Name: Wykrywanie zakaźnego wirusa od komarów zebranych w terenie za pomocą testu hodowli komórek Vero (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj metodę wykrywania wirusów z komarów zebranych w terenie za pomocą hodowli komórek Vero. Technika ta pozwala zidentyfikować różnorodne patogeny wirusowe i wspiera badania w dziedzinie entomologii medycznej oraz zdrowia publicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy wdzięczność za istotny wkład dr. Johna Andersona, dr. Andrew Maina i dr Shirley Tirrell w niniejsze badanie. Praca ta była częściowo finansowana z grantów przyznanych przez Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) oraz Departament Rolnictwa USA (58-6615-1-218, CONH00768 oraz CONH00773).

1. Sortowanie i identyfikacja komarów
<ol>
	<li>Poniższe procedury są wykonywane na otwartym blacie laboratoryjnym w wyspecjalizowanym laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) przez personel przeszkolony w pracy z żywymi komarami. Przez cały czas trwania procedury zachowany jest „łańcuch chłodniczy”.</li>
	<li>Zanurz komary dorosłe w stanie anestezji, umieszczając worek do zbierania komarów w zamrażarce o temperaturze -20° przez 5 minut. Przenieś worek do izolowanego pojemnika zawierającego suchy lód. Zamknij pokrywę i poddaj komary działaniu dwutlenku węgla przez 1-3 minuty, aby zapewnić całkowity nokdaun.</li>
	<li>Wysyp znieczulone komary na schłodzoną wcześniej tackę umieszczoną na warstwie suchego lodu. Oddziel pojedyncze samice komarów za pomocą precyzyjnej pęsety i umieść je w plastikowych pojemniczkach do porcji. Przykryj pokrywką i ustaw pojemniczki na mokrym lodzie.</li>
	<li>Zidentyfikuj gatunki komarów, korzystając z opisowych kluczy taksonomicznych opartych na morfologii zewnętrznej komarów, z pomocą stereomikroskopu sekcyjnego (zoom 10-60X) zamontowanego na elektronicznym stole chłodzącym.</li>
	<li>Połącz zidentyfikowane gatunki komarów w puły liczące ≤50 osobników w probówkach z zatrzaskową zakrętką o pojemności 2 mL zawierających miedzianą kuleczkę BB. Probówki są oznaczane unikalnym identyfikatorem.</li>
	<li>Po identyfikacji wszystkich komarów probówki są umieszczane w oznakowanych workach i przechowywane w styropianowej lodówce zawierającej suchy lód.</li>
	<li>Przechowuj puły komarów w zamrażarce o temperaturze -80° C do czasu przeprowadzenia testów wirusologicznych.</li>
</ol>
2. Kwestie bezpieczeństwa biologicznego przy izolacji wirusa z komarów
<ol>
	<li>Poniższe procedury są wykonywane w laboratorium o 3. poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3) przez personel przeszkolony do pracy na tym poziomie zabezpieczeń1. Zaplecze laboratoryjne, sprzęt, procedury i praktyki podlegają nadzorowi oraz inspekcjom instytucjonalnym, stanowym i federalnym. Przed przystąpieniem do poniższych protokołów należy przejść odpowiednie szkolenie i uzyskać niezbędne zgody.</li>
	<li>Podczas każdej procedury należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE), takie jak jednorazowe fartuchy, rękawiczki, przyłbice i maski z filtrem.</li>
	<li>Powierzchnie robocze należy zdezynfekować 70% alkoholem przed i po zakończeniu procedur.</li>
	<li>Hodowle komórkowe oraz materiały potencjalnie zakaźne są obsługiwane w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II (BSC).</li>
	<li>Pule komarów są homogenizowane w młynku z mieszadłem umieszczonym wewnątrz BSC.</li>
	<li>Homogenaty z komarów są wirowane w mikrowirówce z zabezpieczeniem przed aerozolami. Jeśli procedura ta nie może być przeprowadzona w BSC, operator powinien nosić maskę z filtrem podczas obsługi wirówki i wyjmowania z niej próbek.</li>
	<li>Pipety i końcówki do pipet używane do obsługi materiału w BSC (komorze z laminarnym przepływem powietrza) są moczone w 10% roztworze wybielacza przed autoklawowaniem. Wszystkie odpady laboratoryjne są dekontaminowane w autoklawie przed utylizacją.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek Vero
<ol>
