filtrze. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przemyć filtr, przepuszczając przez niego 10 ml PBS pod próżnią.</li>
<li>Nanieść 1 ml roztworu proteinazy K [2 mg/ml proteinazy K w 10 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] 4, aby pokryć komórki bakteryjne na filtrze. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przemyć filtr, przepuszczając przez niego 10 ml PBS pod próżnią.</li>
<li>Nanieść 1 ml roztworu egzonukleazy [egzonukleaza III (50 U/ml) w 5 mM MgCl2 i 50 mM Tris-HCl] 5, aby pokryć komórki bakteryjne na filtrze. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Przemyć filtr, przepuszczając przez niego 10 ml PBS pod próżnią.</li>
<li>Złożyć komory inkubacyjne z uszczelką ramową (Bio-Rad) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
<li>Podzielić filtr na ósemki za pomocą sterylnego ostrza na suchej powierzchni oczyszczonej alkoholem.</li>
<li>Używając pęsety, umieścić jedną ósmą część filtra w jednej złożonej komorze inkubacyjnej z uszczelką ramową (dla każdej próbki filtra wymaganych jest osiem komór). Strona fragmentu filtra zawierająca komórki powinna być skierowana do góry. Wilgotność na spodzie filtra pozwoli mu przywrzeć do szkiełka. Jeśli filtr wyschnie, przed umieszczeniem fragmentu filtra na szkiełku nanieść małą kroplę (2 μl) diH2O na środek komory.</li>
</ol>
W krokach 3.8-3.20 zastosowano odczynniki z zestawu ROCHE In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS, zgodnie z procedurami zmodyfikowanymi względem instrukcji producenta. Z wyjątkiem PBS, wszystkie odczynniki są dostarczone w zestawie.
<ol start="8">
<li>Nanieś odpowiednią ilość buforu inkubacyjnego (0,5% albuminy surowicy bydlęcej, 0,1% Tween20 w PBS), aby równomiernie pokryć cały odcinek filtra w komorze inkubacyjnej, tak aby po nałożeniu uszczelnienia nie doszło do przelewania.</li> 
<li>Nałóż poliestrową pokrywkę na ramkę komory inkubacyjnej. Dociśnij, aby szczelnie zamknąć komorę. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza nad filtrem. Inkubuj zamknięte komory przez 10 min w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
<li>Zdejmij poliestrową uszczelkę i otwórz komory inkubacyjne. (Uwaga: otwieranie komór może czasami spowodować oderwanie uszczelki ramki od szkiełka. W takim przypadku należy przygotować nową komorę do kolejnych etapów).</li>
<li>Odpipetuj bufor inkubacyjny z jednego narożnika komory. Unikaj kontaktu z filtrem.</li>
<li>Przemyj filtr, delikatnie pipetując 10 μl PBS do wnętrza komory i z powrotem, powtarzając tę czynność 3 razy.</li>
<li>Przygotuj roztwór roboczy przeciwciał anti-BrdU-FLUOS zgodnie z zaleceniami producenta bezpośrednio przed użyciem.</li>
<li>Nanieś 120 μl roztworu roboczego anti-BrdU-FLUOS na filtr, dbając o równomierne pokrycie całej powierzchni.</li>
<li>Ponownie zamknij komorę nową poliestrową pokrywką. Unikaj pęcherzyków powietrza nad filtrem. Inkubuj komorę w ciemności w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Ten etap pozwoli na znakowanie wbudowanego DNA BrdU in situ izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC).</li>
<li>Zdejmij poliestrową pokrywkę i otwórz komorę inkubacyjną. Odpipetuj roztwór roboczy anti-BrdU-FLUOS. Przemyj filtr 3 razy za pomocą PBS.</li>
<li>Przenieś filtr z komory inkubacyjnej na sterylną powierzchnię. Pokrój odcinek filtra na małe kawałki za pomocą sterylnego ostrza.</li>
<li>Przenieś kawałki filtra do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml, z których każda zawiera 1 ml PBS. Szczelnie zamknij probówkę i zabezpiecz parafilmem. Inkubuj w temperaturze 37 °C przy 20 rpm przez 10 min.</li> 
<li>Umieść probówki w wibratorze typu vortex i mieszaj z maksymalną prędkością przez 5 minut. Odpipetuj nadsącz do sterylnej probówki Eppendorf o pojemności 15 ml. Powtórz etapy inkubacji i vortexowania jeszcze 5 razy. Połącz nadsącz w tej samej probówce Eppendorf 15 ml dla każdej próbki. Zazwyczaj w zawiesinie można odzyskać 80% komórek.</li>
<li>Przechowuj nadsącz z resuspendTime komórkami w temperaturze 4 °C. Sortuj w ciągu 2 dni.</li>
</ol>

