Name: Znakowanie ReAsH/FlAsH i analiza obrazu białek czujnika tetracysteiny w komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Poznaj metodę znakowania białek z motywem tetracysteiny za pomocą barwników FlAsH i ReAsH w żywych komórkach. Technika umożliwia ilościową analizę wiązania i obserwację konformacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantów przyznanych DMH i TDM (granty projektowe NHMRC). DMH jest stypendystą Grimwade Fellow, finansowanym przez Miegunyah Trust.

1. Przygotowanie komórek do znakowania za pomocą ReAsH/FlAsH
<ol>
	<li>Stosując standardowe metody hodowli komórkowej dla wybranej linii komórkowej, przygotuj hodowlę komórek adherentnych bezpośrednio na szkiełku do obrazowania żywych komórek, gotowym do transfekcji.</li>
	<li>Przeprowadź transfekcję plazmidu zawierającego gen zainteresowania z tagiem TC, stosując wybraną metodę transfekcji.</li>
</ol>
Należy pamiętać, że ważne jest zastosowanie kontroli pozytywnych i negatywnych w celu oceny stopnia specyficznego wiązania z tagami TC oraz oceny przenikania fluorescencji między kanałami podczas pozyskiwania mikrografii konfokalnych. Z tego względu, w przypadku dwóch kolorów (np. kombinacji FlAsH/Cherry, ReAsH/CFP lub ReAsH/GFP), należy upewnić się, że przygotowano próbki dla pojedynczych kolorów (np. samo białko fluorescencyjne lub, jeśli to możliwe, białko z tagiem TC związane z FlAsH/ReAsH, ale bez białka fluorescencyjnego)
<ol start="3">
	<li>Od jednego do dwóch dni po transfekcji delikatnie wypłucz komórki 300 μL podgrzanego (do 37 °C) HBSS.</li>
	<li>Delikatnie zanurz komórki w 300 μL podgrzanego HBSS zawierającego 1 μM FlAsH (lub ReAsH) oraz 10 μM 1,2-etanoditiolu (EDT).</li>
</ol>
Ważne jest, aby najpierw dodać EDT przed dodaniem FlAsH/ReAsH oraz przygotować bufor bezpośrednio przed dodaniem go do komórek. Inkubować dokładnie przez 30 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych. W naszym doświadczeniu dłuższy czas inkubacji znacząco zwiększa fluorescencję tła. Nowe konstrukty powinny zostać również zoptymalizowane pod kątem czasu znakowania i stężenia FlAsH/ReAsH (0,5-2 μM).
<ol start="5">
	<li>Ostrożnie odessać roztwór znakujący z komórek, a następnie zastąpić go 300 μL uprzednio ogrzanego HBSS + 250 μM 2,3-dimerkaptopropanolu (BAL) i inkubować przez 15 min w 37 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór płuczący poprzez ostrożne odessać i zastąpić go 300 μL uprzednio ogrzanego HBSS.</li>
</ol>
Po tym płukaniu komórki można utrwalić paraformaldehydem (15 min w 3,2% roztworze), choć zauważyliśmy, że zwiększa to nieswoistą fluorescencję barwnika biarsenowego. Dlatego zazwyczaj obrazujemy żywe komórki w temperaturze pokojowej. (Należy pamiętać, że utrwalenie komórek przed znakowaniem zapobiega wiązaniu barwnika biarsenowego).
2. Obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego
<ol>
	<li>W mikroskopie konfokalnym skonfigurować parametry obrazowania dla poszczególnych fluoroforów (patrz Tabela 1) i upewnić się, że przenikanie sygnału (bleedthrough) między kanałami jest pomijalne. Można to osiągnąć, sprawdzając poszczególne fluorofory (w próbkach kontrolnych) przy każdym z różnych ustawień akwizycji fluorescencji. Regulacja zakresu długości fali emisji może pomóc zminimalizować przenikanie sygnału (choć może to również zmniejszyć stosunek sygnału do szumu).</li>
	<li>Należy również dostosować ustawienia fotopowielacza tak, aby maksymalna fluorescencja w próbce nie nasycała detektora. (Można to wykryć, korzystając z ustawienia Q-LUT w mikroskopie konfokalnym Leica SP2). Po ustaleniu optymalnych parametrów obrazowania nie należy ich zmieniać pomiędzy próbkami.</li>
	<li>Inne zazwyczaj stosowane przez nas ustawienia (które można jednak zoptymalizować) to prędkość skanowania 200 Hz, uśrednianie 4 linii oraz średnica otworu (pinhole) wynosząca 1 jednostka Airy. Średnicę otworu można zwiększyć, jeśli stosunek sygnału do szumu jest zbyt niski, jednak może to skutkować pewną utratą jakości obrazowania.</li>
	<li>Obrazy konfokalne należy zbierać w formacie 12-bitowym (lub wyższym), jeśli to możliwe. Format 12-bitowy rejestruje większy zakres dynamiczny wartości (0-4095) dla intensywności każdego piksela niż format 8-bitowy (0-255). Jest to istotne dla zapewnienia zarejestrowania jak najbogatszego zestawu danych, co maksymalizuje jakość ilościowej analizy danych.</li>