	<li>Zlać pożywkę z jednej dużej kolby do hodowli tkanek (175 cm2) konfluentnych komórek Vero (klon E6) do zlewki z odpadami zawierającej wybielacz.</li>
	<li>Przemyć komórki Vero, dodając 5 ml PBS i delikatnie nim poruszając nad warstwą komórek oraz wzdłuż ścianek kolby, aby upewnić się, że cała monowarstwa została dokładnie pokryta.</li>
	<li>Zlej PBS do zlewki na odpady.</li>
	<li>Dodać 2,5 ml Trypsyny-EDTA i delikatnie wymieszać ruchem wirowym nad warstwą komórek, upewniając się, że cała monowarstwa została dokładnie pokryta.</li>
	<li>Inkubować kolbę w inkubatorze przez 5 minut w temperaturze 37°C&deg;C, 5% CO2.</li>
	<li>Delikatnie wstrząśnij i zakręć kolbą, aby oddzielić komórki od powierzchni dna. Komórki powinny łatwo odkleić się od powierzchni; jeśli tak się nie dzieje, inkubuj przez dodatkowe 1–5 minut.</li>
	<li>Dodaj 5 ml Minimal Essential Media (MEM) z 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), używając pipety serologicznej, a następnie pipetuj ciecz w górę i w dół 10–20 razy, aby rozbić skupiska komórek.</li>
	<li>Dodać kolejne 15 ml MEM z 5% FBS, aby uzyskać objętość całkowitą 22,5 ml, i dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Umieść 40 małych kolb do hodowli tkankowych (25 cm2) w pozycji pionowej w dwóch statywach (20 kolb/statyw).</li>
	<li>Umieścić statywy z kolbami wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza i zdjąć korki z kolb, układając je bezpośrednio przed naczyniami.</li>
	<li>Do każdej kolby nanieś 4 ml pożywki MEM z 5% FBS za pomocą pipety serologicznej.</li>
	<li>Przenieś po 0,5 ml zawiesiny komórek do każdej kolby (&tilde;stosunek pasażowania 1:6) Zakręć kolby.</li>
	<li>Do pierwotnej dużej kolby do hodowli tkankowej zawierającej pozostałą zawiesinę komórek dodać 50 ml pożywki MEM z 5% FBS (&tilde;(2,5 ml) i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze. Tę samą dużą kolbę do hodowli tkankowej można wykorzystywać do 5 pasaży, po czym należy przygotować nową kolbę w celu jej zastąpienia.</li>
	<li>Umieść małe kolby do hodowli tkankowej w stosach na tacy. Poruszaj tacą okrężnymi ruchami, aby upewnić się, że pożywka równomiernie pokrywa dno kolb.</li>
	<li>Umieścić małe kolby w inkubatorze w temperaturze 37°C&deg; C, 5% CO2 i inkubować przez noc aż do osiągnięcia 80-90% konfluencji.</li>
</ol>
4. Przygotowanie pul komarów
<ol>
	<li>Przez cały czas trwania procedur testowych należy utrzymywać niską temperaturę pul komarów. Podczas przetwarzania pul komarów należy używać wstępnie schłodzonych statywów do zamrażarki i kaset do młynka homogenizującego, lodowatych odczynników oraz wirówki z chłodzeniem.</li>
	<li>Umieścić probówki zawierające komary w wstępnie schłodzonym statywie do zamrażarki i dodać do każdej probówki 1- 1.5 mL PBS-G.</li>
	<li>Wyjąć kasety do młynka homogenizującego z zamrażarki. Umieścić 24 probówki w każdej kasecie, a następnie zabezpieczyć je w młynku homogenizującym.</li>
	<li>Homogenizować próbki przez 4 minuty przy 25 cyklach/sekundę. Młynek homogenizujący wstrząsa probówkami z dużą prędkością, a znajdująca się w każdej z nich metalowa kulka BB rozdrabnia tkanki komarów.</li>
	<li>Wirować probówki przez 6 minut przy 7,000 rpm.</li>
	<li>Umieścić probówki z powrotem w statywach do zamrażarki aż do momentu inokulacji do komórek Vero.</li>
</ol>
5. Inokulacja komórek Vero homogenatami z pul komarów
<ol>
	<li>Sprawdzić pod mikroskopem odwróconym co najmniej jedną flaskę z każdej serii, aby upewnić się, że konfluencja i kondycja komórek są odpowiednie; oczekiwany stopień pokrycia to około 80-90%.</li>
	<li>Ustawić 20 małych flasek do hodowli tkankowych w statywie i opisać je numerami dostępu odpowiadającymi poszczególnym pulom komarów.</li>
	<li>Poluzować zakrętki i odlać większość pożywki z flasek do naczynia na odpady. Pozostawić w flaskach tyle pożywki, aby całkowicie pokryć monowarstwę komórek.</li>
	<li>Przenieść 100μL supernatantu z każdej przetworzonej puli komarów do odpowiadającej jej flaski do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Założyć zakrętkę i mocno ją dokręcić.</li>
