Name: Nanocząstki fluorescencyjne do pomiaru stężenia jonów w układach biologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania nanocząstek fluorescencyjnych do pomiaru stężenia jonów sodu w układach biologicznych. Technika umożliwia precyzyjne badania in vitro i in vivo z możliwością dostrojenia zakresu dynamicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JMD i MKB otrzymali finansowanie z programu IGERT Nanomedicine Science and Technology na Northeastern University (finansowanie z grantu NCI i NSF DGE- 0504331). Praca ta była również finansowana z grantu R01 GM084366 Narodowego Instytutu Nauk Medycznych (National Institutes of Health), Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych (National Institute of General Medical Sciences). Dziękujemy również Saumyi Das i Anthony'emu Rosenzweigowi z BIDMC w Bostonie za dostarczenie kardiomiocytów oraz Kevinowi Cashowi za wkład w opracowanie protokołu badań na zwierzętach.

1. Przygotowanie optody
Przed przygotowaniem optody należy odmierzyć alikwoty składników, aby można było je łatwo zmierzyć i przechowywać.
<ol>
	<li>Fiolkę zawierającą 50 mg jonoforu sodowego X (NaIX) oraz fiolkę zawierającą 50 mg boranu sodu tetrakis[3,5-bis(trifluorometylo)fenylo] (NaTFPB) rozpuszcza się odpowiednio w tetrahydrofuranie (THF) i rozdziela na aliquoty do 1,5 ml polistyrenowych probówek do wirowania. W dygestorium rozpuścić 50 mg NaIX w 1 ml THF w fiolce transportowej i wymieszać, aby upewnić się, że substancja stała całkowicie się rozpuściła. Przenieść 100 μl tego roztworu do 10 oddzielnych probówek do wirowania. Powtórzyć procedurę dla NaTFPB. Pozostawić THF do odparowania w dygestorium przez noc, opisać probówki i umieścić je w lodówce w temperaturze 4°C do przechowywania. W ten sposób otrzymuje się aliquoty 5 mg suchego NaIX i NaTFPB.</li>
	<li>Chromoionofor III (CHIII) rozpuścić w 1 ml THF i przenieść do 3 ml szklanej fiolki. Do fiolki transportowej po CHIII dodać kolejny 1 ml THF, aby rozpuścić pozostałości CHIII, a następnie dodać to do 3 ml szklanej fiolki. Łączna objętość wyniesie teraz 2 ml. Przenieść 1 ml roztworu CHIII w THF do dwóch oddzielnych 1,5 ml szklanych fiolek z zakrętkami teflonowymi. Roztwór CHIII przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C przy końcowym stężeniu 5 mg/ml.</li>
</ol>
	Te alikwoty i roztwory zostaną wykorzystane do przygotowania materiału optody.
	<ol start="3">
	<li>Pipetuj 66 μl sebacynianu bis(2-etylheksylu) (DOS) do szklanej fiolki o pojemności 1,5 ml z zakrętką z powłoką teflonową – jest to fiolka optody. DOS jest roztworem lepkim, dlatego należy zachować ostrożność, aby zapewnić przeniesienie odpowiedniej ilości roztworu do fiolki. Objętość ta odpowiada ˜ 60 mg DOS. </li>
	<li> Odważ 30 mg wysokocząsteczkowego poli(chlorku winylu) (PVC) i przenieś go do fiolki optody.</li>
	<li>Następnie dodaj odmierzone komponenty funkcjonalne do fiolki optody, aby stworzyć pożądaną optodę. Względne stężenia CHIII, NaIX i NaTFPB będą determinować odpowiedź sensora na sód. Stężenia te można dostosować tak, aby sensor reagował optymalnie na stężenia wewnątrzkomórkowe, przy Kd wynoszącym 10 mM, lub na stężenia zewnątrzkomórkowe, przy Kd wynoszącym 150 mM. Ponadto prawdopodobna jest zmienność partii odczynników od dostawcy, dlatego kalibracja sensorów jest niezbędna, aby sprawdzić, czy dla każdej nowej partii komponentów chemicznych występuje prawidłowa odpowiedź. Tutaj opisujemy metodę tworzenia sensora ze stężeniami typowo stosowanymi do pomiarów sodu wewnątrzkomórkowego. </li>