	<li>Należy zebrać obrazy dla kanału białek fluorescencyjnych (Cherry, GFP lub CFP) oraz dla kanału barwnika biarszeniowego (FlAsH lub ReAsH) dla wszystkich próbek.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Zainstaluj oprogramowanie ImageJ na komputerze8. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a></li>
	<li>Upewnij się, że Twoja wersja programu ImageJ posiada następujące wtyczki:
		<ul>
			<li><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html</a></li>
			<li><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html</a></li>
			<li><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html</a></li>
		</ul>
	</li>
	<li>Uruchom program ImageJ, a jeśli używasz wersji starszej niż v1.32c, kliknij następujące opcje, aby umożliwić jednoczesne otwarcie wielu obrazów (można to zrobić, przytrzymując klawisz Ctrl podczas klikania różnych plików): 
	<img src="/files/ftp_upload/2857/2857step1.jpg" alt="Interfejs oprogramowania ImageJ; ustawianie opcji I/O dla eksportu danych; schemat konfiguracji przepływu pracy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"></li>
	<li>Otwórz interesujące Cię obrazy w programie ImageJ. 
	ImageJ automatycznie zdefiniuje maksymalną i minimalną intensywność pikseli wyświetlaną na ekranie oddzielnie dla każdego obrazu. Ponieważ różne obrazy będą miały różną intensywność pikseli, oznacza to, że wyświetlane obrazy NIE SĄ porównywalne w takim widoku.</li>
	<li>Aby upewnić się, że wszystkie otwarte obrazy są w tej samej skali, można ręcznie zdefiniować górną i dolną intensywność pikseli do wyświetlenia (nie zmieni to faktycznej zawartości danych obrazów, co mogłoby mieć miejsce w innym oprogramowaniu). Wartości te można ustawić w poniższym menu: 
	<img src="/files/ftp_upload/2857/2857step2.jpg" alt="Interfejs oprogramowania ImageJ; regulacja jasności/kontrastu, wykres histogramu; konfiguracja przetwarzania obrazu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"></li>
	<li>Alternatywnym podejściem jest praca ze stosami (stacks), co pozwala połączyć wszystkie obrazy w jednym pliku i automatycznie przeskaluje (do wyświetlania) wszystkie obrazy w stosie do tej samej skali. Najprostszym sposobem pracy z danymi jest konwersja każdego kanału na stos. Zatem dla kanału białka fluorescencyjnego przekonwertuj wszystkie na stos, jak pokazano. Można łatwo wybrać jeden kanał, grupując w stos wszystkie obrazy zawierające wspólną nazwę (np. „ch00”) w tytule. 
	<img src="/files/ftp_upload/2857/2857step3.jpg" alt="Interfejs oprogramowania ImageJ; instrukcja tworzenia stosów obrazów; menu procesów; okno narzędzi; edukacja." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"></li>
	<li>Teraz przekonwertuj wszystkie otwarte obrazy na format 8-bitowy do analizy. Spowoduje to przeskalowanie wyświetlanego zakresu do zakresu 0-255 (który definiuje format 8-bitowy). 
	WAŻNE: Nie zapisuj zmian w oryginalnym formacie 12-bitowym (lub wyższym), w przeciwnym razie utracisz zawartość informacji. Należy pamiętać, że niektóre pakiety oprogramowania mogą wyświetlać tylko obrazy 8-bitowe, więc ten format jest przydatny do tworzenia rycin itp. 
	<img src="/files/ftp_upload/2857/2857step4.jpg" alt="Zrzut ekranu oprogramowania ImageJ, demonstrujący menu konwersji typu obrazu dla cyfrowego przetwarzania obrazów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"></li>
	<li>Zapisz kopię w nowym folderze o nazwie „8-bit converted”, korzystając z opcji „Save as…”.</li>
	<li>Jedną z metod badania zakresu wiązania barwnika biarsenowego w całym obrazie jest wykonanie wykresu korelacji intensywności pikseli. Wykres ten przedstawia wartość każdego piksela w jednym kanale w stosunku do odpowiadającej mu wartości piksela w drugim kanale. Zatem pozycja piksela o wysokiej fluorescencji CFP będzie miała również wysoką fluorescencję ReAsH, jeśli wiązanie jest wysokie.</li>
	<li>Aby przeanalizować współkorelację pikseli, upewnij się, że obrazy 8-bitowe ReAsH oraz Cerulean/GFP są otwarte w programie ImageJ.</li>
	<li>Otwórz wtyczkę „Image Correlator”, jak wskazano poniżej. Wybierz „Image1” jako stos ReAsH lub FlAsH oraz „Image2” jako stos białka fluorescencyjnego. 
	<img src="/files/ftp_upload/2857/2857step5.jpg" alt="Metoda korelacji obrazów, wybór z menu, interfejs oprogramowania, konfiguracja analizy obrazu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"></li>
