Znakowanie bromodeoksyurydyną (BrdU), a następnie sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu identyfikacji niezależnego od hodowli rozpuszczonego organicznego bakterioplanktonu rozkładającego węgiel

Mikroorganizmy pośredniczą w degradacji licznych rozpuszczonych substratów węgla organicznego lub związków DOC, takich jak Racine i środowiska wodne. Aby w pełni zrozumieć rolę drobnoustrojów w transformacji DOC, konieczna jest jednoczesna identyfikacja ich taksonomii i funkcji. Ten film przedstawia procedurę identyfikacji taksonomicznej wolno żyjących bakterii lub planktonu bakteryjnego, które przekształcają określone pule DOC i środowiska wodne.

Próbki wody pobrane ze środowiska testowego są przetwarzane i inkubowane z interesującym związkiem i bromodeoksyurydyną, BRDU, która włącza się do nowo zsyntetyzowanego DNA i aktywnie rosnących komórek. Następnie plankton bakteryjny znakowany BRDU jest znakowany sprzężonymi przeciwciałami anty BRDU ZI. Plankton bakteryjny o wysokim poziomie znakowania BRDU jest izolowany przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją.

DNA jest następnie ekstrahowane z posortowanych komórek, a identyfikacja taksonomiczna jest przeprowadzana na podstawie wyników analizy genu 16 s rybosomalnego RNA opartego na PCR. Cześć, nazywam się Steven Robbins i pracuję w laboratorium dr Chen Mao na Wydziale Nauk Biologicznych Uniwersytetu Stanowego w Kent. Dzisiaj s lu i ja pokażemy Wam niezależną od hodowli metodę identyfikacji planktonu bakteryjnego rozkładającego DOC w środowisku wodnym.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak modyfikowanie składników odżywczych, a następnie analiza DNA społeczności bakteryjnej, jest to, że koncentruje analizę na wysoce aktywnych bakteriach i wyklucza uśpione i wolno rosnące komórki. Pokazujemy tutaj identyfikację bakterii babki lancetowatej, które wykorzystują jeden konkretny związek DOC. Ale ta metoda może być również zastosowana do badania planktonu bakteryjnego, który wykorzystuje inny pojedynczy związek DOC lub grupę DLC, takich jak wysięki z glonów.

Zbierzmy więc próbki wody i zacznijmy. Przed pobraniem próbek wody na obecność planktonu bakteryjnego rozkładającego DOC, próbki wody muszą zostać odpowiednio przetworzone. Pokazane tutaj próbki zostały pobrane z wybrzeży Gruzji w celu usunięcia dużych cząstek i ER VRE z próbki wody.

Użyj pompy perystaltycznej, aby przenieść wodę z pojemnika zbiorczego do jednostki filtracyjnej z filtrem o wielkości porów jednego mikrometra. Następnie przenieś 36 mililitrowych podwielokrotności filtratu do trzech sterylnych 50-mililitrowych probówek polipropylenowych. Każdy zawiera cztery mililitry świeżo przygotowanego 10% roztworu aldehydu Paraform Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby zachować komórki po inkubacji.

Wlej wodę do wieży filtracyjnej szklanej jednostki filtrującej próżniowej z białymi filtrami membranowymi o wielkości porów 0,22 mikrometra i zastosuj próżnię, aby przeciągnąć roztwór. Umyj filtr, aplikując 10 mililitrów PBS przez filtr próżniowy. Oznacz filtry jako kontrole ujemne i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Aby stworzyć eksperymentalny ekosystem lub mikrokosmos, zacznij od napełnienia sześciu jednolitrowych, wstępnie wypłukanych szklanych kolb 800 mililitrami wstępnie przefiltrowanej próbki wody. Dodaj BRDU do każdego mikrokosmosu do końcowego stężenia 10 mikromolowych. Szybko obrócić kolbę ręcznie, aby wymieszać.