	<li>W dygestorium chemicznym przenieś 100 μl roztworu CHIII w THF o stężeniu 5 mg/ml do fiolki optody. </li>
	<li> Rozpuść 5 mg NaIX w 300 μl THF i przenieś 300 μl do fiolki optody; odpowiada to 5 mg NaIX. </li>
	<li>Rozpuść odmierzoną porcję 5 mg NaTFPB w 500 μl THF i przenieś 20 μl roztworu do fiolki optody; odpowiada to 0,1 mg NaTFPB. </li>
	<li>Dodaj 80 μl THF do fiolki optody.</li>
	<li>Roztwór w fiolce optody zawiera 30 mg PVC, 60 mg DOS, 5 mg NaIX, 0,2 mg NaTFPB oraz 0,5 mg CHIII w 500 μl THF. Delikatnie mieszaj fiolkę na wortexie, aż cały PVC się rozpuści. Optoda powinna mieć czerwony kolor. Całkowita ilość THF dodana do fiolki powinna wynosić 500 μL, niezależnie od zastosowanego stosunku komponentów. </li>
	<li>Pozostaw pozostały THF w porcjach NaIX i NaTFPB do odparowania przez noc i ponownie opisz probówki, podając prawidłową ilość substancji chemicznej.</li>
</ol>
2. Tworzenie nanoczujników
<ol>
	<li>Do szklanej fiolki o pojemności 4 dramów pipetujemy 100 μl 10 mg/ml 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N -[Methoxy(Polyethyleneglycol)-550] w chloroformie (PEG-lipid). Pozostawiamy chloroform do odparowania w dygestorium. Proces ten można przyspieszyć, osuszając roztwór strumieniem azotu lub sprężonym powietrzem. </li>
	<li>Do fiolki z PEG-lipid dodajemy 4 ml wybranego roztworu wodnego. Fiolkę umieszczamy na podnośniku laboratoryjnym pod końcówką sonikatora i podnosimy ją tak, aby końcówka była zanurzona w roztworze na głębokość około 7 mm, a następnie sonikujemy przy niskiej mocy przez 30 sekund. W tym przypadku używamy cyfrowego sonikatora Branson ustawionego na 15% amplitudy z końcówką typu step horn o średnicy ½ cala. Roztwór wodny może być dowolny. Na przykład, aby określić odpowiedź sensorów, stosujemy 10 mM HEPES pH 7.2 z zasadą trizma. </li>
	<li>Podczas sonikowania roztworu mieszamy 50 μl materiału optody z 50 μl dichlorometanu w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0.6 ml. Mieszamy za pomocą pipety, aby zapewnić jednorodność mieszaniny.</li>
	<li>Ustawiamy sterownik sonikatora na 3 minuty. Uruchamiamy sonikację i w jej trakcie dodajemy roztwór mieszaniny optody do fiolki, zanurzając końcówkę pipety w roztworze i podając 100 μl roztworu jednym szybkim, równomiernym wtryskiem. Roztwór powinien zmienić kolor na niebieski, w zależności od zastosowanego roztworu wodnego. </li>
	<li>Kontynuujemy sonikację przez około 30 sekund, a następnie opuszczamy podnośnik tak, aby końcówka sonikatora była zanurzona w roztworze na głębokość około 2 mm. Powinno to doprowadzić do napowietrzenia roztworu, który stanie się mętny. Krok ten pomaga usunąć z roztworu resztki THF i dichlorometanu. </li>
	<li>Po zakończeniu sonikacji pobieramy roztwór nanosensorów do strzykawki 5 ml. Mocujemy filtr strzykawkowy 0.2 μm i przelewamy roztwór nanosensorów do szklanej fiolki z zakrętką. Roztwór powinien być klarowny i niebieski, jeśli zastosowano roztwór wodny zawierający mniej niż 10 mM sodu o pH poniżej około 9. W przeciwnym razie roztwór powinien być bezbarwny lub różowy.</li>
</ol>
3. Wyznaczanie odpowiedzi nanoczujnika
Metoda ta jest stosowana do określenia odpowiedzi nanoczujników zaprojektowanych do pomiaru wewnątrzkomórkowego sodu. W przypadku nanoczujników stężenia sodu zewnątrzkomórkowego zaleca się stosowanie innych stężeń.
