Wykrywanie wirusów zakaźnych z komarów zebranych w terenie za pomocą testu hodowli komórek Vero

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przesiewowe badanie komarów zebranych w terenie pod kątem infekcji wirusowej za pomocą testu z hodowlą komórek Vero. Najpierw komary zebrane w terenie są sortowane według gatunków. Następnie komary są homogenizowane przy użyciu młynka mieszającego.

Po przygotowaniu homogenatów komarów, komórki Vero są hodowane w ramach przygotowania do testów wirusologicznych; następnie każda hodowla komórek Vero jest szczepiona pojedynczym homogenatem komarów, umieszczanym na wytrząsarce przez pięć minut, a następnie inkubowana w temperaturze 37 °C w celu umożliwienia replikacji wirusów. Ostatecznie hodowle są badane wizualnie pod kątem obecności wirusowo indukowanych efektów cytopatycznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak R-T-P-C-R, jest możliwość przesiewowego badania komarów w kierunku szerokiego spektrum czynników wirusowych namnażających się w hodowlach komórkowych.

Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu entomologii medycznej, takie jak role, jakie odgrywają poszczególne gatunki komarów w podtrzymywaniu transmisji wirusów. Poniższą procedurę należy przeprowadzać w laboratorium o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2). Worek z żywymi komarami należy umieścić w temperaturze -20 °C na 15 minut w celu ich znieczulenia.

Po znieczuleniu owadów przenieś worek do izolowanego pojemnika z suchym lodem i poddaj komary działaniu dwutlenku węgla przez jedną do trzech minut, aby zapewnić ich całkowite unieruchomienie. Następnie umieść komary na schłodzonej wcześniej tacy ustawionej na warstwie suchego lodu. Używając pęsety z cienką końcówką, wyselekcjonuj samice i przenieś je do plastikowych kubeczków porcjyjnych.

Samice można odróżnić od samców poprzez badanie aparatów gębowych i czułków. Zamknąć szczelnie probówki i umieścić je w lodzie. Wykorzystując stereomikroskop sekcyjny zamontowany na elektronicznym stole chłodzącym oraz klucz taksonomiczny.

Zidentyfikuj gatunek każdego komara i pogrupuj komary tego samego gatunku w opisanych probówkach z zakrętką typu snap cap o pojemności dwóch mililitrów, zawierających miedzianą kuleczkę. W jednej probówce można zgromadzić do 50 osobników w miarę ich wypełniania. Umieść probówki w opisanych woreczkach, a następnie w pojemniku styropianowym na suchym lodzie.

Po zidentyfikowaniu wszystkich komarów można je przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu homogenizacji. Procedurę tę należy przeprowadzać w laboratorium o trzecim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3), pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II. Do każdej probówki należy dodać około 1 mL PBSG, a następnie umieścić probówki z komarami w uprzednio schłodzonej kasecie młyna mieszającego.

Zabeziecz załadowaną kasetę w młynku homogenizującym i homogenizuj pule komarów przez cztery minuty przy 25 cyklach na sekundę. Po homogenizacji komarów przenieś probówki do szczelnej wobec aerozoli chłodzonej mikrowirówki i odwiruj. Homogenizat z komarów wiruj przy 7 000 RPM przez sześć minut.

Po wirowaniu probówki można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przeprowadzenia testów wirusowych. Zlać medium hodowlane z kolby T 175 z konfluentnymi komórkami farrow do zlewka z wybielaczem. Do kolby dodać 5 mL PBS i równomiernie wypłukać komórki, a następnie zlać PBS do zlewka z odpadami.

Po wypłukaniu komórek należy dodać 2,5 ml tripsyny z EDTA i inkubować kolbę w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez pięć minut, aby odlepić komórki. Po odlepieniu komórek należy dodać 5 ml MEM i kilkukrotnie pipetować zawiesinę, aby rozbić wszelkie agregaty. Następnie należy dodać kolejne 15 ml MEM.

Umieść 40 kolb T 25 na dwóch statywach wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego i zdejmij nakrętki, kładąc je bezpośrednio przed każdą kolbą. Używając sterylnej pipety, odmierz i dodaj 4 ml MEM do każdej kolby. Następnie dodaj 0,5 ml zawiesiny komórek vari i zakręć kolby. Ustaw kolby na tacy i delikatnie nimi zakręć, aby upewnić się, że pożywka równomiernie pokrywa dno kolb.

Inkubuj kultury w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez noc lub do momentu, gdy komórki osiągną 80 do 90% konfluencji. Wyjmij z inkubatora 20 małych kolbek i opisz je odpowiednim numerem dostępu z każdej puli komarów. Odlej większość pożywki z każdej kolbki do pojemnika na odpady, pozostawiając tylko tyle pożywki, aby pokryć monowarstwę komórek.

Przenieś 100 µl supernatantu z każdego homogenatu komarów do odpowiednio oznakowanej kolby i szczelnie je zamknij. Po przeniesieniu supernatantów umieść kolby na wytrząsarce ustawionej na 35 do 40 RRP M na pięć minut. Przenieś kolby z powrotem do komory bezpiecznej i dodaj do każdej z nich cztery ml pożywki wzrostowej.

Zamknąć kolby i inkubować je w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez trzy do siedmiu dni. Po przygotowaniu kultur do przesiewania, w pierwszej kolejności ocenić wizualnie pożywkę. Mętna pożywka wskazuje na cytopatyczny efekt wywołany przez wirusa, zanieczyszczenie innymi mikroorganizmami lub obie te przyczyny; w takim przypadku należy zbadać kultury wykazujące zmętnienie pożywki pod odwróconym mikroskopem świetlnym.

Wirusy zazwyczaj powodują deformację komórek i ich odrywanie się od kolb hodowlanych. W przypadku wykrycia kontaminacji bakteriami, drożdżami lub grzybami, bądź jeśli hodowla zawiera dużo szczątków komarów, należy ponownie przebadać pierwotną pulę komarów po przefiltrowaniu jej przez strzykawkę z filtrem 0,22 mikrona. Aseptycznie przelać jeden do dwóch mililitrów pożywki z kultur dodatnich pod kątem wirusów, które nie są skontaminowane innymi mikroorganizmami, do oznakowanych probówek kriogenicznych.

Próbki zawierające wirusa należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu identyfikacji, wykorzystując odpowiednie testy diagnostyczne w ramach niniejszego badania. Z komarów zebranych w Connecticut w okresie ciągłego nadzoru w całym stanie od 1997 do 2010 roku wyizolowano dziewięć różnych typów wirusów z czterech rodzin taksonomicznych. Kilka z tych wirusów, w tym wirus wschodniego zapalenia mózgu koni oraz wirus Zachodniego Nilu, jest znanych z wywoływania chorób u ludzi.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak sortować, przetwarzać i badać komary pod kątem infekcji wirusowej za pomocą testu hodowli komórkowej wirusa.