	<li>Powstały stos może nie wyświetlać żadnych szczegółowych informacji – jest to normalne. Zapisz stos w nowym folderze o nazwie „Scatterplots” i nadaj mu taką samą nazwę pliku, jak próbka, której dotyczy (np. „FlAsH-cherry correlation plot”).</li>
	<li>Aby dane były czytelne, możesz wybrać jedną z dwóch opcji. Najpierw przekształć dane na format logarytmiczny. Następnie wizualnie przeskaluj dane w następujący sposób: 
	<img src="/files/ftp_upload/2857/2857step6.jpg" alt="Menu procesów oprogramowania ImageJ; okna wykresu korelacji i kontroli jasności; analiza danych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"></li>
	<li>Alternatywnie możesz przeskalować dane wizualnie tak, aby wyświetlać tylko niskie wartości (np. 1-255) i wyświetlać dane za pomocą specjalnej tablicy LUT. LUT (Look Up Table) to tabela kolorów przypisanych do każdej wartości piksela w obrazie. Może ona służyć do zdefiniowania schematu pseudokolorów dla obrazu i jest przydatna do definiowania określonych cech obrazu. Aby utworzyć własną tablicę LUT, kliknij „LUT editor” i stwórz nową, taką jak ta pokazana (można ją zapisać i wykorzystać później). 
	<img src="/files/ftp_upload/2857/2857step7.jpg" alt="Proces edycji LUT w ImageJ; schemat nawigacji po menu kolorów i edytor LUT do personalizacji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 7"></li>
	<li>Ustaw zakres jasności/kontrastu od 0-255 (jak opisano w kroku 13 powyżej). Aby „utrwalić” obraz tak, jak jest on wyświetlany na ekranie, można go przekonwertować na format RGB, który zapisuje wartość 8-bitową dla każdego z kolorów czerwonego, zielonego i niebieskiego każdego piksela. 
	<img src="/files/ftp_upload/2857/2857step8.jpg" alt="Interfejs oprogramowania ImageJ, nawigacja po menu wyboru kolorów RGB, narzędzie do analizy obrazu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 8"> 
	Aby kopiować i wklejać obrazy do innych programów, otwórz najpierw obrazy 8- lub 16-bitowe. Jak opisano w kroku 14 powyżej, przypisz obrazowi schemat kolorów LUT. Dla CFP przypisz LUT „Cyan”, jak opisano poniżej… 
	<img src="/files/ftp_upload/2857/2857step9.jpg" alt="Menu ImageJ pokazujące wybór tablicy kolorów LUT dla analizy obrazu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 9"></li>
	<li>Wybierz obraz, a aby skopiować go do schowka, wybierz… 
	<img src="/files/ftp_upload/2857/2857step10.jpg" alt="Interfejs menu ImageJ ilustrujący proces kopiowania danych do analizy i edycji obrazów." data-altupdatedat="1788235205000"></li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Sukces znakowania komórek barwnikami biarsenkalnymi zależy od kilku kluczowych parametrów. Po pierwsze, kluczowy jest czas znakowania barwnikami. Stwierdziliśmy, że przedłużony czas znakowania (powyżej 30 min) prowadzi do wysokiego poziomu niespecyficznego barwienia tła. Rys. 1 przedstawia typowy wynik dla fragmentu białka huntingtyny typu dzikiego (25Q) połączonego z pochodną CFP, Cerulean, zawierającą znacznik TC, zgodnie z wcześniejszym opisem 7. Próbka ta była barwiona przez 30 min barwnikiem ReAsH, a w próbce pozbawionej znacznika TC tło jest minimalne. Stwierdziliśmy, że utrwalanie komórek paraformaldehydem zwiększa tło, natomiast utrwalanie metanolem znosi fluorescencję białka fluorescencyjnego. Dlatego, w miarę możliwości, obrazujemy żywe komórki. Należy również zauważyć, że utrwalanie przed znakowaniem barwnikami biarsenkalnymi zapobiega ich wiązaniu, prawdopodobnie z powodu modyfikacji motywu TC.
Kolejnym krytycznym czynnikiem warunkującym powtarzalność wyników jest gęstość komórek. Stwierdziliśmy, że kluczowe jest obrazowanie komórek rozproszonych, gdyż nadmierne skupiska mogą prowadzić do nierównomiernego barwienia barwnikami biarsenowymi w poszczególnych komórkach.
<img src="/files/ftp_upload/2857/2857fig1.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna, nałożenie CFP/ReAsH, korelacja intensywności pikseli, badanie oddziaływań białkowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Znaczniki tetracysteiny i barwienie ReAsH w żywych komórkach transfekowanych fuzjami huntingtina(exon1-25Q)-Cerulean. Znacznik TC znajduje się na złączu fuzji huntingtina-Cerulean (jak opisano w 7). Wykres korelacji intensywności pikseli umożliwia ocenę różnic w wiązaniu ReAsH w całej komórce i może być wykorzystany do mapowania zmian w wiązaniu ReAsH wynikających ze zmian konformacyjnych lub oddziaływań z ligandami.