<ol>
	<li>Przygotować roztwory stokowe 10 mM HEPES (0 Na) oraz 1 M chlorku sodu (NaCl) w 10 mM HEPES (1 M Na), a następnie dostosować pH każdego z tych roztworów do wartości 7,2 za pomocą bazy trizmy. W stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml zmieszać roztwory stokowe 0 Na i 1 M Na, aby przygotować roztwory o stężeniach NaCl wynoszących: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 mM.</li>
	<li>Do oznaczenia odpowiedzi użyć płytki 96-dołkowej z optycznym dnem. Do trzech dołków w jednej kolumnie dodać po 100 μl roztworu sodu o danym stężeniu. W ten sposób powstanie układ 3 x 10 dołków.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 100 μl świeżo przygotowanych nanoczujników, a następnie włożyć płytkę do fluorometru do mikropłytek. W badaniu wykorzystano urządzenie Molecular Devices Spectramax M3.</li>
	<li>Odczytać wartości dla każdego dołka przy następujących długościach fal:</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wzbudzenie (nm)</td>
			<td>Emisja (nm)</td>
			<td>Próg odcięcia (nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488</td>
			<td>570</td>
			<td>530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488</td>
			<td>670</td>
			<td>610</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>639</td>
			<td>680</td>
			<td>665</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
 Intensywność nanoczujnika przy każdej długości fali zależy od stężenia sodu. Wybór długości fali zależy od zastosowań. Do pomiarów powolnej dynamiki wewnątrzkomórkowej stosujemy 488 nm/570 nm (wzbudzenie/emisja) oraz 488 nm/670 nm, co pozwala nam na obliczenie stosunku dwóch długości fal i zredukowanie szumu. 
<ol start="5">
<li>Tradycyjnie dane z optody przelicza się na wartości α według wzoru: α = (I - Imin)/(Imax - Imin), gdzie I jest natężeniem przy danym stężeniu sodu, Imin to najniższe natężenie w pomiarach odpowiedzi, a Imax to najwyższe natężenie w pomiarach odpowiedzi. Przelicz na α albo stosunek natężenia przy 570 nm do natężenia przy 670 nm, albo natężenie przy 680 nm. </li>
<li>Użyj oprogramowania do wykresów (w naszym laboratorium zazwyczaj stosuje się Excel lub Origin), aby narysować zależność α od logarytmu stężenia sodu, przyjmując logarytm zerowego stężenia sodu jako -1. Dopasuj do odpowiedzi krzywą sigmoidalną. Na podstawie krzywej oblicz stężenie sodu dla α = 0,5, co reprezentuje stężenie, przy którym sensor wykazuje optymalną odpowiedź. </li>
<li>Dostosuj stosunek CHIII, NaIX i NaTFPB w optodzie, aby stworzyć nanoczujniki o optymalnej odpowiedzi w pobliżu interesującego stężenia sodu. </li>
</ol>
4. Obrazowanie wewnątrzkomórkowe
<ol>
	<li>Do pomiarów wewnątrzkomórkowych nanosensory przygotowuje się w roztworze glukozy o stężeniu 5 mg/ml w wodzie, a następnie wstrzykuje się je do komórek za pomocą mikroiniekcji. </li>
	<li>Komórki należy hodować lub przenieść do szalki z szklanym dnem lub do komory obrazującej z szklanym dnem z lamellki. </li>
	<li>Komórki inkubuje się w przezroczystym medium lub roztworze Tyrode'a. Komorę obrazującą lub szalkę montuje się na mikroskopie epifluorescencyjnym. W tej procedurze wykorzystano konfokalny mikroskop Zeiss LSM 7. </li>
	<li>Kapilary szklane wyciąga się za pomocą wyciągacza do pipet. Użyto urządzenia sutter flaming brown p-97 z rurki szklanej o średnicy zewnętrznej 1 mm i wewnętrznej 0.78 mm, aby uzyskać końcową średnicę końcówki około 300-500 nm. </li>
	<li>Pipetę napełnia się od tyłu roztworem nanosensorów, używając strzykawki i igły Hamiltona lub ładowarki do mikrokońcówek i pipety.</li>
	<li>Pipetę montuje się w uchwycie przymocowanym do mikromanipulatora i podłączonym do systemu iniekcji sterowanego ciśnieniowo. W tym przypadku zastosowano mikromanipulator Burleigh EXFO PCS 6000 oraz injektor firmy medical systems corporation.</li>
	<li>Pipetę opuszcza się na komórkę i wprowadza do cytoplazmy; czasami konieczne jest lekkie „stuknięcie” uchwytu manipulatora, aby przebić błonę. Następnie wstrzykuje się roztwór nanosensorów i szybko wycofuje pipetę. </li>
</ol>
5. Obrazowanie in vivo
Wszystkie procedury zostały przejrzane i zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Northeastern University.
