Immobilizacja bakteryjna do obrazowania za pomocą mikroskopii sił atomowych

Mikroskopia sił atomowych lub FM wykorzystuje mechaniczne sondowanie powierzchni w celu generowania obrazów o wysokiej rozdzielczości bez konieczności chemicznej obróbki próbki. W tym filmie bakterie są unieruchomione na mice pokrytej żelatyną i obrazowane w płynnym środowisku przez FM. Pierwsze kwadraty MICA są przycinane tak, aby pasowały do platformy mikroskopu A FM. Górna warstwa MICA jest usuwana, a kwadraty miki są pokrywane żelatyną.

Następnie kroplę zawiesiny bakteryjnej umieszcza się na mice pokrytej żelatyną i rozprowadza. Za pomocą końcówki do pipet próbki inkubuje się przez 10 minut. Następnie niezwiązane bakterie są wypłukiwane z powierzchni.

Próbkę umieszcza się w mokrej komórce A FM i obrazuje w celu uzyskania obrazów żywych bakterii o wysokiej rozdzielczości. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mobilizacja porowatego filtra ISO, jest to, że zarówno bakterie w kształcie pręcików, jak i kuliste mogą być niezawodnie unieruchomione. Ponadto większy procent powierzchni ogniwa jest dostępny dla sondy A FM.

Kluczową zaletą mikroskopii sił atomowych w porównaniu z innymi mikroskopiami jest to, że można prowadzić badania pojedynczych komórek, badać morfologię komórek, tworzenie przegrody i cytokinezę. Osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały problemy, ponieważ mają tendencję do używania żelatyny, która nie została udowodniona, że unieruchamia bakterie lub używane bakterie hodowane w złożonym podłożu, w którym składniki będą konkurować z przyczepnością bakterii do powierzchni żelatyny. Pomysł na tę metodę zrodził się w eksperymentach przeprowadzonych w latach siedemdziesiątych, w których unieruchomiono bakterie.

Szkiełka podstawowe pokryte żelatyną do eksperymentów z wykorzystaniem mikroskopii świetlnej i radiografii automatycznej. W tej demonstracji żywe bakterie Gram-ujemne są unieruchamiane w celu obrazowania FM, ale metoda ta ma również zastosowanie do bakterii Gram-dodatnich. Aby przygotować MICA, zacznij od przycięcia go nożyczkami, aby pasował do stolika mikroskopu A FM i pasował do mokrej komórki A FM.

Następnie umieść taśmę klejącą na powierzchni MICA i usuń ją, aby oderwać zewnętrzną warstwę MICA od wyciętego kawałka. Kontynuuj usuwanie zewnętrznej warstwy z obu stron, aż pozostaną tylko gładkie, nieprzerwane warstwy. Aby przygotować roztwór żelatyny, dodaj 100 mililitrów wody destylowanej do butelki laboratoryjnej i podgrzej ją w kuchence mikrofalowej.

Gdy woda zacznie wrzeć, wyjmij ją z kuchenki mikrofalowej, dodaj 0,5 grama żelatyny i delikatnie spęczniaj butelkę, aż żelatyna się rozpuści. Należy pamiętać, że żelatyny bydlęce nie działają dobrze w tej procedurze. Zalecane są żelatyny wieprzowe.

Umieść butelkę na blacie stołu i pozwól jej ostygnąć do 60 do 70 stopni Celsjusza. Następnie wlej odpowiednią ilość roztworu żelatyny do małej zlewki, aby upewnić się, że MICA można całkowicie zanurzyć za pomocą kleszczy. Zanurz kwadrat MICA w ciepłym roztworze żelatyny i szybko go wycofaj. Natychmiast.

Umieść MICA na krawędzi na ręczniku papierowym opartym o stojak na mikrowirówkę, aby wyschnąć w powietrzu przez noc. MICA pokryty żelatyną można stosować przez co najmniej dwa tygodnie. Jeśli pokryty żelatyną, MICA nie będzie używany przez kilka tygodni.

Umieść go na bibule filtracyjnej na przykrytej szalce Petriego i przechowuj w temperaturze pokojowej. Nadmiar roztworu żelatyny można przechowywać w lodówce i używać przez około miesiąc, po prostu podgrzewając roztwór podstawowy do temperatury od 60 do 70 stopni. W stopniach Celsjusza należy uważać, aby żelatyna nie gotowała się podczas podgrzewania.

Przed zamontowaniem bakterii na pokrytym żelatyną MICA należy upewnić się, że stężenie bakterii jest odpowiednie. Użyj spektrofotometru, aby uzyskać odczyt gęstości optycznej próbki bakteryjnej przy 600 nanometrach. Optymalna jest średnica zewnętrzna 0,5 do jednego.

Następnie przenieś jeden mililitr kultury do mikroprobówki wirówkowej i odwiruj ją w celu osadzenia po odwirowaniu. Za pomocą pipety usuń supernatant, a następnie umyj osad w jednym mililitrze przefiltrowanej wody dejonizowanej lub buforu. Delikatnie pipetuj w górę i w dół do resus.