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li>
<li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li>
<li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li>
<li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li>
<li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li>
<li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li>
<li>Abramoff, M. agelhaes, PJ, S. J. R. am <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fluor%22%5BJournal%5D)">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li>
<li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo%3A+Synthesis+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podejście polegające na znakowaniu lokalizacji białka za pomocą białka fluorescencyjnego oraz jego właściwości konformacyjnych za pomocą drugiego barwnika stwarza duży potencjał w mapowaniu miejsc gromadzenia się różnych konformacji białek w komórkach, a także zdarzeń zmieniających dynamikę konformacji białek. ReAsH/FlAsH został po raz pierwszy zastosowany jako sensor wewnątrzkomórkowy do badania fałdowania białka wiążącego kwas retinowy I (cellular retinoic acid-binding protein I) ssaków 4. W tym przykładzie ...

<table><tbody><tr><td>8-dołkowa &amp;mu;-preparaty</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>Uznajemy, że takie szkiełka z komorami są szczególnie użyteczne do hodowli komórek przeznaczonych do obrazowania.</td></tr><tr><td>Zestaw do detekcji wewnątrzkomórkowej znacznika tetracysteiny TC-FlAsH II *zielona fluorescencja* *do obrazowania żywych komórek*</td><td>Invitrogen</td><td>T34561 (FlAsH) lub T34562 (ReAsH)</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Zrównoważony roztwór soli </td><td>Invitrogen</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Dimerkapto-1-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1129-5ML</td><td></td></tr><tr><td>1,2-etanoditiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>02390-25ML</td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie reash/flash oraz analiza obrazu białek sensorowych tetracysteiny w komórkach