<ol>
	<li>Nanosensory do obrazowania in vivo w przestrzeni zewnątrzkomórkowej przygotowuje się w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i dostraja tak, aby uzyskać optymalną odpowiedź na sód przy jego stężeniu 135 mM.</li>
	<li>Do przygotowania do iniekcji oraz obrazowania fluorescencyjnych nanosensorów u myszy używamy systemu IVIS Lumina II wraz z dołączoną jednostką anestezji. Dezynfekujemy komory indukcyjne i obrazujące. Myszy CD1 nude (o masie około 20g) umieszczamy w komorze indukcyjnej i poddajemy działaniu izofluranu. Procent stężenia izofluranu oraz przepływ tlenu będą zależeć od gatunku i masy myszy. Oczekujemy, aż myszy zostaną w pełni znieczulone.</li>
	<li>Po znieczuleniu myszy wyjmujemy je z komory indukcyjnej i przenosimy do komory obrazującej. Utrzymujemy myszy w stanie anestezji. W przypadku każdej myszy dezynfekujemy wybrane miejsca iniekcji.</li>
	<li>Jałową strzykawkę insulinową 31G napełniamy 10 μL nanosensorów, upewniając się, że usunięto wszystkie pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Za pomocą pęsety chwytamy niewielki fałd skóry wzdłuż grzbietu myszy w wybranym miejscu iniekcji. Trzymając skórę, wprowadzamy strzykawkę w skórę ściętym końcem igły skierowanym do góry, prowadząc igłę równolegle do powierzchni skóry.</li>
	<li>Przed wstrzyknięciem sensorów odciągamy tłok strzykawki, aby upewnić się, że igła nie została wprowadzona do naczynia krwionośnego. Następnie delikatnie przesuwamy igłę w prawo i w lewo, aby stworzyć w skórze niewielką przestrzeń. Pozwoli to zminimalizować ciśnienie wsteczne, które powoduje wyciek sensorów z miejsca iniekcji. Wstrzykujemy sensory i delikatnie wyjmujemy strzykawkę.</li>
	<li>Delikatnie uciskamy miejsce iniekcji i wycieramy wszelki roztwór, który mógł wycieknąć. Pozwoli to zminimalizować fluorescencję z sensorów, które nie zostały wstrzyknięte do skóry.</li>
	<li>Powtarzamy kroki od 5.4 do 5.7, aż do osiągnięcia pożądanej liczby miejsc iniekcji. Zaleca się wykonanie sześciu iniekcji w równych odstępach po lewej i prawej stronie grzbietu. W przypadku każdej myszy wymieniamy igłę, jeśli stanie się ona trudna do wprowadzenia w skórę. Igieł nie należy używać wielokrotnie u różnych osobników. Pozwoli to zminimalizować ryzyko przenoszenia chorób lub zanieczyszczenia krzyżowego między myszami.</li>
	<li>W celu obrazowania fluorescencyjnych sensorów sodu pozyskujemy obrazy myszy w świetle przechodzącym oraz fluorescencyjnym, korzystając z zestawów filtrów najlepiej dopasowanych do widma 640 nm/680 nm (pobudzenie/emisja) nanosensorów, które jednocześnie minimalizują autofluorescencję skóry.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig1.jpg" alt="Wykres wiązania równowagowego, stężenie NaCl, krzywa wiązania ligandu, wykres analizy chemicznej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Krzywe odpowiedzi pięciu różnych zestawów nanoczujników na sod. Każdy zestaw reprezentuje nanoczujniki o różnych formulacjach optod, które zawierały taką samą ilość CHIII, NaTFPB, PVC i DOS, ale różną ilość NaIX. Dane przekształcono w wartości α, wykorzystując intensywności przy 639/680 nm. Dane stanowią średnią z 3 pomiarów, słupki błędów pominięto dla przejrzystości; zastosowano dopasowanie krzywej sygmoidalnej w programie Origin. W tej krzywej odpowiedzi maksymalne zastosowane stężenie sodu wynosiło 500 mM. Wartości Kd nanoczujników sodu dla sodu wynosiły od 10 mM (pomarańczowe romby) do około 150 mM (czarne kwadraty).
