Znakowanie ReAsH/FlAsH i analiza obrazu białek czujnika tetracysteiny w komórkach

Ogólnym celem tej procedury jest znakowanie komórek wyrażających tetracysteinę i fluorescencyjnie znakowane białko barwnikami flash lub popiół oraz ilościowa analiza wyników. Osiąga się to poprzez pierwszą transekcję, plazmid przenoszący białko fluorescencyjne i białko docelowe zawierające znacznik tetracysteiny do interesującej nas linii komórkowej. Następnie ekspresję białka znakuje się za pomocą R lub flash, a niespecyficznie związana dieta jest usuwana przez przemycie BAL w celu przygotowania do obrazowania mikroskopowego.

Następnie za pomocą mikroskopu konfokalnego zbiera się obrazy fluorescencyjne komórek z kanałami popiołu lub błysku i fluorescencyjnymi kanałami białkowymi. Na koniec obrazy są analizowane przy użyciu obrazu J w celu ilościowego określenia wiązania popiołu lub błysku z białkiem docelowym. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują stopień wiązania popiołu lub błysku z białkiem docelowym w komórkach poprzez korelację fluorescencji popiołu z fluorescencyjną fluorescencją białka.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak po prostu pobieranie białka docelowego za pomocą GFP, jest to, że oprócz jego lokalizacji można śledzić drugą właściwość białka, taką jak zmiana konformacyjna. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie podstruktury i funkcji białek, takie jak zdarzenia izyjne, zmiany konformacyjne i zdarzenia wiązania LI, które zmieniają zdolność TAC do blokowania popiołu lub błysku. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy chcieliśmy ocenić, jak małe submikroskopijne poligamiczne met Huntingtona tworzą się w komórkach.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etap analizy danych jest trudny do nauczenia, ponieważ jest technicznie złożony. Kroki od pierwszego do trzeciego polegają na tym, że Yasmin Ranson, asystentka naukowa z naszego laboratorium, zademonstruje analizę danych. Krokiem czwartym będzie Sevki GaN, doktorant z naszego laboratorium, który wykorzystuje standardowe metody hodowli komórkowej dla interesującej Cię linii komórkowej oraz szkiełko do obrazowania żywych komórek gotowe do transfekcji.

Przygotuj hodowlę komórek adhezyjnych, przetransfekuj plazmid zawierający interesujący Cię gen znacznika TC. Zgodnie z wybraną metodą transfekcji, ważne jest, aby mieć kontrole pozytywne i negatywne, aby ocenić zakres specyficznego wiązania ze znacznikami TC, a także ocenić przepływ fluencji wybielacza między kanałami podczas pobierania mikrofotografii konfokalnych. Dlatego dla dwóch kolorów upewnij się, że próbki są przygotowane dla pojedynczych kolorów, albo samego białka fluorescencyjnego, a jeśli to możliwe, białka T ctech związanego z miąższem lub vs.

Ale bez białka fluorescencyjnego. Jeden do dwóch dni po transfekcji delikatnie przepłucz komórki 300 mikrolitrami przedwojennego roztworu soli równoważącej Hanka lub HBSS, przygotuj świeży wstępnie ciepły HBSS z 10 mikromolowymi, jednym, dwoma, et Ethan dia tiol lub EDT i jeden mikromolowy błysk lub popiół. A po usunięciu HBSS z komórek, delikatnie zastąp 300 mikrolitrami pożywki popiołowej inkubować dokładnie przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych.

Z naszego doświadczenia wynika, że dłuższe czasy inkubacji znacznie zwiększają fluorescencję tła. Delikatnie odessać roztwór etykietujący z komórek i zastąpić go 300 mikrolitrami wstępnie podgrzanego HBSS z 250 mikromolami, dwoma trzema dimerami, propanolem lub BAL przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń roztwór myjący przez delikatne zasysanie i zastąp go 300 mikrolitrami wstępnie podgrzanego HBSS.

Po tym przemyciu komórki mogą być utrwalone z wysokością paraformu, chociaż stwierdziliśmy, że zwiększa to niespecyficzną cyniczną fluorescencję. W związku z tym zwykle obrazujemy komórki na żywo w temperaturze pokojowej. Ponadto utrwalenie komórek przed znakowaniem zapobiega wiązaniu barwnika bialnego.

Aby rozpocząć obrazowanie komórek pod mikroskopem konfokalnym, należy ustawić parametry obrazowania poszczególnych fluoroforów i upewnić się, że między kanałami występuje znikome krwawienie. Następnie dostosuj ustawienia mnożnika zdjęć tak, aby maksymalna fluorescencja w próbce nie nasycała detektora. Po ustaleniu najlepszych ustawień obrazowania nie należy zmieniać żadnego z nich między próbkami.

Użyj częstotliwości skanowania 200 Hz, zbierz cztery średnie liniowe i ustaw średnicę otworka na jedną jednostkę powierzchni. Średnicę otworu można zwiększyć, jeśli problemem jest stosunek sygnału do szumu. Może to jednak spowodować pewną utratę rozdzielczości obrazowania.

Jeśli to możliwe, zbierz obrazy konfokalne w formacie 12-bitowym lub wyższym. Aby zmaksymalizować jakość analizy danych ilościowych. Zbierz obrazy dla kanału białka fluorescencyjnego, a także dla kanału matrycy arsenału BI dla wszystkich próbek.

Aby przeanalizować dane, użyj oprogramowania Image J z następującymi wtyczkami. Jeśli używasz wersji obrazu J starszej niż wersja 1.32 C, kliknij następujące opcje. Aby umożliwić otwieranie wielu obrazów jednocześnie, edytuj opcje wejściowe wyjście ukośnika, kliknij pole, aby użyć selektora plików j do otwarcia udziału ukośnika.