	<li>Położyć flaski poziomo na inkubatorze z wytrząsaniem na 5 minut (w temperaturze pokojowej) przy 35-40 rpm.</li>
	<li>Ustawić 20 flasek do hodowli tkankowych pionowo w statywie i umieścić je w BSC.</li>
	<li>Odkręcając zakrętki z 3 flasek jednocześnie, nalać do każdej z nich 4 mL pożywki wzrostowej za pomocą pipety serologicznej; ponownie zakręcić flaski.</li>
	<li>Należy upewnić się, że końcówka pipety nie dotyka szyjki ani krawędzi flaski. W przypadku kontaktu z flaską należy zmienić końcówkę pipety.</li>
	<li>Inkubować flaski do hodowli tkankowych w temperaturze 37°C, przy 5% CO2.</li>
</ol>
6. Przesiewowe badanie komórek Vero pod kątem wzrostu wirusa
<ol>
	<li>Przez okres od 3 do 7 dni po inokulacji monitorować zaszczepione kolby z kulturami tkankowymi pod kątem oznak infekcji wirusowej, czyli efektu cytopatycznego (CPE).</li>
	<li>Wizualnie ocenić kultury komórkowe pod kątem CPE i/lub kontaminacji, przechylając kolby i badając pożywkę gromadzącą się na ich dnie. Pożywka stanie się mętna w miarę degradacji komórek podczas CPE lub w wyniku wzrostu drożdżaków, grzybów bądź kontaminacji bakteryjnej.</li>
	<li>Ponownie zbadać pod mikroskopem odwróconym kultury komórkowe, w których pożywka jest mętna. Wirusy spowodują deformację komórek i ich odrywanie się od ścianek kolb z kulturą. Kultury komórkowe z widocznymi zanieczyszczeniami, np. drożdżakami, innymi bakteriami, grzybami lub dużymi ilością szczątków komarów, poddać ponownemu badaniu poprzez przepuszczenie oryginalnej puli komarów przez filtr strzykawkowy 0.22μM.</li>
	<li>Aseptycznie przenieść 1-2 mL pożywki z dodatnich pod kątem obecności wirusa kultur komórkowych do oznakowanych krioprobówek za pomocą pipety serologicznej.</li>
	<li>Kultury wirusów przechowywać w temperaturze -80° C do czasu ich identyfikacji przy użyciu odpowiednich testów diagnostycznych.</li>
</ol>
7. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>MEM, 5% FBS. Rozpuścić 37,6 g sproszkowanego MEM w końcowej objętości 4 L dd H20. Rozlać roztwór do butelek z pożywką w alikwotach 500 mL i wysterylizować w autoklawie. Po ochłodzeniu roztworu do każdej butelki aseptycznie dodać 26 mL inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej, 5,2 mL L-Glutaminy, 5,2 mL antybiotyku/antymykotyku oraz 10,4 mL 7,5% wodorowęglanu sodu. Przechowywać w temperaturze 4° C.</li>
	<li>PBS-G. Rozpuścić 16 g NaCl, 0,4 g KCl, 2,3 g Na2HPO4, 0,4 g KH2PO4 oraz 4 mL 0,5% czerwieni fenolowej w 1000 mL dd H20. Jeśli to konieczne, dostosować pH do poziomu 7,1-7,4 za pomocą 2 N NaOH. W osobnym zlewce zagotować 600 mL H20. Zdjąć z płyty grzejnej, dodać 10 g żelatyny i rozpuścić. Dodać roztwór rozpuszczonej żelatyny do roztworu PBS i uzupełnić końcową objętość do 2 L za pomocą dd H2O. Rozlać roztwór do butelek w ilościach 100 mL i wysterylizować w autoklawie. Po ochłodzeniu roztworu aseptycznie dodać 42,8 mL inaktywowanej ciepłem surowicy króliczej oraz 1,4 mL antybiotyku/antymykotyku. Przechowywać w temperaturze 4° C.</li>
	<li>PBS do przemywania komórek. Dodać 50 mL 10X PBS Dulbecco do 400 mL dd H2O. Dostosować pH do poziomu 7,1 za pomocą 2 N NaOH. Uzupełnić końcową objętość do 500 mL za pomocą dd H2O. Przefiltrować roztwór za pomocą próżniowej jednostki filtrującej 0,2uM. Rozlać do probówek z nakrętką 8 mL w alikwotach 5 mL. Przechowywać w temperaturze 4° C.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
Z komarów zebranych podczas ciągłego monitoringu w całym stanie Connecticut w latach 1997-2010 wyizolowano dziewięć różnych wirusów z 4 rodzin taksonomicznych (tabela 1). Pięć z tych wirusów wiadomo, że wywołuje choroby u ludzi, a najważniejszymi patogenami są wirus zachodniego Nilu oraz wirus wschodniego zapalenia mózgu koni. Do nowych odkryć należą: pierwsza izolacja WNV z komarów zebranych w Ameryce Północnej w 1999 roku2, pierwsza izolacja wirusa Potosi w północno-wschodnich USA w 2000 roku3 oraz pierwsza izolacja wirusa La Crosse w Nowej Anglii w 2005 roku4.