4. Analiza FACS
W niniejszym rozdziale opisano procedurę dla cytometru przepływowego BD FACSAria oraz odpowiadającego mu oprogramowania.
<ol>
<li>Zoptymalizować ustawienia cytometru przepływowego zgodnie z zaleceniami producenta. Obejmuje to: regulację kontroli wzmocnienia w celu ustawienia wymaganych parametrów breakoff oraz tzw. sweet spot; optymalizację opóźnienia laserowego i czynników skalowania obszaru dla ciśnienia osłonki eksperymentalnej oraz optymalizację ustawień napięć FSC i SSC, progu FSC, skalowania fluorescencji FSC, napięć PMT fluorescencji itp.</li>
<li>Przeanalizować próbki kontrolne negatywne na cytometrze przepływowym (FCM) w oparciu o intensywność fluorescencji FITC i rozpraszanie boczne (SSC). Zwiększać próg FITC do momentu, aż na wyświetlaczu akwizycji FITC-SSC nie będą widoczne żadne komórki z kontroli negatywnych.</li>
<li>Przeanalizować próbki kontrolne bez dodatków i zbadać wzorzec rozkładu 10 0 komórek na podstawie akwizycji FITC i SSC. Zdefiniować bramkę obejmującą wszystkie komórki i oznaczyć je jako „komórki o niskiej intensywności” (LIs).</li>
<li>Przeanalizować próbki z dodatkiem DOC i zbadać wzorzec rozkładu 10 0 komórek na podstawie FITC i SSC. Część komórek pojawi się w uprzednio zdefiniowanej bramce LI. Zdefiniować kolejną bramkę obejmującą komórki o wyższej intensywności fluorescencji (HIs) niż LIs. Pozyskać statystyki, aby ocenić względną liczebność komórek w bramkach.</li>
<li>Posortować komórki HI do probówek kolekcjonujących zawierających 50 μl PBS w trybie „purify 1 drop”. Przerwać sortowanie, gdy liczba komórek HI osiągnie 50 0 zliczeń.</li>
</ol>
5. Filtrowanie amplifikacji PCR genów 16S rRNA
Procedury PCR z filtrowaniem zostały zmodyfikowane na podstawie pracy Kirchman i wsp. 6
<ol>
<li>Przefiltruj posortowane komórki na biały filtr membranowy z poliwęglanu o rozmiarze porów 0,2 μm i średnicy 25 mm. Odetnij sterylnym ostrzem krawędź filtra, na której nie znajdują się komórki bakteryjne. Podziel filtr na 8 równych części.</li> 
<li>Umieść pojedynczy fragment filtra w probówce do reakcji PCR, tak aby komórki były skierowane do wnętrza probówki. Dodaj do probówki 45 μl wody klasy PCR. Całkowicie zanurz filtr w wodzie.</li>
<li>Dodaj do probówki z reakcją PCR 2 kuleczki ROCHE illustra PuReTaq Read-To-Go PCR Beads i krótko wymieszaj na wortexie. Do każdej probówki dodaj po 2 μl starterów forward i reverse genu 16S rRNA (końcowe stężenie każdego startera 0,4 μM), takich jak 27F i 1492R 7.</li> 
 <li>(Opcjonalnie) Dodaj do mieszaniny reakcyjnej PCR 1 μl roztworu albuminy surowiczej bydlęcej (BSA, stężenie końcowe 30 μg/10 μl), aby pomóc w adsorpcji inhibitorów amplifikacji. W przypadku rezygnacji z dodania BSA, dodaj zamiast tego 1 μl wody.</li>
 <li>Przeprowadź amplifikację PCR w termocyklerze. Zaleca się program touch down PCR, w którym temperatura przyłączania stopniowo spada od 62 do 52°C o 1°C na cykl przez 11 cykli, a następnie następuje 15 cykli z temperaturą przyłączania 52°C. Wszystkie cykle obejmują etapy denaturacji (w 95°C), przyłączania (od 62 do 52°C) i elongacji (w 72°C) o czasie trwania 50 s. Program PCR obejmuje również wstępną denaturację przez 3 min oraz końcową elongację przez 10 min.</li> 
 <li>Potwierdź amplifikację PCR za pomocą elektroforezy na 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Wytnij amplikony PCR z żelu i oczyść je za pomocą zestawu QIAGEN QIAquick gel extraction kit.</li>
 <li>Przeprowadź dwie dodatkowe amplifikacje PCR dla każdej próbki, za każdym razem używając nowej części filtra. Po oczyszczeniu produktów PCR z żelu, połącz amplikony z tej samej próbki. Oczyszczone amplikony 16S rDNA są teraz gotowe do szeregu analiz molekularnych umożliwiających identyfikację taksonomiczną, takich jak konstrukcja biblioteki klonów i sekwencjonowanie.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki: 
Reprezentatywne wyniki opisano na przykładzie badania bakterii degradujących putrescynę. Próbki wody pobrano z obszaru przybrzeżnego stanu Georgia i przetworzono zgodnie z opisanymi powyżej procedurami. Analiza FACS wykazała, że dodatek putrescyny indukuje rozwój grupy bakterii o wysokiej intensywności fluorescencji FITC, co wskazuje na wysoką stopień wbudowania BrdU (Rysunek 1). Komórki te określono jako komórki o wysokim poziomie wbudowania BrdU (HIs), które prawdopodobnie zawierają głównie bakterie degradujące putrescynę. Komórki HIs nie występowały w kontrolach bez dodatku, w których znajdowały się jedynie komórki o niższym poziomie wbudowania BrdU (LIs). Przewidywano, że LIs zawierają głównie bakterioplankton niezdolny do wykorzystania dodanej putrescyny. Komórki HIs posortowano do oddzielnych probówek, a następnie zebrano na filtry membranowe. Amplikony genu 16S rRNA dla komórek HI uzyskano za pomocą metody filter PCR.
<img src="/files/ftp_upload/2855/2855fig1.jpg" alt="Wykresy rozrzutu intensywności fluorescencji w cytometrii przepływowej; FITC vs SSC; analiza BrdU; wzrost drobnoustrojów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Analiza cytometryczna w przepływie próbek kontrolnych bez dodatków oraz próbek z dodatkiem związku modelowego (w tym przykładzie putrescyny), pobranych po 24 h inkubacji. Analiza rozkładu komórek opierała się na (1) intensywności fluorescencji znakowania FITC (oś X), która jest dodatnio skorelowana z poziomem wbudowania BrdU, oraz (2) rozproszeniu bocznym (SSC, oś Y), które jest dodatnio skorelowane z wielkością komórek. Oznaczenia bram oparto na poziomie wbudowania BrdU (HI – wysokie wbudowanie BrdU; LI – niskie wbudowanie BrdU). W odpowiednich bramach przedstawiono względny procent komórek HI i LI.