Kliknij w porządku. Otwórz interesujące Cię obrazy. Obraz J automatycznie zdefiniuje maksymalną i minimalną intensywność pikseli, które są wyświetlane na ekranie dla każdego obrazu osobno, ponieważ różne obrazy będą miały różne intensywności pikseli.

Oznacza to, że wyświetlane obrazy nie są porównywalne z oglądanymi. Aby upewnić się, że wszystkie otwarte obrazy są w tej samej skali, fizycznie zdefiniuj intensywność górnych i dolnych pikseli, które mają być wyświetlane. Aby ustawić te wartości, wybierz obraz, dostosuj jasność i kontrast ukośnika.

Kliknij na ustaw, określ minimalne i maksymalne wyświetlane wartości. Następnie wybierz propaguj do wszystkich otwartych obrazów i kliknij OK. Możesz też umieścić wszystkie obrazy dla danego kanału razem w jednym pliku lub stosie.

Obraz J automatycznie dostosuje wszystkie obrazy do tej samej skali. Aby to zrobić, wybierz obraz Stosy obrazów do stosu wprowadź nazwę wspólną dla każdego pliku i wybierz używane tytuły jako etykiety. Kliknij w porządku.

Konwertuj wszystkie otwarte obrazy na ośmiobitowe w celu analizy. Wybranie typu obrazu ośmiobitowego spowoduje przeskalowanie wyświetlanego zakresu do interwału od zera do 255. Ważne jest, aby nie zapisywać oryginalnego formatu 12-bitowego lub wyższego, ponieważ spowoduje to utratę zawartości informacji.

Zapisz kopię w nowym folderze o nazwie konwertowany ośmiobitowo przy użyciu opcji Zapisz jako. Jedną z metod badania zakresu wiązania matrycy bi arsal na całym obrazie jest wykonanie wykresu korelacji intensywności pikseli. Na tym wykresie wykreślana jest wartość każdego piksela w jednym kanale względem odpowiadającej mu wartości piksela w drugim kanale.

W związku z tym pozycja piksela o wysokiej fluorescencji GFP będzie również wysoka przy fluorescencji popiołu, jeśli występuje wysokie wiązanie. Aby przeanalizować korelację pikseli, upewnij się, że ośmiobitowe obrazy REA i GFP są otwarte na obrazie J.Następnie otwórz wtyczkę korelatora obrazów, wybierając korelator obrazu wtyczki. Przypisz pliki obrazów do obrazu pierwszego i obrazu drugiego.

Następnie kliknij OK. Wynikowy stos może nie wyświetlać żadnych szczegółowych informacji. To normalne.

Zapisz stos w nowym folderze o nazwie wykresy rozrzutu i nadaj mu taką samą nazwę pliku, jak przykład, do którego się odwołuje. Na przykład wykres korelacji Ash GFP. Aby wyświetlić dane, wybierz jedną z dwóch opcji.

Najpierw przekształć dane tak, aby były formatem dziennika, wybierając opcję process math log auto. Następnie, aby wizualnie przeskalować dane, kliknij obraz, dostosuj jasność, kontrast ukośnika i wybierz automatycznie. Po drugie, przeskaluj dane wizualnie, aby pokazać tylko niskie wartości i wyświetl dane za pomocą specjalnej tabeli przeglądowej lub LUT, aby utworzyć niestandardową tabelę LUT.

Kliknij LUT edycji koloru obrazu, aby uzyskać bardzo prosty LUT. Kliknij lewy górny piksel i wybierz kolor. Następnie wybierz następny piksel po prawej stronie i wybierz kolor czerwony.

Następnie kliknij trzeci piksel i przytrzymując przycisk myszy, przeciągnij zaznaczenie do prawego dolnego piksela. Wybierz kolor czerwony, kliknij przycisk OK, a następnie wybierz kolor biały i kliknij przycisk OK. Wybierz zakres kontrastu ukośnika jasności od zera do 255 zgodnie z wcześniejszym opisem, aby zablokować obraz w obrazie wyświetlanym na ekranie.

Konwertuj go do formatu RGB, aby kopiować i wklejać obrazy do innych programów. Najpierw otwórz obrazy ośmiobitowe lub 16-bitowe zgodnie z wcześniejszym opisem. Przypisz schemat kolorów LUT do obrazów dla GFP.

Przypisz zieloną tablicę LUT, klikając obraz. Tabele wyszukiwania są zielone. Na koniec wybierz obraz do skopiowania i skopiuj go do schowka Wybierając opcję edytuj kopiowanie do systemu, ten rysunek pokazuje typowy wynik dla połączonej skarpety kinazy, GFP i znacznika TC, który był barwiony przez 30 minut.

W przypadku popiołu w komórkach HEC 2 9 3 wydaje się, że popiół skutecznie wiąże się z białkiem docelowym niosącym znacznik TC o wysokim powinowactwie. W przeciwieństwie do tego, rysunek ten przedstawia odpowiednią próbkę kontrolną SARK połączonej z GFP, ale pozbawioną znacznika TC, który jest niezbędny do weryfikacji zarówno specyficzności znacznika TC, jak i poziomu zabarwienia tła. Wynik ten pokazuje, że RH nie ma reaktywności z białkiem docelowym, brakuje mu znacznika TC, co wskazuje na specyficzność znacznika TC do wiązania SSH.

Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać, aby nie dopuścić do zlewania się komórek i uspokojenia, ponieważ wpłynie to na wiązanie V w komórkach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak po prostu analizować dane ilościowo, i możesz udoskonalić te metody, aby opracować własne, unikalne IUTS do wizualizacji danych.