<table border="1">
<tbody >
 <tr>
 <td>Wirus</td>
 <td>Rodzina</td>
 <td>Liczba izolatów</td>
 <td>Liczba lokalizacji</td>
 <td>Liczba lat wykrywania</td>
 <td>Choroba u ludzi</td>
 <td>Ref.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wirus Nilu Zachodniego</td>
 <td>Flaviviridae</td>
 <td>1,002</td>
 <td>94</td>
 <td>12</td>
 <td>Od umiarkowanej do ciężkiej, gorączka, zapalenie mózgu</td>
 <td>2,5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wirus wschodniego zapalenia mózgu koni</td>
 <td>Togaviridae</td>
 <td>292</td>
 <td>41</td>
 <td>10</td>
 <td>Ciężka, zapalenie mózgu</td>
 <td>6,7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wirus Highlands J</td>
 <td>Togaviridae</td>
 <td>178</td>
 <td>39</td>
 <td>11</td>
 <td>Nieznana</td>
 <td>6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wirus Jamestown Canyon</td>
 <td>Bunyaviridae</td>
 <td>305</td>
 <td>74</td>
 <td>14</td>
 <td>Od łagodnej do umiarkowanej, gorączka, zapalenie opon mózgowych</td>
 <td>8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wirus Potosi</td>
 <td>Bunyaviridae</td>
 <td>259</td>
 <td>76</td>
 <td>4</td>
 <td>Nieznana</td>
 <td>3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wirus Cache Valley</td>
 <td>Bunyaviridae</td>
 <td>114</td>
 <td>51</td>
 <td>8</td>
 <td>Od łagodnej do ciężkiej, gorączka, choroba neurologiczna w dwóch udokumentowanych przypadkach</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wirus Trivittatus</td>
 <td>Bunyaviridae</td>
 <td>83</td>
 <td>21</td>
 <td>11</td>
 <td>Nieznana</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wirus La Crosse</td>
 <td>Bunyaviridae</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 <td>Od umiarkowanej do ciężkiej, zapalenie mózgu</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wirus Flanders</td>
 <td>Rhabdoviridae</td>
 <td>4</td>
 <td>4</td>
 <td>2</td>
 <td>Nieznana</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
Tabela 1. Wirusy wykryte w komarach zebranych w terenie za pomocą testu hodowli komórek Vero. Komary zostały zebrane podczas nadzoru stanowego w Connecticut w latach 1997-2010.