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Białka fluorescencyjne i barwniki są niezbędnymi narzędziami do badania transportu, lokalizacji i funkcji białek w komórkach. Podczas gdy białka fluorescencyjne, takie jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), były szeroko stosowane jako partnery do fuzji z białkami w celu śledzenia właściwości białka docelowego1, niedawne osiągnięcia w zakresie mniejszych znaczników umożliwiają badanie nowych funkcjonalności białek w komórkach, takich jak zmiany konformacyjne i asocjacje białkowe 2, 3. Jeden z systemów małych znaczników obejmuje motyw tetracysteinowy (CCXXCC) wprowadzony genetycznie do białka docelowego, który wiąże się z barwnikami biarsenicznymi, ReAsH (fluorescencja czerwona) i FlAsH (fluorescencja zielona), z wysoką swoistością nawet w żywych komórkach 2. System TC/barwnik biarsenicowy stwarza znacznie mniejsze ograniczenia steryczne dla białka gospodarza niż białka fluorescencyjne, co umożliwiło zastosowanie kilku nowych podejść do pomiaru zmian konformacyjnych i oddziaływań białko-białko 4-7. Opracowaliśmy niedawno nową aplikację znaczników TC jako sensorów oligomeryzacji w komórkach wykazujących ekspresję zmutowanej huntingtyny, która po mutacji ulega agregacji w neuronach w chorobie Huntingtona 7. Huntingtyna została oznakowana dwoma barwnikami fluorescencyjnymi: jednym białkiem fluorescencyjnym do śledzenia lokalizacji białka oraz drugim znacznikiem TC, który wiąże barwniki biarsenicze wyłącznie w monomerach. Zatem zmiany w kolokalizacji między białkiem a reaktywnością barwnika biarseniczniego umożliwiły przestrzenne mapowanie submikroskopowej zawartości oligomerów wewnątrz komórek. W niniejszym protokole opisujemy sposób znakowania białek z tagiem TC połączonych z białkiem fluorescencyjnym (Cherry, GFP lub CFP) za pomocą FlAsH lub ReAsH w żywych komórkach ssaków oraz sposób kwantyfikacji fluorescencji dwubarwnej (kombinacje Cherry/FlAsH, CFP/FlAsH lub GFP/ReAsH).

Barwniki biarseniowe FlAsH i ReAsH wiążą się specyficznie z motywami tetracysteiny w białkach i mogą selektywnie znakować białka w żywych komórkach. Niedawno strategia znakowania ta została wykorzystana do opracowania sensorów różnych konformacji białek lub stanów oligomerycznych. Opisujemy podejście do znakowania oraz metody ilościowej analizy wiązania.

Znakowanie ReAsH/FlAsH oraz analiza obrazu białek sensorowych tetracysteiny w komórkach

