Name: Immobilizacja bakteryjna do obrazowania za pomocą mikroskopii sił atomowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Poznaj metodę immobilizacji bakterii do obrazowania mikroskopią sił atomowych w środowisku ciekłym. Technika wykorzystuje żelatynę do przymocowania komórek do powierzchni miki bez chemicznej modyfikacji próbki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te są sponsorowane przez Office of Biological and Environmental Research Departamentu Energii USA oraz z funduszy grantowych Commonwealth Health Research Board stanu Wirginia. Oak Ridge National Laboratory jest zarządzane przez UT-Battelle, LLC, dla Departamentu Energii USA na podstawie kontraktu nr DE-AC05-00OR22725.

1. Przygotowanie miki: 
<ol>
	<li>Dotnij miki (Electron Microscopy Sciences) nożyczkami do rozmiaru wymaganego przez mikroskop AFM (ok. 2 × 30 mm).</li>
	<li>Oddziel warstwy miki z obu stron, zazwyczaj używając taśmy do usunięcia warstwy zewnętrznej, aż pozostaną jedynie gładkie, nienaruszone warstwy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu żelatyny: 
<ol>
	<li>Do butelki laboratoryjnej wlej 10 ml wody destylowanej.</li>
	<li>Podgrzewaj butelkę w mikrofalówce, aż woda zacznie wrzeć. (Jeśli kuchenka mikrofalowa nie jest dostępna, wodę można podgrzać w zlewce na płycie grzewczej).</li>
	<li>Odważ 0,5 g żelatyny (Sigma G-614, G-2625 lub G-250) i dodaj do gorącej wody destylowanej.</li>
	<li>Delikatnie zakręć butelką, aż żelatyna całkowicie się rozpuści.</li>
	<li>Ostudź roztwór żelatyny do temperatury 60-70 °C.</li>
	<li>Wlej około 15 mL do małej zlewki (20 mL), w której można będzie zanurzyć dociętą łupkę miki.</li>
</ol>
3. Powlekanie miką: 
<ol>
	<li>Zanurz kwadraty miki w podgrzanym roztworze żelatyny i szybko wyjmij, tak aby Mika została pokryta warstwą żelatyny (Rys. 1a).</li>
	<li>Po pokryciu natychmiast oprzyj mikę krawędzią o ręcznik papierowy, aby wyschła w powietrzu (Rys. 1b). Mika pokryta żelatyną może być używana przez co najmniej 2 tygodnie. Nadmiar roztworu żelatyny można przechowywać w lodówce i wykorzystać w ciągu około miesiąca, ponownie podgrzewając roztwór stok do temperatury od 60-70 °C. Należy uważać, aby nie doprowadzić do zagotowania żelatyny podczas ponownego podgrzewania.</li>
</ol>
4. Mocowanie bakterii na powlekanej żelatyną micy:
<ol>
	<li>Odwirować 1 mL kultury bakteryjnej (0,5 - 1,0 OD przy 60 nm) przy prędkości od 80 do 4 50 rcf. W zależności od gatunku bakterii należy zastosować minimalną wartość rcf, która pozwoli na osadzenie komórek w ciągu ok. 5 minut.</li>
	<li>Przemyć osad taką samą objętością filtrowanej wody dejonizowanej lub buforu.</li>
	<li>Ponownie zebrać komórki poprzez wirowanie.</li>
	<li>Bezzwłocznie resuspendować osad w 50 μL nanoprzeciąglej wody dejonizowanej lub buforze. (Zawiesina bakteryjna powinna być widocznie mętna, aby zapewnić odpowiednie stężenie komórek do obrazowania AFM).</li>
	<li>Nanieść zawiesinę komórkową (10-20 μL) na mikę pokrytą żelatyną i rozprowadzić na powierzchni za pomocą końcówki pipety (Rys. 1c). Należy zadbać o to, aby podczas nakładania lub rozprowadzania roztworu bakteryjnego końcówka pipety nie dotykała fizycznie powierzchni żelatyny.</li>
	<li>Pozostawić powierzchnię na 10 minut, a następnie opłukać strumieniem wody lub buforu (Rys. 1 c-d). Przez cały czas trwania procedury należy dbać o to, aby próbka nie wyschła.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Rysunek 2 przedstawia przykładowe obrazy komórek bakteryjnych, które zostały zamocowane na powlekanej żelatyną miki i zobrazowane za pomocą AFM. W naszych laboratoriach próbki są zazwyczaj obrazowane przy użyciu mikroskopu sił atomowych PicoPlus (Agilent Technologies, Temple, AZ) wyposażonego w głowicę skanującą 10 μm. Instrument pracuje w rozdzielczości 128-512 pikseli na linię skanu przy prędkości skanowania 0,5-1,0 linii/s. Typowo stosowane są zgłębniki z azotku krzemu Veeco (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) o nominalnych stałych sprężystości w zakresie od 0,01 do 0,1 nN/nm.
<img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig1.jpg" alt="Przygotowanie i nakładanie próbek na szkiełka przedmiotowe do chromatografii przy użyciu mikropipety i pęsety." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rycina 1. Żelatyna w temperaturze 60-70 °C umieszcza się w zlewce o pojemności 20 ml. Za pomocą pincety świeżo łupane kwadraty miki całkowicie zanurza się w żelatynie (a), a następnie wyjmuje i ustawia pionowo na ręczniku papierowym, opierając je o statyw do mikrocentryfugi (b). Kroplę próbki bakteryjnej nanosi się na mikę i rozprowadza końcówką pipety w kierunkach X i Y (c). Po inkubacji próbki na powierzchni miki przez co najmniej 10 minut, należy opłukać ją strumieniem wody destylowanej. Jeśli immobilizacja przebiegła pomyślnie, na mice pojawi się nieprzezroczysta plamka, jak pokazano na prawym panelu rysunku (d). Jeśli immobilizacja nie powiodła się, otrzymamy przezroczysty fragment miki, jak na panelu lewym. Wielkość nieprzezroczystej plamki na mice jest proporcjonalna do stężenia bakterii w kropli naniesionej na mikę traktowaną żelatyną.
<img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig2.jpg" alt="Obraz komórek bakteryjnych na powierzchni wykonany za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM); analiza w nanoskali, badania biologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Obrazy AFM wykazujące E. coliNa panelu (a) komórki są osadzone na miki powleczonej żelatyną i obrazowane w 0,05 M PBS. Dla porównania, na panelu (b) przedstawiono obraz komórek bakteryjnych osadzonych na miki powleczonej żelatyną i obrazowanych w powietrzu. Chociaż przegrody są wyraźnie widoczne na obrazie wykonanym w cieczy, w powietrzu można uzyskać wyższą rozdzielczość, o czym świadczy obecność pili (wstawka na panelu (b)).