<ol><li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChosewood%2C+LC+%22Biosafety+in+Microbiological+and+Biomedical+Laboratories%22">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories</a>. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).</li>
<li>Anderson, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+West+Nile+virus+from+mosquitoes%2C+crows%2C+and+a+Cooper%27s+hawk+in+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut.</a> Science. 286, 2331-2333 (1999).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolations+of+Potosi+virus+from+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+collected+in+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut.</a> J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+genetic+variant+of+La+Crosse+virus+%28Bunyaviridae%29+isolated+from+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England.</a> Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+West+Nile+virus+in+Connecticut%2C+USA%3A+a+five+year+analysis+of+mosquito+data+1999-2003%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+isolations+of+eastern+equine+encephalitis+and+highlands+J+viruses+from+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+during+a+1996+epizootic+in+southeastern+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut.</a> J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eastern+equine+encephalitis+virus+in+mosquitoes+and+their+role+as+bridge+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors.</a> Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolations+of+Jamestown+Canyon+virus+%28Bunyaviridae%3A+Orthobunyavirus%29+from+field-collected+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+in+Connecticut%2C+USA%3A+a+ten-year+analysis%2C+1997-2006%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).</li>
<li>Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaty%2C+BJ+%22Diagnostic+Procedures+for+Viral%2C+Rickettsial%2C+and+Chlamydial+Infections%22">Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections</a>. , American Public Health Association. 189-212 (1995).</li>
<li>Karabatsos, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarabatsos%2C+N+%22International+Catalogue+of+Arboviruses+Including+Certain+Other+Viruses+of+Vertebrates%22">International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates</a>. , American Society of Tropical Medicine and Hygiene. (1985).</li>
<li>Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+west+nile+virus+from+human+clinical+specimens%2C+field-collected+mosquitoes%2C+and+avian+samples+by+a+TaqMan+reverse+transcriptase-PCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay.</a> J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).</li>
<li>Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+North+American+eastern+and+western+equine+encephalitis+viruses+by+nucleic+acid+amplification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays.</a> J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Test z użyciem hodowli komórek Vero służy jako skuteczna metoda przesiewowa w celu wykrycia różnorodnych wirusów w komarach zebranych w terenie. Kontrastuje to z metodami molekularnymi, które są skierowane specyficznie na jeden lub kilka wybranych wirusów. Co więcej, stwierdziliśmy, że test z użyciem hodowli komórek Vero jest równie czuły, a być może nawet bardziej niż RT-PCR7, i dostarcza izolatów wirusów, które są przechowywane w naszej kolekcji referencyjnej do przyszłych badań. Niemniej jednak, systemy hod...

