Immobilizacja bakterii do obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii sił atomowych

Mikroskopia sił atomowych (AFM) wykorzystuje mechaniczne sondowanie powierzchni do generowania obrazów o wysokiej rozdzielczości bez konieczności chemicznego traktowania próbki. W tym filmie bakterie zostają unieruchomione na powleczonej żelatyną miki i obrazowane w środowisku ciekłym za pomocą AFM. Najpierw wycina się kwadraty z miki, aby pasowały do platformy mikroskopu AFM. Górna warstwa miki zostaje usunięta, a następnie kwadraty miki są powlekane żelatyną.

Następnie na pokrytą żelatyną mikę nanosi się kropelkę zawiesiny bakteryjnej i rozprowadza ją. Próbki inkubuje się przez 10 minut, posiłkując się końcówką pipety. Następnie niezwiązane bakterie są wypłukiwane z powierzchni.

Próbkę umieszcza się w mokrej celi AFM i poddaje obrazowaniu w celu uzyskania obrazów żywych bakterii o wysokiej rozdzielczości. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak unieruchamianie na porowatym filtrze ISO, jest możliwość niezawodnego unieruchomienia zarówno bakterii pręcikowych, jak i kulistych. Ponadto większa część powierzchni komórki jest dostępna dla sondy AFM.

Kluczową zaletą mikroskopii sił atomowych w porównaniu z innymi metodami mikroskopowymi jest możliwość przeprowadzania badań na pojedynczych komórkach, co pozwala na analizę morfologii komórek, tworzenia się przegrody oraz cytokinezy. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ często stosują żelatynę, która nie zapewnia skutecznej immobilizacji bakterii, lub używają bakterii hodowanych na pożywkach złożonych, których składniki konkurują z adhezją bakterii do powierzchni żelatyny. Pomysł zastosowania tej metody zaczerpnęliśmy z eksperymentów przeprowadzonych w latach 70. XX wieku, w których stosowano immobilizację bakterii.

Szkiełka szkiełkowe powlekane żelatyną do eksperymentów z wykorzystaniem mikroskopii świetlnej i autoradiografii. W niniejszej demonstracji żywe bakterie gram-ujemne zostają unieruchomione do obrazowania FM, jednak metoda ta jest możliwa do zastosowania również w przypadku bakterii gram-dodatnich. Aby przygotować MICA, należy zacząć od przycięcia go nożyczkami tak, aby pasował do stolika mikroskopu AFM i pomieścił mokrą komorę AFM.

Następnie naklej taśmę klejącą na powierzchnię miki i odklej ją, aby zdjąć zewnętrzną warstwę miki z wyciętego fragmentu. Kontynuuj usuwanie zewnętrznej warstwy z obu stron, aż pozostaną jedynie gładkie, niepęknięte warstwy. Aby przygotować roztwór żelatyny, wlej 100 mililitrów wody destylowanej do butelki laboratoryjnej i podgrzej ją w kuchence mikrofalowej.

Gdy woda zacznie wrzeć, wyjmij ją z kuchenki mikrofalowej, dodaj 0,5 g żelatyny i delikatnie potrząsaj butelką, aż żelatyna się rozpuści. Należy pamiętać, że żelatyny wołowe nie sprawdzają się w tej procedurze. Zaleca się stosowanie żelatyn wieprzowych.

Postaw butelkę na blacie laboratoryjnym i poczekaj, aż ochłodzi się do 60–70 °C. Następnie wlej odpowiednią ilość roztworu żelatyny do małego zlewki, aby zapewnić całkowite zanurzenie MICA przy użyciu pęsety. Zanurz kwadrat MICA w ciepłym roztworze żelatyny i bezzwłocznie go wyjmij.

Umieść płytkę MICA krawędzią na ręczniku papierowym, opierając ją o statyw do mikrowirówki, aby wyschła w powietrzu przez noc. Płytka MICA pokryta żelatyną może być używana przez co najmniej dwa tygodnie. Jeśli płytka MICA pokryta żelatyną nie będzie używana przez kilka tygodni.

Umieścić go na papierze filtracyjnym w przykrytej szalce Petriego i przechowywać w temperaturze pokojowej. Nadmiar roztworu żelatyny można przechowywać w lodówce i wykorzystywać przez około miesiąc, po prostu ponownie podgrzewając roztwór zapasowy do temperatury od 60 do 70 °C. Należy zachować ostrożność, aby żelatyna nie zagotowała się podczas ponownego podgrzewania.

Przed osadzeniem bakterii na powlekanej żelatyną płytce MICA należy upewnić się, że stężenie bakterii jest odpowiednie. Należy użyć spektrofotometru, aby zmierzyć gęstość optyczną próbki bakterii przy długości fali 600 nanometrów. Optymalna wartość OD mieści się w zakresie od 0,5 do 1.