<ol><li>Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DNA-synthesizing+bacterial+cells+in+coastal+North+Sea+plankton%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).</li>
<li>Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+detection+and+isolation+of+DNA+from+metabolically+active+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).</li>
<li>Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterioplankton+assemblages+transforming+dissolved+organic+compounds+in+coastal+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater.</a> Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).</li>
<li>Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+PCR+for+visualization+of+microscale+distribution+of+specific+genes+and+gene+products+in+prokaryotic+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).</li>
<li>Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodeoxyuridine+%28BrdU%29+immunocytochemistry+by+exonuclease+III+%28Exo+III%29+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion.</a> Histochemistry. 98, 199-199 (1992).</li>
<li>Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+bacterial+communities+in+aquatic+systems+as+revealed+by+filter+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat.+Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR.</a> Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).</li>
<li>Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+stains%3A+ribosomal+RNA-based+probes+for+the+identification+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells.</a> Science. 243, 1360-1360 (1989).</li>
<li>Artursson, V., Jansson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bromodeoxyuridine+immunocapture+to+identify+active+bacteria+associated+with+arbuscular+mycorrhizal+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).</li>
<li>Mou, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+carbon+processing+by+generalist+species+in+the+coastal+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean.</a> Nature. 451, 708-708 (2008).</li>
<li>Mou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+cell+sorting+and+subsequent+molecular+analyses+for+culture-independent+identification+of+bacterioplankton+involved+in+dimethylsulfoniopropionate+transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).</li>
<li>Dean, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Nasze podejście łączy wbudowywanie BrdU, FACS oraz analizę 16S rDNA, co pozwala na identyfikację na poziomie gatunkowym bakterioplanktonu metabolizującego poszczególne komponenty DOC w środowiskach wodnych. Test wbudowywania BrdU znakuje komórki bakteryjne na podstawie aktywności metabolicznej, co umożliwia analizę wyłącznie aktywnych bakterii i tym samym wyklucza komórki w stanie uśpienia. W naszym podejściu wbudowywanie BrdU jest wykrywane immunologicznie in situ, a bakterie o różnych poziomach wbudowania BrdU...