Białka fluorescencyjne i barwniki są niezbędnymi narzędziami w badaniach nad transportem, lokalizacją i funkcją białek w komórkach. Podczas gdy białka fluorescencyjne...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest znakowanie barwnikami flash lub ash komórek wykazujących ekspresję białka z tagiem tetracysteiny i znacznikiem fluorescencyjnym oraz ilościowa analiza uzyskanych wyników. Osiąga się to poprzez najpierw transfekcję linii komórkowej plazmidem niosącym białko fluorescencyjne oraz białko docelowe zawierające tag tetracysteiny. Następnie ekspresowane białko jest znakowane barwnikiem R lub flash, a niespecyficznie związany barwnik jest usuwany poprzez przemywanie BAL w celu przygotowania do obrazowania mikroskopowego.Następnie wykorzystuje się mikroskop konfokalny do zarejestrowania obrazów fluorescencyjnych komórek w kanałach ash lub flash oraz białka fluorescencyjnego. Na koniec obrazy są analizowane za pomocą programu ImageJ w celu ilościowego określenia wiązania ash lub flash z białkiem docelowym. W efekcie można uzyskać wyniki pokazujące stopień wiązania ash lub flash z białkiem docelowym w komórkach poprzez korelację fluorescencji ash z fluorescencją białka fluorescencyjnego.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak zwykłe znakowanie białka docelowego GFP, jest możliwość śledzenia drugiej właściwości białka, np. zmiany konformacyjnej, oprócz jego lokalizacji. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu substruktury i funkcji białek, takie jak zdarzenia oligomeryzacji, zmiany konformacyjne oraz zdarzenia wiązania ligandów, które zmieniają zdolność TAC do wiązania ash lub flash. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy chcieliśmy ocenić, w jaki sposób w komórkach tworzą się niewielkie, submikroskopijne polimery met-Huntingtony.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy analizy danych są trudne do opanowania ze względu na ich złożoność techniczną. Zaprezentowano procedury eksperymentalne. Kroki od pierwszego do trzeciego zostaną przeprowadzone przez Yasmin Ranson, asystentkę badawczą z naszego laboratorium, która zademonstruje analizę danych. Krok czwarty przeprowadzi Sevki GaN, doktorant z naszego laboratorium. Należy zastosować standardowe metody hodowli komórkowej dla wybranej linii komórkowej oraz przygotować szkiełko do obrazowania żywych komórek do transfekcji.Przygotuj hodowlę komórek adherentnych i przeprowadź transfekcję plazmidu zawierającego gen zainteresowania z tagiem TC. Zastosuj wybraną metodę transfekcji. Ważne jest zastosowanie kontroli pozytywnych i negatywnych, aby ocenić stopień specyficznego wiązania do tagów TC, a także aby ocenić przenikanie fluorescencji (bleed-through) między kanałami podczas pozyskiwania mikrografii konfokalnych. W przypadku zastosowania dwóch kolorów należy upewnić się, że przygotowano próbki dla pojedynczych kolorów – albo samą białko fluorescencyjne, a jeśli to możliwe, białko Tctech związane z fluorescencją lub odwrotnie.Jednak bez białka fluorescencyjnego. Od jednego do dwóch dni po transfekcji delikatnie wypłucz komórki 300 µL podgrzanego roztworu soli Hanksa (HBSS), przygotuj świeży, podgrzany roztwór HBSS z 10 µM etanoditiolu (EDT) oraz 1 µM ASH. Po usunięciu HBSS z komórek, delikatnie zastąp go 300 µL medium ASH i inkubuj dokładnie przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych.Z naszego doświadczenia wynika, że dłuższy czas inkubacji znacząco zwiększa fluorescencję tła. Ostrożnie odessaj roztwór znakujący z komórek i zastąp go 300 µL podgrzanego HBSS z 250 µM 2,3-dimerkapropanolem lub BAL, inkubując przez 15 minut w 37 °C. Usuń roztwór piorący poprzez delikatne odessanie i zastąp go 300 µL podgrzanego HBSS.Po tym płukaniu komórki można utrwalić za pomocą paraformaldehydu, choć stwierdziliśmy, że zwiększa to nieswoistą fluorescencję tła. Dlatego zazwyczaj obrazujemy żywe komórki w temperaturze pokojowej. Dodatkowo, utrwalenie komórek przed znakowaniem zapobiega wiązaniu barwnika bial.Aby rozpocząć obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego, należy ustawić parametry obrazowania dla poszczególnych fluoroforów i upewnić się, że przenikanie sygnału między kanałami jest pomijalne. Następnie należy dostosować ustawienia fotopowielacza w taki sposób, aby maksymalna fluorescencja w próbce nie nasycała detektora. Po ustaleniu optymalnych ustawień obrazowania nie należy ich zmieniać pomiędzy kolejnymi próbkami.Zastosuj szybkość skanowania 200 hertz, zbierz cztery średnie z linii i ustaw średnicę otworu pinhole na jedną jednostkę obszaru. Średnicę otworu pinhole można zwiększyć, jeśli problemem jest stosunek sygnału do szumu. Może to jednak spowodować pewną utratę rozdzielczości obrazowania.Obrazy konfokalne należy zebrać w formacie 12-bitowym lub wyższym, jeśli jest to możliwe, aby zmaksymalizować jakość ilościowej analizy danych. Obrazy należy zebrać dla kanału białka fluorescencyjnego oraz dla kanału barwnika BI arsenal dla wszystkich próbek.Aby przeanalizować dane, należy użyć oprogramowania Image J z następującymi