Każda próbka zostanie poddana testom i trzykrotnie poddana obróbce. Tak więc do trzech mikrokosmosów dodaj modelowy związek DOC. Tutaj reine jest dodawana do mikrokosmosów w końcowym stężeniu 100 nanomolowców.

Następnie do pozostałych trzech mikrokosmosów dodaj sterylny PBS. Będą one służyć jako kontrole bez DOC, umieszczając wszystkie mikrokosmosy w inkubatorze wstrząsającym o prędkości 100 obr./min w ciemności w temperaturze insitu, która wynosi 25 stopni Celsjusza. Tutaj w punktach czasowych 0, 8, 16 i 24 godzin.

Zbierz 36 mililitrów z każdego mikrokosmosu w 50-mililitrowej sterylnej probówce polipropylenowej zawierającej cztery mililitry świeżego 10% aldehydu paraformowego, inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki. Następnie przefiltruj zakonserwowane komórki przez białe filtry membranowe o wielkości porów 0,22 mikrometra. Przełóż 10 mililitrów PBS przez filtr próżniowy, aby zmyć pozostałości PFA.

Natychmiast przystąp do detekcji immunologicznej INS situ lub przechowuj filtry w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby przeprowadzić test na włączenie BRDU do planktonu bakteryjnego. Zacznij od wrzucenia filtrów do próbek w temperaturze pokojowej, aby naruszyć ścianę komórkową bakterii. Umieść filtr na jednostce filtracyjnej, a następnie odpipetuj jeden mililitr roztworu lizozymu na filtr, aby przykryć komórki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Po inkubacji zastosować próżnię, aby usunąć roztwór. Gdy roztwór przejdzie przez filtr, umyj komórki, dodając 10 mililitrów PBS i zastosuj próżnię. Następnie, aby jeszcze bardziej naruszyć ścianę komórkową, dodaj jeden mililitr roztworu proteinazy K do filtra, aby pokryć komórki.

Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przemyć PBS, aby wytworzyć pojedyncze warstwy DNA. Dodaj jeden mililitr roztworu egzonukleazy, aby przykryć komórki na filtrze.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji umyj filtr, przepuszczając 10 mililitrów PBS przez filtr próżniowy. Następnie odetnij krawędzie filtra, aby usunąć część, która nie ma komórek.

Następnie na suchej powierzchni oczyszczonej alkoholem użyj sterylnego ostrza, aby pokroić filtr na osiem równych kawałków. Do każdej próbki potrzebnych jest osiem komór inkubacyjnych z uszczelnieniem ramy, umieścić jedną ósmą filtra w zmontowanej komorze inkubacyjnej z uszczelnieniem ramy stroną do góry. Po zmontowaniu komór użyj zestawu do proliferacji komórek Roche Intu do wykrywania komórek znakowanych A-B-R-D-U in situ.

Po zakończeniu procedur stojących wyjmij sekcję filtra z komory inkubacyjnej i umieść ją na sterylnej powierzchni za pomocą sterylnego ostrza, pokrój sekcję filtra na małe kawałki. Przenieś kawałki filtra do dwumililitrowej mikrorurki wirówkowej zawierającej jeden mililitr PBS, szczelnie zamknij probówkę i uszczelnij ją paraformem. Następnie inkubować probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez 10 minut.

Po inkubacji zabezpiecz rurkę i wiruj ją z maksymalną prędkością. Przez pięć minut pipetować natant SUP do sterylnej 15-mililitrowej probówki polipropylenowej. Następnie ponownie zawieś filtr w PBS i powtórz etapy wirowania i inkubacji jeszcze dwa razy za każdym razem, dodając snat do tej samej 15-mililitrowej probówki dla każdej próbki.

Zawieszone komórki należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Próbka powinna zostać przeanalizowana faksem w ciągu dwóch dni. Na koniec posortuj komórki, aby uzyskać populację o wysokim poziomie włączenia BRDU.