<table><tbody><tr><td>BrdU</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5002-5G</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-5G</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do badania proliferacji komórek in situ, FLUOS</td><td>Zestaw</td><td>Roche Group</td><td>11810740001</td><td>Zużyć więcej przeciwciała Anti-BrdU-FLUOS oraz buforu inkubacyjnego na jedną reakcję, niż sugeruje producent.</td></tr><tr><td>Komory inkubacyjne Frame-Seal</td><td>Materiał</td><td>Bio-Rad</td><td>SLF-1201</td><td></td></tr><tr><td>Filtry membranowe z poliwęglanu (średnica 142 mm, rozmiar porów 1,0 &amp;mu;m)</td><td>Materiał</td><td>EMD Millipore</td><td>FALP14250</td><td></td></tr><tr><td>Filtry membranowe z poliwęglanu (średnica 25 mm, rozmiar porów 0,2 &amp;mu;m)</td><td>Materiał</td><td>EMD Millipore</td><td>FGLP02500</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki do PCR illustra PuReTaq Ready-To-Go</td><td>Zestaw</td><td>GE Healthcare</td><td>27-9559-01</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania DNA z żelu QIAquick</td><td>Zestaw</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>System PCR FailSafe</td><td>Zestaw</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>FS99060</td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie bromodeoksyurydyną (brdu) oraz następujące po nim sortowanie komórek metodą fluorescencji w celu niezależnej od hodowli identyfikacji bakterioplanktonu degradującego rozpuszczony węgiel organiczny

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Mikroby są głównymi czynnikami pośredniczącymi w degradacji licznych substratów rozpuszczonego węgla organicznego (DOC) w środowiskach wodnych. Jednakże identyfikacja taksonów bakteryjnych, które przekształcają konkretne pulle DOC w naturze, stanowi wyzwanie techniczne.
W niniejszej pracy opisujemy podejście łączące wbudowywanie bromodeoksyurydyny (BrdU), fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS) oraz analizę molekularną opartą na genie 16S rRNA, co pozwala na niezależną od hodowli identyfikację bakterioplanktonu zdolnego do degradacji konkretnego związku DOC w środowiskach wodnych. Ustawia się potrójne mikrokosmosy bakterioplanktonu, do których dodaje się zarówno BrdU, jak i modelowy związek DOC (suplementacja DOC), lub tylko BrdU (kontrola bez dodatku). BrdU zastępuje tymidynę w nowo syntetyzowanym bakteryjnym DNA, a znakowane BrdU DNA można łatwo wykryć immunologicznie 1,2. Zakłada się, że podczas 24-godzinnej inkubacji bakterioplankton zdolny do wykorzystania dodanego związku DOC zostanie selektywnie aktywowany, a w konsekwencji wykaże wyższy poziom wbudowania BrdU (komórki HI) niż komórki niewrażliwe w próbkach z suplementacją DOC oraz komórki w kontrolach bez dodatku (komórki o niskim wbudowaniu BrdU, komórki LI). Po fluorescencyjnej immunodetekcji komórki HI zostają odróżnione i fizycznie odseparowane od komórek LI za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) 3. Z posortowanych komórek wrażliwych na DOC (komórki HI) ekstrahuje się DNA, a następnie identyfikuje je taksonomicznie poprzez analizy oparte na genie 16S rRNA, obejmujące PCR, konstrukcję biblioteki klonów oraz sekwencjonowanie.