<table><tbody><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16140</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwbakteryjny/przeciwgrzybiczy</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15240</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 7,5% roztwór</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM 100x</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Sproszkowana minimalna pożywka niezbędna (MEM)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11700</td><td></td></tr><tr><td>10X Dulbecco&amp;rsquo;bufor PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14080</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15400</td><td></td></tr><tr><td>Surowica królicza</td><td>GIBCO, firmy Life Technologies</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Komórki Vero (klon E6)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Małe baloniki do hodowli tkankowej, z nakrętkami z filtrem, 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Falcon BD</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Duże butle do hodowli tkankowej, z nakrętkami z filtrem, 175 cm²&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Falcon BD</td><td>353108</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki BB powlekane miedzią&amp;rsquo;s, 4,5 mm</td><td>Crosman</td><td>0767</td><td></td></tr><tr><td>Młyn mieszający</td><td>Retsch</td><td>MM300</td><td></td></tr><tr><td>Stativy do zamrażarek Isopack</td><td>Eppendorf</td><td>022510240</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie wirusów zakaźnych z komarów zebranych w terenie za pomocą testu hodowli komórek vero

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Komary przenoszą szereg odrębnych wirusów, w tym istotne patogeny ludzkie, takie jak wirus zachodniego Nilu, wirus dengi oraz wirus chikungunya. Wiele z tych wirusów nasiliło swoją aktywność w obszarach endemicznych i rozprzestrzeniło się na nowe terytoria, co wymusza wprowadzenie skutecznych programów nadzoru i kontroli w celu odpowiedzi na te zagrożenia. Jedną ze strategii monitorowania aktywności wirusów jest odłów dużej liczby komarów z obszarów endemicznych i badanie ich pod kątem zakażenia wirusowego. W niniejszym artykule opisujemy sposób obchodzenia się, przetwarzania i przesiewania komarów odłowionych w terenie w celu wykrycia zakaźnych wirusów za pomocą testu z hodowlą komórek Vero. Komary są sortowane według lokalizacji pułapki i gatunku, a następnie grupowane w pule zawierające ≤50 osobników. Próbki z pul są homogenizowane w soli fizjologicznej z buforem przy użyciu młyna mieszalnikowego, a fazę wodną inokuluje się na konfluentne hodowle komórek Vero (klon E6). Hodowle komórkowe są monitorowane pod kątem efektu cytopatycznego od 3. do 7. dnia po inokulacji, a wszelkie wirusy wyhodowane w kulturze komórkowej są identyfikowane za pomocą odpowiednich testów diagnostycznych. Stosując to podejście, wyizolowaliśmy 9 różnych wirusów z komarów odłowionych w Connecticut w USA, z których 5 znanych jest z wywoływania chorób u ludzi. Trzy z tych wirusów (wirus zachodniego Nilu, wirus Potosi oraz wirus La Crosse) stanowią nowe rekordy dla Ameryki Północnej lub regionu Nowej Anglii od 1999 roku. Zdolność do wykrywania szerokiej różnorodności wirusów jest kluczowa dla monitorowania zarówno uznanych, jak i nowo pojawiających się wirusów w populacji komarów.

Opisujemy metodę przetwarzania i przesiewania komarów zebranych w terenie pod kątem różnorodnych wirusów za pomocą testu z hodowlą komórek Vero. Stosując tę technikę, wykryliśmy 9 różnych wirusów z 4 rodzin taksonomicznych w komarach zebranych w Connecticut.

Wykrywanie wirusów zakaźnych z komarów zebranych w terenie za pomocą testu hodowli komórek Vero