W tym przypadku używany jest cytometr przepływowy obszaru faksu BD i odpowiednie oprogramowanie. Po posortowaniu komórek można oznaczyć populację wzbogaconą w BRDU w celu określenia jej tożsamości taksonomicznej. Aby amplifikować 16 s rybosomalnych genów RNA rodzaju PCR filtra bakteryjnego, należy pipetować posortowane komórki na biały filtr membranowy z poliwęglanu o wielkości 0,22 pora i włączyć pompę próżniową za pomocą sterylnego ostrza, aby odciąć wolne od komórek krawędzie filtra.

Pokrój filtr na cztery równe części dla każdego stanu, umieść pojedynczy kawałek filtra w każdej z trzech probówek reakcyjnych PCR z komórkami skierowanymi do wewnątrz probówki. Dodaj 45 mikrolitrów wody klasy PCR. Pozwól, aby sekcja filtra całkowicie zanurzyła się w wodzie.

Następnie dodaj dwa gotowe do użycia koraliki Roche illustra pure T do PCR, aby na krótko odwirować, aby pomóc rozpuścić koraliki. Następnie dodaj po dwa mikrolitry rybosomalnego do przodu i do tyłu 16 s. Startery genów RNA.

Dodaj jeden mikrolitr BSA, aby pomóc wchłonąć inhibitory amplifikacji lub jeden mikrolitr wody. Wykonaj amplifikację PCR na termocyklerze. Zalecany jest program touchdown PCR, w którym temperatura klęczenia A sekwencyjnie spada z 62 do 52 stopni Celsjusza o jeden stopień Celsjusza na cykl, a następnie następuje 15 cykli w temperaturze 52 stopni Celsjusza.

Potwierdź amplifikację PCR za pomocą elektroforezy na C barwionych bromkiem 1% żeli Agros, wytnij amplikony PCR z żelu i wyczyść za pomocą zestawu do szybkiej ekstrakcji żelu KaiGen cayo. Po oczyszczeniu żelu PCR należy połączyć amplikony tej samej próbki. Oczyszczone amplikony 16-s rybosomalnego DNA są teraz gotowe do przeprowadzenia szeregu analiz molekularnych.

Próbki pobrano z przybrzeżnego miejsca w Gruzji i przetworzono w celu zbadania bakterii rozkładających Racine'a zgodnie z procedurami opisanymi w tym filmie. Racyna to związek poliamoryczny, który można powszechnie znaleźć w środowisku morskim. Może służyć jako składnik odżywczy i źródło energii dla bakterii morskich, jak pokazano tutaj.

Analiza faktów w próbkach wykazała, że po 24-godzinnej inkubacji w mikrokosmosach Racine'a rozwinęła się grupa bakterii o wyższym poziomie intensywności fluorescencji FXI, który był dodatnio związany z zakresem inkorporacji BRDU. Komórki te zostały oznaczone jako komórki o wysokiej inkorporacji BRDU lub HI i spodziewano się, że będą zawierać głównie bakterie rozkładające Racine'a. Nie, cześć.

Komórki znaleziono w kontrolach bez dodawania, które zawierały tylko komórki o niższych poziomach włączenia BRDU, określane jako komórki lii, które miały zawierać głównie plankton bakteryjny, którego nie były w stanie wykorzystać. Dodane komórki Racine HI posortowano do oddzielnych probówek, a następnie zebrano na filtrach membranowych. Częściowe amplikony genu 16 rybosomalnego RNA uzyskano po PCR z filtrem i potwierdzono elektroforezą żelową.

Po filtrze sortującym można również przeprowadzić amplifikację PCR funkcjonalnych genów w celu zbadania różnorodności funkcjonalnej wśród posortowanych komórek. Właśnie pokazaliśmy, jak fizycznie oddzielić i zidentyfikować funkcjonalne komórki bakteryjne w środowisku wodnym przy użyciu podejścia, które łączy sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie i włączenie BRDU. Pamiętaj, że BIDU to głowa ziemi, fartuch laboratoryjny i glos powinny być zawsze noszone podczas wykonywania tej procedury.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.