<ol><li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+basis+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).</li>
<li>Gray, C., Hukkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neural+growth%3A+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-+containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neuroscience. 50, 953-963 (1992).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+as+a+regulator+and+integrator+of+axonal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Tension as a regulator and integrator of axonal growth.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).</li>
<li>Iwata, A., Browne, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+outgrowth+of+mechanically+engineered+nervous+tissue+constructs+implanted+into+spinal+cord+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions.</a> Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytomechanical+investigation+of+neurite+growth+on+different+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces.</a> J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).</li>
<li>Lindqvist, N., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+%28Muller%29+cells%3A+sensing+and+responding+to+tissue+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).</li>
<li>Loverde, J. R., Ozoka, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Axon+Stretch+Growth+in+Embryonic+and+Adult+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons.</a> J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Lu, Y. B., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li>
<li>Pfister, B. J., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Engineering+Strategies+for+Peripheral+Nerve+Repair%3A+Surgical+Applications%2C+State+of+the+Art%2C+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li>
<li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li>
<li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts%3A+extremes+and+exploitations%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li>
<li>Smith, D. H., Wolf, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons%3A+continuous+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li>
<li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+patterns%3A+The+mechanics+of+nerve+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Growth%2C+Third+Growth+Symposium%22%5BJournal%5D)">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li>
<li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Różne czynniki mogą wpływać na osadzanie komórek drobnoustrojów i ich obrazowanie za pomocą AFM. Ważne znaczenie ma żelatyna stosowana do powlekania miki. Żelatyna komercyjna jest izolowana z wielu kręgowców, w tym z ryb, krów i świń. Zarówno pochodzenie, jak i metoda przetwarzania determinują przydatność żelatyny do immobilizacji bakterii. W celu oceny skuteczności immobilizacji bakterii przebadano liczne źródła i rodzaje żelatyny [1]. Dwie najskuteczniejsze żelatyny to Sigma G-6144 oraz G-2625. Żelatyny te, pochodzenia...