Komary przenoszą szereg różnych wirusów, w tym istotne patogeny ludzkie, takie jak wirus zachodniego Nilu, wirus dengi oraz wirus chikungunya. Wiele...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przesiewowe badanie komarów zebranych w terenie pod kątem infekcji wirusowej za pomocą testu z hodowlą komórek Vero. Najpierw komary zebrane w terenie są sortowane według gatunków. Następnie komary są homogenizowane przy użyciu młynka mieszającego.Po przygotowaniu homogenatów komarów, komórki Vero są hodowane w ramach przygotowania do testów wirusologicznych; następnie każda hodowla komórek Vero jest szczepiona pojedynczym homogenatem komarów, umieszczanym na wytrząsarce przez pięć minut, a następnie inkubowana w temperaturze 37 °C w celu umożliwienia replikacji wirusów. Ostatecznie hodowle są badane wizualnie pod kątem obecności wirusowo indukowanych efektów cytopatycznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak R-T-P-C-R, jest możliwość przesiewowego badania komarów w kierunku szerokiego spektrum czynników wirusowych namnażających się w hodowlach komórkowych.Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu entomologii medycznej, takie jak role, jakie odgrywają poszczególne gatunki komarów w podtrzymywaniu transmisji wirusów. Poniższą procedurę należy przeprowadzać w laboratorium o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2). Worek z żywymi komarami należy umieścić w temperaturze -20 °C na 15 minut w celu ich znieczulenia.Po znieczuleniu owadów przenieś worek do izolowanego pojemnika z suchym lodem i poddaj komary działaniu dwutlenku węgla przez jedną do trzech minut, aby zapewnić ich całkowite unieruchomienie. Następnie umieść komary na schłodzonej wcześniej tacy ustawionej na warstwie suchego lodu. Używając pęsety z cienką końcówką, wyselekcjonuj samice i przenieś je do plastikowych kubeczków porcjyjnych.Samice można odróżnić od samców poprzez badanie aparatów gębowych i czułków. Zamknąć szczelnie probówki i umieścić je w lodzie. Wykorzystując stereomikroskop sekcyjny zamontowany na elektronicznym stole chłodzącym oraz klucz taksonomiczny.Zidentyfikuj gatunek każdego komara i pogrupuj komary tego samego gatunku w opisanych probówkach z zakrętką typu snap cap o pojemności dwóch mililitrów, zawierających miedzianą kuleczkę. W jednej probówce można zgromadzić do 50 osobników w miarę ich wypełniania. Umieść probówki w opisanych woreczkach, a następnie w pojemniku styropianowym na suchym lodzie.Po zidentyfikowaniu wszystkich komarów można je przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu homogenizacji. Procedurę tę należy przeprowadzać w laboratorium o trzecim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3), pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II. Do każdej probówki należy dodać około 1 mL PBSG, a następnie umieścić probówki z komarami w uprzednio schłodzonej kasecie młyna mieszającego.Zabeziecz załadowaną kasetę w młynku homogenizującym i homogenizuj pule komarów przez cztery minuty przy 25 cyklach na sekundę. Po homogenizacji komarów przenieś probówki do szczelnej wobec aerozoli chłodzonej mikrowirówki i odwiruj. Homogenizat z komarów wiruj przy 7 000 RPM przez sześć minut.Po wirowaniu probówki można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przeprowadzenia testów wirusowych. Zlać medium hodowlane z kolby T 175 z konfluentnymi komórkami farrow do zlewka z wybielaczem. Do kolby dodać 5 mL PBS i równomiernie wypłukać komórki, a następnie zlać PBS do zlewka z odpadami.Po wypłukaniu komórek należy dodać 2,5 ml tripsyny z EDTA i inkubować kolbę w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez pięć minut, aby odlepić komórki. Po odlepieniu komórek należy dodać 5 ml MEM i kilkukrotnie pipetować zawiesinę, aby rozbić wszelkie agregaty. Następnie należy dodać kolejne 15 ml MEM.Umieść 40 kolb T 25 na dwóch statywach wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego i zdejmij nakrętki, kładąc je bezpośrednio przed każdą kolbą. Używając sterylnej pipety, odmierz i dodaj 4 ml MEM do każdej kolby. Następnie dodaj 0,5 ml zawiesiny komórek vari i zakręć kolby. Ustaw kolby na tacy i delikatnie nimi zakręć, aby upewnić się, że pożywka równomiernie pokrywa dno kolb.Inkubuj kultury w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez noc lub do momentu, gdy komórki osiągną 80 do 90% konfluencji. Wyjmij z inkubatora 20 małych kolbek i opisz je odpowiednim numerem dostępu z każdej puli komarów. Odlej większość pożywki z każdej kolbki do pojemnika na odpady, pozostawiając tylko tyle pożywki, aby pokryć monowarstwę komórek.Przenieś 100 µl supernatantu z każdego homogenatu komarów do odpowiednio oznakowanej kolby i szczelnie je zamknij. Po przeniesieniu supernatantów umieść kolby na wytrząsarce ustawionej na 35 do 40 RRP M na pięć minut. Przenieś kolby z powrotem do komory bezpiecznej i dodaj do każdej z nich cztery ml pożywki wzrostowej.Zamknąć kolby i inkubować je w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez trzy do siedmiu dni. Po przygotowaniu kultur do przesiewania, w pierwszej kolejności ocenić wizualnie pożywkę. Mętna pożywka wskazuje na cytopatyczny efekt wywołany przez wirusa, zanieczyszczenie innymi mikroorganizmami lub obie te przyczyny; w takim przypadku należy zbadać kultury wykazujące zmętnienie pożywki pod odwróconym mikroskopem świetlnym.Wirusy zazwyczaj powodują deformację komórek i ich odrywanie się od kolb hodowlanych. W przypadku wykrycia kontaminacji bakteriami, drożdżami lub grzybami, bądź jeśli hodowla zawiera dużo szczątków komarów, należy ponownie przebadać pierwotną pulę komarów po przefiltrowaniu jej przez strzykawkę z filtrem 0,22 mikrona. Aseptycznie przelać jeden do dwóch mililitrów pożywki z kultur dodatnich pod kątem wirusów, które nie są skontaminowane innymi mikroorganizmami, do oznakowanych probówek kriogenicznych.Próbki zawierające wirusa należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu identyfikacji, wykorzystując odpowiednie testy diagnostyczne w ramach niniejszego badania. Z komarów zebranych w Connecticut w okresie ciągłego nadzoru w całym stanie od 1997 do 2010 roku wyizolowano dziewięć różnych typów wirusów z czterech rodzin taksonomicznych. Kilka z tych wirusów, w tym wirus wschodniego zapalenia mózgu koni oraz wirus Zachodniego Nilu, jest znanych z wywoływania chorób u ludzi.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak sortować, przetwarzać i badać komary pod kątem infekcji wirusowej za pomocą testu hodowli komórkowej wirusa.

detection-infectious-virus-from-field-collected-mosquitoes-vero-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykrywanie zakaźnych wirusów z komarów zebranych w terenie za pomocą testu kultury komórkowej Vero

Opisano metody wykorzystania systemów transdukcyjnych alfawirusów do ekspresji reporterów fluorescencyjnych in vitro oraz u dorosłych komarów. Technikę tę można dostosować w celu ekspresji dowolnego białka docelowego zamiast reportera lub dodatkowo do niego.