Środowiskowy bakterioplankton inkubuje się z modelowym związkiem rozpuszczonego węgla organicznego (DOC) oraz odczynnikiem do znakowania DNA, bromodeoksyurydyną (BrdU). Następnie komórki degradujące DOC oddziela się od całej populacji na podstawie zwiększonego wbudowania BrdU przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Komórki te są następnie identyfikowane za pomocą późniejszych analiz molekularnych.

Znakowanie bromodeoksyurydyną (BrdU) oraz następujące po nim sortowanie komórek metodą fluorescencji w celu niezależnej od hodowli identyfikacji bakterioplanktonu degradującego rozpuszczony węgiel organiczny

Mikroorganizmy są głównymi czynnikami pośredniczącymi w degradacji licznych substratów rozpuszczonego węgla organicznego (DOC) w środowiskach wodnych. Jednakże identyfikacja...

Mikroorganizmy pośredniczą w degradacji licznych substratów rozpuszczonego węgla organicznego lub związków DOC w środowiskach wodnych. Aby w pełni zrozumieć rolę mikroorganizmów w transformacji DOC, niezbędna jest jednoczesna identyfikacja ich taksonomii i funkcji. Niniejszy film prezentuje procedurę identyfikacji taksonomicznej wolno żyjących bakterii lub planktonu bakteryjnego, które transformują określone pule DOC w środowiskach wodnych.Próbki wody pobrane ze środowiska testowego są przetwarzane i inkubowane z badanym związkiem oraz bromo-deoksyurydyną (BRDU), która wbudowuje się w nowo syntetyzowany DNA i aktywnie rosnące komórki. Następnie plankton bakteryjny znakowany BRDU jest znakowany przeciwciałami anty-BRDU sprzężonymi z ZI. Plankton bakteryjny o wysokim poziomie znakowania BRDU jest izolowany za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS).Następnie z posortowanych komórek ekstrahuje się DNA, a identyfikację taksonomiczną przeprowadza się na podstawie wyników analizy genu 16 s rRNA z wykorzystaniem techniki PCR. Cześć, nazywam się Steven Robbins i pochodzę z laboratorium dr. Chen Mao z Katedry Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Kent State. Dzisiaj wraz z Lu zaprezentujemy Państwu metodę niezależną od hodowli, służącą do identyfikacji planktonu bakteryjnego degradującego DOC w środowiskach wodnych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wzbogacanie składników odżywczych z późniejszą analizą DNA społeczności bakteryjnej, jest to, że koncentruje ona analizę na bakteriach o wysokiej aktywności i wyklucza komórki uśpione oraz wolno rosnące. Przedstawiamy tutaj identyfikację planktonu bakteryjnego wykorzystującego jeden konkretny związek DOC. Metoda ta może być jednak zastosowana również do badania planktonu bakteryjnego wykorzystującego inny pojedynczy związek DOC lub grupę DLC, takich jak eksudaty algalne.Pobierzmy zatem próbki wody i zacznijmy. Przed przeprowadzeniem analizy próbek wody pod kątem planktonu bakteryjnego degradującego DOC, próbki wody muszą zostać odpowiednio przygotowane. Próbki pokazane tutaj zostały pobrane z wybrzeża Georgii; należy usunąć z nich duże cząstki oraz ER VRE.Użyj pompy perystaltycznej, aby przenieść wodę z gąsiora zbiorczego do jednostki filtracyjnej z filtrem o rozmiarze porów 1 µm. Następnie przenieś 36 ml aliquotów filtrate do trzech sterylnych probówek polipropylenowych o pojemności 50 ml. Każda z nich powinna zawierać 4 ml świeżo przygotowanego 10% roztworu paraformaldehydu. Inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby zakonserwować komórki po inkubacji.Wlej wodę do wieży filtracyjnej szklanego zestawu do filtracji próżniowej z białymi membranami filtracyjnymi o rozmiarze porów 0,22 µm i zastosuj podciśnienie, aby przeciągnąć roztwór przez filtr. Przemyj filtr, przepuszczając przez niego 10 mL PBS za pomocą filtracji próżniowej. Oznacz filtry jako kontrole negatywne i przechowuj je w temperaturze -20 °C.Aby utworzyć