<img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig2.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna komórki wykazująca lokalizację czerwonego białka, obraz mikroskopowy, badanie komórkowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Wstrzyknięte kardiomiocyty noworodkowe. Komórki hodowano na szkiełkach podstawkowych, zamocowano w mikroskopie i wstrzyknięto do nich sodowe nanoczujniki. Przedstawiono obraz fluorescencyjny (pobudzenie 639 nm), w świetle przechodzącym oraz nałożenie obu obrazów (overlay). Należy zauważyć, że występuje pewna agregacja czujników, jednak komórki zachowują prawidłową morfologię, czujniki rozprzestrzeniły się w całym cytosolu i nie stwierdzono ich akumulacji w jądrze komórkowym. 
<img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig3.jpg" alt="Obrazowanie in vivo, wykres intensywności fluorescencji, małe zwierzę, rozkład markerów molekularnych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Podskórne wstrzyknięcia nanosensorów sodu u myszy. Wykonano dziewięć różnych wstrzyknięć nanosensorów sodu do przestrzeni podskórnej myszy nude. Nałożono na siebie obrazy w polu jasnym oraz obrazy fluorescencyjne (640/680).

<ol><li>Adrogue, H. J., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyponatremia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Hyponatremia.</a> N Engl J Med. 342, 1581-1589 (2000).</li>
<li>Kim, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BACE1+regulates+voltage-gated+sodium+channels+and+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">BACE1 regulates voltage-gated sodium channels and neuronal activity.</a> Nat Cell Biol. 9, 755-764 (2007).</li>
<li>Dubach, J. M., Lim, E., Zhang, N., Francis, K. P., Clark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+sodium+concentration+continuously+monitored+with+fluorescent+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">in vivo sodium concentration continuously monitored with fluorescent sensors.</a> Integr Biol (Camb). , (2010).</li>
<li>Minta, A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J Biol Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li>
<li>Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+nano-optodes+incorporating+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Ion-selective nano-optodes incorporating quantum dots.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 8418-8418 (2007).</li>
<li>Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+ion-selective+nanosensors+for+intracellular+analysis+with+improved+lifetime+and+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Fluorescent ion-selective nanosensors for intracellular analysis with improved lifetime and size.</a> Nano Letters. 7, 1827-1831 (1021).</li>
<li>Schaffar, B., Wolfbeis, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sodium-selective+optrode%5BTitle%5D)+AND+%22Mikrochim+Acta+III%22%5BJournal%5D)">A sodium-selective optrode.</a> Mikrochim Acta III. III, 109-109 (1989).</li>
<li>Seiler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+sodium-selective+optode+membranes+based+on+neutral+ionophores+and+assay+of+sodium+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of sodium-selective optode membranes based on neutral ionophores and assay of sodium in plasma.</a> Clin Chem. 37, 1350-1355 (1991).</li>
<li>Zhujun, Z., Mullin, J., Seitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensor+for+sodium+based+on+ion-pair+extraction+and+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Optical sensor for sodium based on ion-pair extraction and fluorescence.</a> Anal Chim Acta. 184, 251-251 (1986).</li>