Następnie przenieś 1 mL hodowli do probówki do mikrowirówki i odwiruj w celu utworzenia osadu. Za pomocą pipety usuń nadsącz, a następnie przemyj osad w 1 mL filtrowanej wody dejonizowanej lub buforu. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby resuspenderować osad.

Odwirować osad, a następnie bezzwłocznie go resuspender. W 500 µL nanopure wody dejonizowanej zawiesina bakteryjna powinna być widocznie mętna, aby zapewnić odpowiednie stężenie komórek do obrazowania FM.

Jeśli istnieje obawa o szok osmotyczny, do roztworu obrazującego można dodać 0,25 M sacharozy. W tym przypadku resuspendowałem te bakterie w wodzie, ale nie należy obawiać się wypróbowania innych cieczy. Przykładowo, przeprowadziliśmy tę procedurę z użyciem 0,25% sacharozy, więc warto przetestować inne ciecze i sprawdzić, czy one również będą skuteczne.

Przygotuj dwa szkiełka dla każdej próbki. Za pomocą mikropipety nanieś 10 do 20 µL zawiesiny komórkowej na powierzchnię pokrytą żelatyną. Następnie, aby zapewnić odpowiednią powierzchnię obrazowania FM, użyj końcówki mikropipety do rozprowadzenia kropli w kierunku X i Y.

Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, uważając, aby nie dotknąć końcówką pipety powierzchni żelatyny. Następnie opłukać próbkę strumieniem wody i odsączyć nadmiar cieczy, przykładając krawędź próbki do ręcznika papierowego lub papieru filtracyjnego. Jedno ze szkiełek szybko wysuszyć strumieniem azotu.

Następnie dokonaj wizualnej oceny preparatu. Nieprzejrzysty punkt wskazuje, że bakterie nie zostały usunięte podczas etapu płukania. Drugi preparat, który zostanie teraz wykorzystany do obrazowania, nie może wyschnąć.

Umieść próbkę w komorze mokrej AFM i przymocuj ją za pomocą klipsów, a następnie za pomocą mikropipety dodaj wodę do komory mokrej. Zaleca się przygotowanie mikroskopu sił atomowych przed obrazowaniem w cieczy. Upewnij się, że w AFM umieszczono wspornik (cantilever) przeznaczony do obrazowania w cieczy i że jest on wyrównany z laserem.

Przeprowadź obrazowanie za pomocą mikroskopii sił atomowych, używając mikroskopu sił atomowych pico plus, wyposażonego w głowicę skanującą o rozmiarze 100 micron i sondy z azotku krzemu vico o nominalnych stałych sprężystości w zakresie od 0,01 do 0,1 nano newton per nanometer. Po przygotowaniu mikroskopu wsuń skaner FM i stolik do mikroskopu. Zazwyczaj jako prędkość obrazowania przyjmujemy zakres od 0,5 lines per second do jednej line per second, a rozdzielczość ustawia się od 128 data points per line do 512.

Ustaw instrument tak, aby zbierał obrazy przy użyciu od 128 do 512 pikseli na linię. Skanuj z prędkością od 0,5 do jednej linii na sekundę. Następnie, w razie potrzeby, dostrój punkt nastawy (set point) oraz wzmocnienia w trybie A FM, aby uzyskać optymalne obrazy.

Na koniec należy zebrać obrazy. Bakterie E coli zamocowano na powleczonej żelatyną płytce MICA zgodnie z opisem w tym filmie, a następnie wykonano obrazowanie w 0,005 molar PVS. Stosując tę metodę.

Sceptry są wyraźnie widoczne na zebranym obrazie, a powierzchnie komórek są gładkie i nie wykazują oznak odwodnienia. W porównaniu z nimi obrazy tych samych komórek e coli w powietrzu, przedstawione tutaj, często ukazują struktury niewidoczne w cieczy. W tym przypadku komórki mają pierścieniowaty wygląd z powodu odwodnienia, a widoczne są również wypustki bakteryjne, takie jak FIA.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować próbki bakteryjne do obrazowania FM w środowisku ciekłym. Po opanowaniu tej techniki procedura ta może zostać wykonana w około jedną godzinę, pod warunkiem, że mikropowierzchnie pokryte żelatyną zostały przygotowane wcześniej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest wybranie odpowiedniej żelatyny oraz zapewnienie właściwego stężenia bakterii zgodnie z opisaną procedurą.

Można przeprowadzić również inne pomiary, takie jak wykorzystanie wspornika FN jako narzędzia do pomiaru siły w celu uzyskania odczytów siły na powierzchniach bakterii. Ponadto do końcówki A FM można przytwierdzić specyficzne cząsteczki sondy, aby wchodzić w interakcje z konkretnymi celami na powierzchni bakterii w celu identyfikacji i pomiaru sił oddziaływania. Pamiętaj, że w przypadku pracy z bakteriami patogennymi przy stosowaniu tej metody zawsze należy zachować odpowiednie środki ostrożności.