<table><tbody><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6144, G2625 lub G2500</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sił atomowych PicoPlus</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zespoły drgające AFM</td><td>Veeco Instruments, Inc.</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr></tbody></table>

immobilizacja bakterii do obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii sił atomowych

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM jest narzędziem obrazującym o wysokiej rozdzielczości (skala nm), które mechanicznie bada powierzchnię. Umożliwia obrazowanie komórek i biomolekuł w środowisku ciekłym, bez konieczności chemicznego traktowania próbki. Aby osiągnąć ten cel, próbka musi wystarczająco przylegać do powierzchni montażowej, aby zapobiec jej usunięciu przez siły wywierane przez skanującą końcówkę wspornika AFM. W wielu przypadkach powodzenie obrazowania zależy od unieruchomienia próbki na powierzchni montażowej. Optymalnie unieruchomienie powinno być minimalnie inwazyjne dla próbki, tak aby procesy metaboliczne i cechy funkcjonalne nie zostały naruszone. Poprzez pokrycie świeżo rozłupanych powierzchni miki żelatyną wieprzową, ujemnie naładowane bakterie mogą zostać unieruchomione na powierzchni i obrazowane w cieczy za pomocą AFM. Unieruchomienie komórek bakteryjnych na miki pokrytej żelatyną wynika najprawdopodobniej z oddziaływań elektrostatycznych między ujemnie naładowanymi bakteriami a dodatnio naładowaną żelatyną. Kilka czynników może zakłócać unieruchomienie bakterii, w tym składniki chemiczne cieczy, w której zawieszone są bakterie, czas inkubacji bakterii na miki pokrytej żelatyną, charakterystyka powierzchni szczepu bakteryjnego oraz medium, w którym obrazowane są bakterie. Ogólnie stwierdzono, że zastosowanie miki pokrytej żelatyną jest powszechnie przydatne do obrazowania komórek drobnoustrojów.

Żywe bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie mogą zostać unieruchomione na miki powlekanej żelatyną i obrazowane w cieczy przy użyciu mikroskopii sił atomowych (AFM).

Immobilizacja bakterii do obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii sił atomowych

AFM jest narzędziem obrazującym o wysokiej rozdzielczości (skala nm), które mechanicznie bada powierzchnię. Posiada zdolność obrazowania komórek i biomolekuł w cieczy...