wtyczkami. W przypadku korzystania z wersji Image J starszej niż 1.32 C należy wybrać następujące opcje. Aby umożliwić jednoczesne otwieranie wielu obrazów, przejdź do edit options input slash output i zaznacz pole use j file chooser to open slash share.Kliknij OK. Otwórz interesujące obrazy. Program Image J automatycznie zdefiniuje maksymalną i minimalną intensywność pikseli wyświetlaną na ekranie oddzielnie dla każdego obrazu, ponieważ różne obrazy będą miały różną intensywność pikseli.Oznacza to, że wyświetlane obrazy nie są porównywalne w aktualnym widoku. Aby upewnić się, że wszystkie otwarte obrazy mają tę samą skalę, należy fizycznie zdefiniować górną i dolną intensywność pikseli do wyświetlenia. Aby ustawić te wartości, wybierz obraz, a następnie dostosuj jasność/kontrast.Kliknij „ustaw”, określ minimalną i maksymalną wartość wyświetlaną. Następnie wybierz opcję rozpropaguj do wszystkich otwartych obrazów i kliknij OK. Alternatywnie można umieścić wszystkie obrazy dla danego kanału razem w jednym pliku lub stosie.Program Image J automatycznie dostosuje wszystkie obrazy do tej samej skali. Aby to zrobić, wybierz Image Stacks, następnie Images to Stack, wprowadź nazwę wspólną dla każdego pliku i wybierz Use Titles as Labels. Kliknij OK.Konwertuj wszystkie otwarte obrazy na format ośmiobitowy w celu przeprowadzenia analizy. Wybranie typu obrazu ośmiobitowego spowoduje przeskalowanie wyświetlanego zakresu do przedziału od 0 do 255. Ważne jest, aby nie zapisywać plików w miejsce oryginałów w formacie 12-bitowym lub wyższym, ponieważ spowodowałoby to utratę zawartości informacji.Zapisz kopię w nowym folderze o nazwie eight bit converted, korzystając z opcji Zapisz jako. Jedną z metod badania stopnia wiązania barwnika biarsal w całym obrazie jest wykonanie wykresu korelacji intensywności pikseli. Wykres ten przedstawia wartość każdego piksela w jednym kanale w odniesieniu do odpowiadającej mu wartości piksela w drugim kanale.Zatem pozycja piksela o wysokiej fluorescencji GFP będzie również wykazywać wysoką fluorescencję popiołu w przypadku silnego wiązania. Aby przeanalizować korelację pikseli, należy upewnić się, że ośmiobitowe obrazy REA i GFP są otwarte w programie ImageJ. Następnie należy otworzyć wtyczkę Image Correlator, wybierając Plugins &gt; Image Correlator. Następnie przypisz pliki obrazów do Image One i Image Two.Następnie kliknij OK. Powstały stos może nie wyświetlać żadnych szczegółowych informacji. Jest to zjawisko normalne.Zapisz stos w nowym folderze o nazwie scatterplots i nadaj mu tę samą nazwę pliku, co próbka, której dotyczy. Na przykład: Ash GFP Correlation plot. Aby wyświetlić dane, wybierz jedną z dwóch opcji.Najpierw przekształć dane do formatu logarytmicznego, wybierając opcję process math log auto. Następnie, aby wizualnie przeskalować dane, kliknij image adjust brightness slash contrast i wybierz auto. Po drugie, przeskaluj dane wizualnie tak, aby wyświetlały jedynie niskie wartości, a następnie wyświetl dane za pomocą specjalnej tablicy przeglądowej (lookup table) lub LUT, aby stworzyć własną tabelę LUT.Kliknij opcję edycji kolorów obrazu (LUT), aby uzyskać bardzo prostą tablicę LUT. Kliknij górny lewy piksel i wybierz kolor czarny. Następnie zaznacz następny piksel po prawej stronie i wybierz kolor czerwony.Następnie kliknij trzeci piksel i, trzymając przycisk myszy, przeciągnij zaznaczenie do dolnego prawego piksela. Wybierz kolor czerwony, kliknij OK, a następnie wybierz kolor biały i kliknij OK. Wybierz zakres jasności i kontrastu od 0 do 255, zgodnie z wcześniejszym opisem, aby zablokować obraz tak, jak jest on wyświetlany na ekranie.Konwertuj obrazy do formatu RGB, aby móc je kopiować i wklejać do innych programów. Najpierw otwórz obrazy 8-bitowe lub 16-bitowe zgodnie z wcześniejszym opisem. Przypisz schemat kolorów LUT do obrazów dla GFP.Przypisz zieloną tablicę LUT, klikając na obraz. Tablice wyszukiwania zielone. Na koniec wybierz obraz do skopiowania i skopiuj go do schowka, wybierając opcję edytuj kopiuj do systemu; ta figura przedstawia typowy wynik dla kinazy sock z fuzją GFP i znacznikiem TC, która była barwiona przez 30 minut.W komórkach HEC 2 9 3 z zastosowaniem ash wydaje się, że ASH wiąże się z wysokim powinowactwem i wydajnością do białka docelowego posiadającego znacznik TC. W przeciwieństwie do tego, na tej rycinie przedstawiono odpowiadającą mu próbkę kontrolną SARK połączonego z GFP, ale pozbawionego znacznika TC, co jest niezbędne do weryfikacji zarówno swoistości znacznika TC, jak i poziomu barwienia tła. Wynik ten pokazuje, że RH nie wykazuje reaktywności z białkiem docelowym pozbawionym znacznika TC, co wskazuje na swoistość znacznika TC w wiązaniu SSH.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie dopuścić do konfluencji i stanu spoczynku komórek, ponieważ wpłynie to na wiązanie V w komórkach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak w prosty sposób przeprowadzić ilościową analizę danych; metody te można następnie dopracować, aby opracować własne, unikalne IUTS do wizualizacji danych.