eksperymentalny ekosystem lub mikrokosmos, należy najpierw napełnić sześć uprzednio wypłukanych szklanych kolb o pojemności jednego litra 800 mililitrami przefiltrowanej próbki wody. Do każdego mikrokosmosu dodać BRDU do stężenia końcowego 10 micromolar. Kolbę szybko obrócić ręcznie w celu wymieszania zawartości.Każda próbka zostanie poddana analizie w trzech powtórzeniach. Do trzech mikrokosmosów należy zatem dodać modelowy związek DOC. W tym przypadku do mikrokosmosów dodawany jest reine w końcowym stężeniu 100 nanomolar.Następnie do pozostałych trzech mikrokosmosów należy dodać sterylny PBS. Będą one służyć jako kontrole bez DOC. Wszystkie mikrokosmosy należy umieścić w inkubatorze z wytrząsarką ustawionym na 100 RPM, w ciemności, w temperaturze in situ wynoszącej 25 °C. Próbki pobiera się w punktach czasowych 0, 8, 16 i 24 godziny.Pobrać 36 mililitrów z każdego mikrokosmosu do sterylnej probówki z polipropylenu o pojemności 50 mililitrów zawierającej cztery mililitry świeżego 10%paraform aldehydu; inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia komórek. Następnie przefiltrować utrwalone komórki przez białe filtry membranowe o rozmiarze porów 0,22 mikrometra. Przepuścić 10 mililitrów PBS przez filtr próżniowy, aby wypłukać pozostałości PFA.Należy niezwłocznie przejść do detekcji immunologicznej INS in situ lub przechowywać filtry w temperaturze -20 °C w celu analizy inkorporacji BRDU do planktonu bakteryjnego. Rozpocząć należy od doprowadzenia filtrów z próbkami do temperatury pokojowej, aby naruszyć ścianę komórkową bakterii. Umieścić filtr w jednostce filtracyjnej, a następnie pipetą nanieść 1 mL roztworu lizozymu na filtr, aby pokryć komórki, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Po inkubacji zastosuj próżnię, aby usunąć roztwór. Gdy roztwór przejdzie przez filtr, przemyj komórki, dodając 10 mililitrów PBS i ponownie stosując próżnię. Następnie, aby dalej uszkodzić ścianę komórkową, dodaj na filtr jeden mililitr roztworu proteinazy K, tak aby pokrył on komórki.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przemyć PBS, aby uzyskać pojedyncze warstwy DNA. Dodać jeden mililitr roztworu egzonukleazy, aby pokryć komórki na filtrze.Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji przemyć filtr, przepuszczając 10 ml PBS przez filtr próżniowy. Następnie odciąć krawędzie filtra, aby usunąć fragmenty pozbawione komórek.Następnie na suchej powierzchni oczyszczonej alkoholem, przy użyciu sterylnego ostrza, należy pociąć filtr na osiem równych części. Dla każdej próbki wymagane są osiem komór inkubacyjnych z uszczelką ramową; jedną ósmą część filtra należy umieścić w zmontowanej komorze inkubacyjnej z uszczelką ramową stroną z próbką do góry. Po zmontowaniu komór należy użyć zestawu Roche Intu cell proliferation kit do detekcji komórek znakowanych A-B-R-D-U in situ.Po zakończeniu procedur stacjonarnych należy wyjąć sekcję filtra z komory inkubacyjnej i umieścić ją na sterylnej powierzchni; następnie za pomocą sterylnego ostrza pokroić sekcję filtra na małe kawałki. Przenieść kawałki filtra do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml PBS, szczelnie zamknąć probówkę i zabezpieczyć ją parafilmem. Następnie inkubować probówkę w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 37 °C i przy 200 RPM przez 10 minut.Po inkubacji należy zabezpieczyć probówkę i wymieszać ją w wirówce typu vortex z maksymalną prędkością. Przez pięć minut pipetować nadsącz (SUP) do sterylnej polipropylenowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie resuspender filtr w PBS i powtórzyć etapy wirowania w vortexie oraz inkubacji jeszcze dwukrotnie, za każdym razem dodając nadsącz do tej samej probówki o pojemności 15 mililitrów dla każdej próbki.Przechowywać resuspenderowane komórki w