Zawieś pelet, odwiruj swój zysk i natychmiast ponownie zawieś pelet. W 500 mikrolitrach nano czystej wody dejonizowanej zawiesina bakteryjna powinna być widocznie zadarna, aby uzyskać odpowiednie stężenie komórek. Do obrazowania FM.

Jeśli wstrząs osmotyczny jest problemem, do roztworu do obrazowania można dodać sacharozę o sile 0,25 mola. Zawiesiłem tę bakterię w wodzie, ale nie bój się próbować innych płynów. Na przykład zrobiliśmy to z 0,25% sacharozy, więc wypróbuj inne płyny i zobacz, czy to też zadziała.

Przygotuj dwa szkiełka podstawowe dla każdej próbki. Za pomocą mikropipetera dodaj od 10 do 20 mikrolitrów zawiesiny komórek na powierzchnię pokrytą żelatyną. Następnie, aby zapewnić odpowiedni obszar pokrycia dla obrazowania FM, użyj końcówki mikropipety, aby rozprowadzić kroplę zarówno w kierunku X, jak i Y.

Uważając, aby nie dotknąć fizycznie powierzchni żelatyny końcówką pipety, inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie spłucz strumieniem wody odchować nadmiar płynu z próbki, dotykając krawędzią próbki ręcznika papierowego lub bibuły filtracyjnej. Szybko wysusz jedno ze szkiełek za pomocą strumienia gazowego azotu.

Następnie sprawdź wzrokowo szkiełko. Nieprzezroczysta plama wskazuje, że bakterie nie zostały usunięte na etapie prania. Drugi szkiełko, które będzie teraz używane do obrazowania, nie powinno być dopuszczone do wyschnięcia.

Umieść go w mokrym etapie A FM i zabezpiecz go za pomocą klipsów, za pomocą mikropipety dodaj wodę do mokrego etapu. Dobrym pomysłem jest przygotowanie mikroskopu sił atomowych przed obrazowaniem w cieczy. Upewnij się, że wspornik do obrazowania w cieczy jest umieszczony w A FM i jest ustawiony w jednej linii z laserem.

Kontynuuj obrazowanie za pomocą mikroskopii sił atomowych przy użyciu mikroskopu sił atomowych pico plus, wyposażonego w głowicę skanującą o średnicy 100 mikronów i sondy z azotku krzemu vico o nominalnych stałych sprężystości w zakresie od 0,01 do 0,1 nanoniutona na nanometr. Po przygotowaniu mikroskopu włóż skaner FM i stolik do mikroskopu. Zazwyczaj zaczynamy od 0,5 linii na sekundę do jednej linii na sekundę, ponieważ nasza prędkość obrazowania i rozdzielczość są ustawione od 1 28 punktów danych na linię do 512.

Ustaw instrument tak, aby zbierał obrazy przy użyciu od 128 do 512 pikseli na linię. Skanowanie z szybkością od 0,5 do jednej linii na sekundę. Następnie, w razie potrzeby, dostosuj nastawę i wzmocnienia na A FM, aby uzyskać optymalne obrazy.

Na koniec zbierz obrazy. Bakterie E. coli zostały zamontowane na pokrytym żelatyną MICA, jak opisano w tym filmie, a następnie zobrazowane w 0,005 molowym PVS. Za pomocą tej metody.

Berła są wyraźnie widoczne na zebranym obrazie, a powierzchnie komórek są gładkie, bez oznak odwodnienia. Dla porównania, zdjęcia wykonane tym samym E. coli w powietrzu, jak pokazano tutaj, często pokazują struktury niewidoczne w cieczy. W tym przypadku komórki wykazują wygląd pierścieniowy z powodu odwodnienia i można zobaczyć przydatki bakteryjne, takie jak FIA.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki bakterii do obrazowania FM w płynnym środowisku. Po opanowaniu techniki tej można ją wykonać w ciągu około godziny, jeśli mikropowierzchnie pokryte żelatyną zostały wcześniej przygotowane w postaci złoża. Podejmując tę procedurę, ważne jest, aby wybrać odpowiednią żelatynę i mieć odpowiednie stężenie bakterii Zgodnie z tą procedurą.

Można wykonać inne pomiary, takie jak użycie wspornika FN jako narzędzia do wykrywania siły w celu utrzymania pomiarów siły na powierzchniach bakteryjnych. Ponadto określone cząsteczki sondy mogą być przywiązane do końcówki A FM, aby wchodzić w interakcje z określonymi celami na powierzchni bakterii w celu identyfikacji i pomiaru sił interakcji. Ogólnie rzecz biorąc, nie zapominaj, że jeśli pracujesz z bakteriami chorobotwórczymi, zawsze należy zachować środki ostrożności podczas pracy z tą metodą.