Mikroskopia sił atomowych (AFM) wykorzystuje mechaniczne sondowanie powierzchni do generowania obrazów o wysokiej rozdzielczości bez konieczności chemicznego traktowania próbki. W tym filmie bakterie zostają unieruchomione na powleczonej żelatyną miki i obrazowane w środowisku ciekłym za pomocą AFM. Najpierw wycina się kwadraty z miki, aby pasowały do platformy mikroskopu AFM. Górna warstwa miki zostaje usunięta, a następnie kwadraty miki są powlekane żelatyną.Następnie na pokrytą żelatyną mikę nanosi się kropelkę zawiesiny bakteryjnej i rozprowadza ją. Próbki inkubuje się przez 10 minut, posiłkując się końcówką pipety. Następnie niezwiązane bakterie są wypłukiwane z powierzchni.Próbkę umieszcza się w mokrej celi AFM i poddaje obrazowaniu w celu uzyskania obrazów żywych bakterii o wysokiej rozdzielczości. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak unieruchamianie na porowatym filtrze ISO, jest możliwość niezawodnego unieruchomienia zarówno bakterii pręcikowych, jak i kulistych. Ponadto większa część powierzchni komórki jest dostępna dla sondy AFM.Kluczową zaletą mikroskopii sił atomowych w porównaniu z innymi metodami mikroskopowymi jest możliwość przeprowadzania badań na pojedynczych komórkach, co pozwala na analizę morfologii komórek, tworzenia się przegrody oraz cytokinezy. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ często stosują żelatynę, która nie zapewnia skutecznej immobilizacji bakterii, lub używają bakterii hodowanych na pożywkach złożonych, których składniki konkurują z adhezją bakterii do powierzchni żelatyny. Pomysł zastosowania tej metody zaczerpnęliśmy z eksperymentów przeprowadzonych w latach 70. XX wieku, w których stosowano immobilizację bakterii.Szkiełka szkiełkowe powlekane żelatyną do eksperymentów z wykorzystaniem mikroskopii świetlnej i autoradiografii. W niniejszej demonstracji żywe bakterie gram-ujemne zostają unieruchomione do obrazowania FM, jednak metoda ta jest możliwa do zastosowania również w przypadku bakterii gram-dodatnich. Aby przygotować MICA, należy zacząć od przycięcia go nożyczkami tak, aby pasował do stolika mikroskopu AFM i pomieścił mokrą komorę AFM.Następnie naklej taśmę klejącą na powierzchnię miki i odklej ją, aby zdjąć zewnętrzną warstwę miki z wyciętego fragmentu. Kontynuuj usuwanie zewnętrznej warstwy z obu stron, aż pozostaną jedynie gładkie, niepęknięte warstwy. Aby przygotować roztwór żelatyny, wlej 100 mililitrów wody destylowanej do butelki laboratoryjnej i podgrzej ją w kuchence mikrofalowej.Gdy woda zacznie wrzeć, wyjmij ją z kuchenki mikrofalowej, dodaj 0,5 g żelatyny i delikatnie potrząsaj butelką, aż żelatyna się rozpuści. Należy pamiętać, że żelatyny wołowe nie sprawdzają się w tej procedurze. Zaleca się stosowanie żelatyn wieprzowych.Postaw butelkę na blacie laboratoryjnym i poczekaj, aż ochłodzi się do 60–70 °C. Następnie wlej odpowiednią ilość roztworu żelatyny do małego zlewki, aby zapewnić całkowite zanurzenie MICA przy użyciu pęsety. Zanurz kwadrat MICA w ciepłym roztworze żelatyny i bezzwłocznie go wyjmij.Umieść płytkę MICA krawędzią na ręczniku papierowym, opierając ją o statyw do mikrowirówki, aby wyschła w powietrzu przez noc. Płytka MICA pokryta żelatyną może być używana przez co najmniej dwa tygodnie. Jeśli płytka MICA pokryta żelatyną nie będzie używana przez kilka tygodni.Umieścić go na papierze filtracyjnym w przykrytej szalce Petriego i przechowywać w temperaturze pokojowej. Nadmiar roztworu żelatyny można przechowywać w lodówce i wykorzystywać przez około miesiąc, po prostu ponownie podgrzewając roztwór zapasowy do temperatury od 60 do 70 °C. Należy zachować ostrożność, aby żelatyna nie zagotowała się podczas ponownego podgrzewania.Przed osadzeniem bakterii na powlekanej żelatyną płytce MICA należy upewnić się, że stężenie bakterii jest odpowiednie. Należy użyć spektrofotometru, aby zmierzyć gęstość optyczną próbki bakterii przy długości fali 600 nanometrów. Optymalna wartość OD mieści się w zakresie od 0,5 do 1.Następnie przenieś 1 mL hodowli do probówki do mikrowirówki i odwiruj w celu utworzenia osadu. Za pomocą pipety usuń nadsącz, a następnie przemyj osad w 1 mL filtrowanej wody dejonizowanej lub buforu. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby resuspenderować osad.Odwirować osad, a następnie bezzwłocznie go resuspender. W 500 µL nanopure wody dejonizowanej zawiesina bakteryjna powinna być widocznie mętna, aby zapewnić odpowiednie stężenie komórek do obrazowania FM.Jeśli istnieje obawa o szok osmotyczny, do roztworu obrazującego można dodać 0,25 M sacharozy. W tym przypadku resuspendowałem te bakterie w wodzie, ale nie należy obawiać się wypróbowania innych cieczy. Przykładowo, przeprowadziliśmy tę procedurę z użyciem 0,25% sacharozy, więc warto przetestować inne ciecze i sprawdzić, czy one również będą skuteczne.Przygotuj dwa szkiełka dla każdej próbki. Za pomocą mikropipety nanieś 10 do 20 µL zawiesiny komórkowej na powierzchnię pokrytą żelatyną. Następnie, aby zapewnić odpowiednią powierzchnię obrazowania FM, użyj końcówki mikropipety do rozprowadzenia kropli w kierunku X i Y.Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, uważając, aby nie dotknąć końcówką pipety powierzchni żelatyny. Następnie opłukać próbkę strumieniem wody i odsączyć nadmiar cieczy, przykładając krawędź próbki do ręcznika papierowego lub papieru filtracyjnego. Jedno ze szkiełek szybko wysuszyć strumieniem azotu.Następnie dokonaj wizualnej oceny preparatu. Nieprzejrzysty punkt wskazuje, że bakterie nie zostały usunięte podczas etapu płukania. Drugi preparat, który zostanie teraz wykorzystany do obrazowania, nie może wyschnąć.Umieść próbkę w komorze mokrej AFM i przymocuj ją za pomocą klipsów, a następnie za pomocą mikropipety dodaj wodę do komory mokrej. Zaleca się przygotowanie mikroskopu sił atomowych przed obrazowaniem w cieczy. Upewnij się, że w AFM umieszczono wspornik (cantilever) przeznaczony do obrazowania w cieczy i że jest on wyrównany z laserem.Przeprowadź obrazowanie za pomocą mikroskopii sił atomowych, używając mikroskopu sił atomowych pico plus, wyposażonego w głowicę skanującą o rozmiarze 100 micron i sondy z azotku krzemu vico o nominalnych stałych sprężystości w zakresie od 0,01 do 0,1 nano newton per nanometer. Po przygotowaniu mikroskopu wsuń skaner FM i stolik do mikroskopu. Zazwyczaj jako prędkość obrazowania przyjmujemy zakres od 0,5 lines per second do jednej line per second, a rozdzielczość ustawia się od 128 data points per line do 512.Ustaw instrument tak, aby zbierał obrazy przy użyciu od 128 do 512 pikseli na linię. Skanuj z prędkością od 0,5 do jednej linii na sekundę. Następnie, w razie potrzeby, dostrój punkt nastawy (set point) oraz wzmocnienia w trybie A FM, aby uzyskać optymalne obrazy.Na koniec należy zebrać obrazy. Bakterie E coli zamocowano na powleczonej żelatyną płytce MICA zgodnie z opisem w tym filmie, a następnie wykonano obrazowanie w 0,005 molar PVS. Stosując tę metodę.Sceptry są wyraźnie widoczne na zebranym obrazie, a powierzchnie komórek są gładkie i nie wykazują oznak odwodnienia. W porównaniu z nimi obrazy tych samych komórek e coli w powietrzu, przedstawione tutaj, często ukazują struktury niewidoczne w cieczy. W tym przypadku komórki mają pierścieniowaty wygląd z powodu odwodnienia, a widoczne są również wypustki bakteryjne, takie jak FIA.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować próbki bakteryjne do obrazowania FM w środowisku ciekłym. Po opanowaniu tej techniki procedura ta może zostać wykonana w około jedną godzinę, pod warunkiem, że mikropowierzchnie pokryte żelatyną zostały przygotowane wcześniej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest wybranie odpowiedniej żelatyny oraz zapewnienie właściwego stężenia bakterii zgodnie z opisaną procedurą.Można przeprowadzić również inne pomiary, takie jak wykorzystanie wspornika FN jako narzędzia do pomiaru siły w celu uzyskania odczytów siły na powierzchniach bakterii. Ponadto do końcówki A FM można przytwierdzić specyficzne cząsteczki sondy, aby wchodzić w interakcje z konkretnymi celami na powierzchni bakterii w celu identyfikacji i pomiaru sił oddziaływania. Pamiętaj, że w przypadku pracy z bakteriami patogennymi przy stosowaniu tej metody zawsze należy zachować odpowiednie środki ostrożności.