temperaturze 4°C. Próbkę należy przeanalizować metodą FACS w ciągu dwóch dni. Na koniec należy przeprowadzić sortowanie komórek w celu wyizolowania populacji o wysokim poziomie wbudowania BrDU.W niniejszym protokole wykorzystano cytometr przepływowy BD FACS oraz odpowiednie oprogramowanie. Po posortowaniu komórek można przeprowadzić analizę populacji wzbogaconej w BrDU w celu określenia jej tożsamości taksonomicznej. Aby przeprowadzić PCR w celu amplifikacji genów 16S rRNA posortowanych bakterii, należy pipetować posortowane komórki na białą membranę filtracyjną z poliwęglanu o rozmiarze porów 0.22 µm, włączyć pompę próżniową, a następnie za pomocą sterylnego ostrza odciąć brzegi filtra wolne od komórek.Podziel filtr na cztery równe części dla każdego z warunków, a następnie umieść pojedynczy fragment filtra w każdej z trzech probówek do PCR, tak aby komórki były skierowane do wnętrza probówki. Dodaj 45 µL wody klasy PCR. Pozostaw fragment filtra do całkowitego zanurzenia w wodzie.Następnie należy dodać dwa koraliki Roche illustra pure T ready to go PCR i krótko zawirulować próbkę, aby pomóc w rozpuszczeniu koralików. Następnie dodaje się po 2 µL starterów forward i reverse dla genu 16 s ribosomal RNA.Należy dodać jeden mikrolitr BSA w celu pomocy w absorpcji inhibitorów amplifikacji lub jeden mikrolitr wody. Następnie przeprowadza się amplifikację PCR w termocyklerze. Zalecane jest zastosowanie programu touchdown PCR, w którym temperatura przyłączania sukcesywnie obniża się od 62 do 52 °C o jeden stopień Celsjusza w każdym cyklu, a następnie wykonuje się 15 cykli w temperaturze 52 °C.Potwierdź amplifikację PCR za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych 1% barwionych bromkiem etydinium, wytnij amplikony PCR z żelu i oczyść je za pomocą zestawu KaiGen cayo quick gel extraction kit. Po oczyszczaniu żelowym PCR połącz amplikony z tej samej próbki. Oczyszczone amplikony rybosomalnego DNA 16 s są teraz gotowe do szeregu analiz molekularnych.Próbki pobrano z obszaru nadmorskiego w stanie Georgia i poddano obróbce w celu zbadania bakterii degradujących racinę, zgodnie z procedurami opisanymi w tym filmie. Racina jest związkiem poliamidowym, który powszechnie występuje w środowiskach morskich. Może ona służyć jako źródło substancji odżywczych i energii dla bakterii morskich, co pokazano tutaj.Analiza faktów dotycząca próbek wykazała, że po 24-godzinnej inkubacji w mikrokosmosach wzbogaconych o Racine rozwinęła się grupa bakterii o wyższej intensywności fluorescencji FXI, która była dodatnio skorelowana ze stopniem wbudowania BRDU. Komórki te określono jako komórki o wysokim wbudowaniu BRDU lub HI i oczekiwano, że będą one zawierać głównie bakterie degradujące Racine. Brak HI.Komórki stwierdzono w kontrolach bez dodatków, które zawierały jedynie komórki z niższym poziomem wbudowania BRDU, określane jako komórki lii; oczekiwano, że będą one zawierały głównie plankton bakteryjny, który nie był w stanie go wykorzystać. Dodane komórki Racine HI zostały posortowane do oddzielnych probówek, a następnie zebrane na filtry membranowe. Częściowe amplikony genu 16S rRNA uzyskano po przeprowadzeniu reakcji PCR z filtra i potwierdzono za pomocą elektroforezy żelowej.Po filtracji sortującej można również przeprowadzić amplifikację PCR genów funkcjonalnych, aby zbadać różnorodność funkcjonalną wśród posortowanych komórek. Przedstawiliśmy sposób fizycznej separacji i identyfikacji funkcjonalnych komórek bakteryjnych w środowisku wodnym przy użyciu podejścia łączącego sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i wbudowywanie BrDU. Pamiętaj, że BrDU jest szkodliwe; podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić fartuch laboratoryjny i rękawiczki.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