System transdukcji alfawirusów: narzędzia do wizualizacji infekcji w wektorach komarzych

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

Isolation of Mosquito-Associated Virus from Mosquito Homogenate

Ten film demonstruje test do pomiaru zależnego od przeciwciał wzmocnienia (ADE) infekcji wirusem dengi za pomocą surowicy rekonwalescencyjnej wirusa Zika. Test wykorzystuje cząstki reporterowe wirusa dengi (RVP) kodujące zielone białko fluorescencyjne. Przeciwciała w surowicy przeciwko wirusowi Zika reagują krzyżowo z RVP, tworząc kompleks. Związane przeciwciała zwiększają wychwyt RVP przez komórki wyrażające receptor Fc, który jest wykrywany za pomocą cytometrii przepływowej.

Test in vitro w celu zbadania zależnego od przeciwciał wzmocnienia infekcji wirusowej

Wirus Zika (ZIKV), nowy patogen, jest powiązany z nieprawidłowościami rozwojowymi płodu i małogłowiem. Stworzenie skutecznego systemu hodowli komórek zakaźnych ma kluczowe znaczenie dla badań nad replikacją ZIKV, a także dla opracowywania szczepionek i leków. W niniejszej pracy zilustrowano i omówiono różne testy wirusologiczne dotyczące ZIKV.

System zakaźnych hodowli komórek wirusa Zika i profilaktyczne działanie interferonów in vitro

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Prezentowany protokół może określić kompetencję wektorową populacji komarów Aedes aegypti dla danego wirusa, takiego jak Zika, w warunkach powstrzymywania.

Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

Ten protokół opisuje test immunoenzymatyczny do wykrywania sporozoitów gruczołów ślinowych u komarów. Wykorzystując łatwo dostępne przeciwciała monoklonalne, metoda umożliwia ekonomiczne, wysokoprzepustowe wykrywanie komarów przenoszących Plasmodium falciparum lub Plasmodium vivax. Metoda ta nadaje się do badań nad przenoszeniem malarii, w tym do badań wektorowych.

Wykrywanie sporozoitów Plasmodium u komarów Anopheles za pomocą testu immunoenzymatycznego

Ta metodologia, która obejmowała karmienie doustne i infekcję iniekcją dopiersiową, mogła skutecznie ocenić wpływ barier środkowego jelita i/lub gruczołów ślinowych na infekcję arbowirusem.

Eksperymentalna infekcja wirusowa u dorosłych komarów przez karmienie doustne i mikroiniekcję

Liczne nowe sekwencje wirusopodobne zostały znalezione u komarów dzięki szerokiemu zastosowaniu technologii sekwencjonowania. Zapewniamy skuteczną procedurę izolacji i amplifikacji wirusów przy użyciu linii komórkowych kręgowców i komarów, która może posłużyć jako podstawa do przyszłych badań nad wirusami związanymi z komarami, w tym wirusami przenoszonymi przez komary i specyficznymi dla komarów.

Izolacja wirusa związanego z komarami od komarów zebranych na polu

Obecny protokół opisuje rozprzestrzenianie się wirusa Zika (ZIKV) w komórkach nerkowych afrykańskiej zielonej małpy Vero oraz kwantyfikację ZIKV za pomocą komórkowych metod immunodetekcji kolorymetrycznej w formatach 24-dołkowych i 96-dołkowych (o wysokiej przepustowości).

Namnażanie wirusa i kwantyfikacja kolorymetryczna na podstawie komórek

Poznaj metodę wykrywania wirusów z komarów zebranych w terenie za pomocą hodowli komórek Vero. Technika ta pozwala zidentyfikować różnorodne patogeny wirusowe i wspiera badania w dziedzinie entomologii medycznej oraz zdrowia publicznego.

Wykrywanie wirusów zakaźnych z komarów zebranych w terenie za pomocą testu hodowli komórek Vero

Przeglądaj więcej filmów