bacterial-immobilization-for-imaging-by-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Unieruchomienie bakterii do obrazowania za pomocą mikroskopii sił atomowych

Opisano metodę obrazowania za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) w trybie stukowym (tapping mode) w celu wizualizacji plazmidowego DNA, białek cytoplazmatycznych oraz kompleksów DNA-białko. Metoda obejmuje alternatywne podejścia do przygotowania próbek do obrazowania AFM po przeprowadzeniu manipulacji biochemicznych. DNA zawierające specyficzne regiony oddziałujące z białkami są obserwowane w warunkach buforu zbliżonego do fizjologicznego.

Wizualizacja rekombinowanego DNA i kompleksów białkowych przy użyciu mikroskopii sił atomowych

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

Prezentujemy metodę uzyskiwania obrazów o rozdzielczości subnanometrowej za pomocą mikroskopii sił atomowych z modulacją amplitudy (tryb stukania) w cieczy. Metodę zademonstrowano na komercyjnych mikroskopach sił atomowych. Wyjaśniamy powody naszego wyboru parametrów i sugerujemy strategie optymalizacji rozdzielczości.

Obrazowanie w rozdzielczości subnanometrowej z mikroskopią sił atomowych z modulacją amplitudy w cieczy

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Opisujemy prostą procedurę litograficzną do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchni, która może być użyta do przeprowadzenia eksperymentów z ekspresją genów na biochipach bez komórek.

Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji wsporników mikroskopu sił atomowych (AFM) z pojedynczym limfocytem T i cząstką kulki do badań immunologicznych. Przedstawiono procedury badania wiązania jednoparowych komórek T z komórkami dendrytycznymi przez AFM oraz monitorowania odpowiedzi komórkowej makrofagów w czasie rzeczywistym na pojedynczą cząstkę stałą za pomocą AFM z obrazowaniem fluorescencyjnym.

Funkcjonalizacja wsporników mikroskopu sił atomowych z pojedynczymi limfocytami T lub pojedynczą cząstką do immunologicznej spektroskopii sił pojedynczych komórek

Ten protokół ma na celu automatyzację pomiarów AFM na setkach komórek mikrobiologicznych. Najpierw drobnoustroje są unieruchamiane w mikrostrukturach stemplowych PDMS, a następnie pomiary spektroskopii sił są wykonywane automatycznie na setkach unieruchomionych komórek.

Automatyzacja pomiarów mikroskopem sił bioatomowych na setkach komórek C. albicans

Prezentowany jest tutaj protokół techniki Conpokal, która łączy mikroskopię konfokalną i mikroskopię sił atomowych w jedną platformę instrumentów. Conpokal zapewnia tę samą komórkę, ten sam region, prawie równoczesne obrazowanie konfokalne i mechaniczną charakterystykę żywych próbek biologicznych.

Niemal równoczesna skaning laserowy Mikroskopia konfokalna i mikroskopia sił atomowych (Conpokal) na żywych komórkach

Mikroskopia sił atomowych - spektroskopia w podczerwieni (AFM-IR) stanowi potężną platformę do badań nad bakteriami, umożliwiając osiągnięcie rozdzielczości w nanoskali. Zarówno mapowanie zmian subkomórkowych (np. po podziale komórki), jak i badania porównawcze składu chemicznego (np. wynikającego z oporności na leki) mogą być prowadzone na poziomie pojedynczej komórki u bakterii.

Mikroskopia sił atomowych w połączeniu ze spektroskopią w podczerwieni jako narzędzie do badania chemii pojedynczych bakterii

Tutaj prezentujemy zastosowanie mikroskopii sił atomowych (AFM) jako prostej i szybkiej metody charakteryzacji bakterii i analizujemy szczegóły, takie jak rozmiar i kształt bakterii, biofilmy kultur bakteryjnych oraz aktywność nanocząsteczek jako środków bakteriobójczych.

Mikroskopia sił atomowych w trybie kontaktowym jako szybka technika obserwacji morfologicznej i analizy uszkodzeń komórek bakteryjnych

Poznaj metodę immobilizacji bakterii do obrazowania mikroskopią sił atomowych w środowisku ciekłym. Technika wykorzystuje żelatynę do przymocowania komórek do powierzchni miki bez chemicznej modyfikacji próbki.

Immobilizacja bakterii do obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii sił atomowych

Przeglądaj więcej filmów