bromodeoxyuridine-brdu-labeling-subsequent-fluorescence-activated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oznaczanie bromodeoxyurydyny (BrdU) i następujące sortowanie komórek w oparciu o aktywację fluorescencji w celu niezależnej od hodowli identyfikacji bakterioplanktonu rozkładającego rozpuszczony węgiel organiczny

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Śledzenie subtelnych zmian w progresji i kinetyce etapów cyklu komórkowego można przeprowadzić, stosując połączenie metabolicznego znakowania kwasów nukleinowych BrdU oraz barwienia całkowitej genomowej DNA jodeczkiem propidyny. Metoda ta eliminuje konieczność chemicznej synchronizacji dzielących się komórek, zapobiegając tym samym wprowadzaniu nieswoistych uszkodzeń DNA, które z kolei wpływają na przebieg cyklu komórkowego.

Pomiar kinetyki progresji cyklu komórkowego z wykorzystaniem znakowania metabolicznego i cytometrii przepływowej

Opisana jest ilościowa metoda analizy czasu replikacji chromosomów. Metoda wykorzystuje inkorporację BrdU w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu oceny czasu replikacji chromosomów ssaków. Technika ta pozwala na bezpośrednie porównanie przegrupowanych i nieprzegrupowanych chromosomów w tej samej komórce.

Czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ

Film opisuje stopniowy test znakowania impulsowego komórek ssaków za pomocą bromodeoksyurydyny (BrdU) do pomiaru proliferacji komórek. Wychwyt BrdU pozwala na czasowe śledzenie komórek, które znajdowały się w fazie syntezy w określonym momencie, bez konieczności synchronizacji komórek.

Test znakowania impulsowego bromodeoksyurydyny: technika pomiaru proliferacji komórek

Ten film opisuje protokół barwienia immunofluorescencyjnego BrdU. Technika ta pozwala na identyfikację komórek w różnych fazach cyklu komórkowego. Dodanie barwników DNA i znakowanie przeciwciał pozwala na szczegółową analizę losów komórek fazy S w późniejszym czasie.

Barwienie immunofluorescencyjne BrdU: technika identyfikacji komórek w różnych fazach cyklu komórkowego

Ten protokół opisuje wykorzystanie wychwytu bromodeoksyurydyny (BrdU), aby umożliwić czasowe śledzenie komórek, które były w fazie S w określonym momencie. Dodanie barwników DNA i znakowanie przeciwciałami ułatwia szczegółową analizę losów komórek fazy S w późniejszym czasie.

Czasowe śledzenie progresji cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej bez konieczności synchronizacji

Lasery są często używane w badaniach nad odpowiedzią komórkową na uszkodzenie DNA. Generują jednak zmiany, których odstępy, częstotliwość i kolizje z widełkami replikacyjnymi są rzadko charakteryzowane. W tym miejscu opisujemy podejście, które umożliwia określenie tych parametrów za pomocą laserowo zlokalizowanych wiązań międzypasmowych.

Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

Prezentowany tutaj jest protokół dla techniki opartej na mikroskopii epifluorescencyjnej dla pojedynczej komórki, do ilościowego określania wskaźników wypasu u wodnych drapieżnych eukariontów z wysoką precyzją i rozdzielczością taksonomiczną.

Fluorescencyjnie znakowane bakterie jako znacznik w celu ujawnienia nowych szlaków przepływu węgla organicznego w ekosystemach wodnych

Ten protokół przedstawia szybki test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) w ciągu 2,5 godziny poprzez stymulowane pojedynczymi komórkami obrazowanie metabolizmu D2O. Metoda ta ma zastosowanie do bakterii w moczu lub środowisku krwi pełnej, które są transformujące dla szybkiego jednokomórkowego fenotypowego AspAT w klinice.

Szybkie badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana indukcji deuteru w pojedynczej bakterii

W obecnym protokole pokazujemy, jak wizualizować dwuniciową resekcję końca DNA podczas fazy S/G2 cyklu komórkowego przy użyciu metody opartej na immunofluorescencji.

Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego

Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Poznaj metodę znakowania BrdU i sortowania FACS do identyfikacji bakterioplanktonu rozkładającego węgiel organiczny w środowiskach wodnych. Technika umożliwia izolację aktywnie rosnących komórek degradujących DOC.

Znakowanie bromodeoksyurydyną (BrdU), a następnie sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu identyfikacji niezależnego od hodowli rozpuszczonego organicznego bakterioplanktonu rozkładającego węgiel (Wideo) | JoVE Journal

Znakowanie bromodeoksyurydyną (BrdU) oraz następujące po nim sortowanie komórek metodą fluorescencji w celu niezależnej od hodowli identyfikacji bakterioplanktonu degradującego rozpuszczony węgiel organiczny

Przeglądaj więcej filmów