reashflash-labeling-image-analysis-tetracysteine-sensor-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oznaczanie ReAsH/FlAsH i analiza obrazów białek sensorycznych tetracysteinowych w komórkach

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) to potężna metoda obserwacji struktur znajdujących się blisko powierzchni komórki przy wysokim kontraście i rozdzielczości czasowej. Demonstrujemy, w jaki sposób TIRF może być wykorzystany do badania dynamiki białek w korze bakterii i grzybów otoczonych ścianą komórkową.

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

Żywotność komórek zależy od szybkiego i skutecznego radzenia sobie z nieprawidłowym fałdowaniem białek.  W tym miejscu opisujemy metodę wizualizacji różnych potencjalnych losów nieprawidłowo sfałdowanego białka: ponownego fałdowania, degradacji lub sekwestracji w inkluzjach. Demonstrujemy zastosowanie czujnika składania, Ubc9ts, do monitorowania proteostazy i kontroli jakości agregacji w żywych komórkach za pomocą mikroskopii 4D.

Obrazowanie 4D agregacji białek w żywych komórkach

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Interakcje białek są sercem funkcji komórki. Do ich scharakteryzowania powszechnie stosuje się techniki kalorymetryczne i spektroskopowe. Tutaj opisujemy anizotropię fluorescencji jako narzędzie do badania interakcji między białkiem zmutowanym w zespole Shwachmana-Diamonda (SBDS) a GTPazą podobną do czynnika elongacji 1 (EFL1).

Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Ten artykuł opisuje konkretne metody uzyskiwania biochemicznych ilości TRPV1 rozpuszczonego w detergentach do analizy spektroskopowej. Połączone protokoły zapewniają narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które można dostosować w celu ułatwienia badań strukturalnych i funkcjonalnych kanałów jonowych ssaków w środowisku kontrolowanym przez błonę.

Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Interakcje białko-białko są kluczowe dla systemów biologicznych, a badania kinetyki wiązania dostarczają wglądu w dynamikę i funkcję kompleksów białkowych. Opisujemy metodę, która określa ilościowo parametry kinetyczne kompleksu białkowego za pomocą rezonansu fluorescencyjnego, transferu energii i techniki zatrzymanego przepływu.

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Utlenianie tiolu białka ma znaczące implikacje w normalnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Opisujemy szczegóły ilościowej metody proteomiki redoks, która wykorzystuje wychwytywanie wspomagane żywicą, znakowanie izobaryczne i spektrometrię mas, umożliwiając specyficzną dla miejsca identyfikację i kwantyfikację odwracalnie utlenionych reszt cysteiny białek.

Wychwytywanie wspomagane żywicą w połączeniu z izobarycznym tandemowym etykietowaniem masy w celu multipleksowanej kwantyfikacji utleniania tiolu białek

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

Poznaj metodę znakowania białek z motywem tetracysteiny za pomocą barwników FlAsH i ReAsH w żywych komórkach. Technika umożliwia ilościową analizę wiązania i obserwację konformacji białek.

Znakowanie ReAsH/FlAsH oraz analiza obrazu białek sensorowych tetracysteiny w komórkach

Przeglądaj więcej filmów