<li>Bakker, E., Buhlmann, P., Pretsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carrier-Based+Ion-Selective+Electrodes+and+Bulk+Optodes.+1.+General+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Carrier-Based Ion-Selective Electrodes and Bulk Optodes. 1. General Characteristics.</a> Chem Rev. 97, 3083-3132 (1997).</li>
<li>Dubach, J. M., Das, S., Rosenzweig, A., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+sodium+dynamics+in+isolated+cardiomyocytes+using+fluorescent+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Visualizing sodium dynamics in isolated cardiomyocytes using fluorescent nanosensors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16145-16150 (2009).</li>
<li>Harjes, D. I., Dubach, J. M., Rosenzweig, A., Das, S., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-Selective+Optodes+Measure+Extracellular+Potassium+Flux+in+Excitable+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Ion-Selective Optodes Measure Extracellular Potassium Flux in Excitable Cells.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31, 217-221 (2010).</li>
<li>Balaconis, M. K., Billingsley, K. L., Dubach, J. M., Clark, H. A. Pittsburgh Conference on Analytical Chemistry and Applied, , Forthcoming.</li>
<li>Park, E. J., Brasuel, M., Behrend, C., Philbert, M. A., Kopelman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+optical+PEBBLE+nanosensors+for+real-time+magnesium+ion+concentrations+inside+viable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ratiometric optical PEBBLE nanosensors for real-time magnesium ion concentrations inside viable cells.</a> Anal Chem. 75, 3784-3791 (2003).</li>
<li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+Near-Infrared+Fluorescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">in vivo Near-Infrared Fluorescence Imaging.</a> Curr Op Chem Biol. 7, 626-634 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Formowanie nanoczujników nie powinno zająć więcej niż 10 minut po przygotowaniu roztworu optody i wysuszeniu lipidu PEG. Optody można nie tylko szybko przygotować w razie potrzeby, ale przechowywane w temperaturze 4 °C mogą one zachować stabilność przez wiele miesięcy. Wykazaliśmy, że nanoczujniki po utworzeniu są stabilne w roztworze przez co najmniej tydzień; należy jednak zachować ostrożność, aby zapobiec fotowybielaniu w tym czasie, chroniąc nanoczujniki przed światłem.6 Choć w niniejszej pracy zaprezentowano nanoczujniki sodowe, optody stworzono dla większości biologicznie istotnych jonów, takich jak potas i chlorek.10,12 Rozszerzyliśmy również tę technologię na małe cząsteczki, takie jak glukoza.13
Oprócz generowania nanoczujników do monitorowania różnych analitów, nanoczujniki te można modyfikować w inny sposób, co uczyni je użytecznymi w większości eksperymentów biologicznych. Na przykład powłokę powierzchniową, w tym przypadku poli(glikol etylenowy), można łatwo zmienić, stosując dowolną amfifilną cząsteczkę rozpuszczalną w wodzie. Umożliwia to funkcjonalizację tych nanocząstek dla różnych zastosowań lub celów. Rozmiar nanocząstek można również regulować poprzez zmianę powłoki powierzchniowej, intensywności sonikacji lub zastosowanego rozpuszczalnika.
Fluorescencyjne wskaźniki wapnia okazały się nieocenione w określaniu wewnątrzkomórkowego przesyłania sygnałów wapniowych; jednakże żadne dostępne barwniki czułe na sód nie posiadają tak idealnych właściwości. Od lat opracowywane są nanocząsteczki optodowe, które mają zapewnić alternatywną metodę obrazowania jonów wewnątrzkomórkowych.14 Opierając się na tych wcześniejszych badaniach, stworzyliśmy nanoczujniki specyficzne dla wewnątrzkomórkowego obrazowania sodu, które – jak miejmy nadzieję – pozwolą zrozumieć, w jaki sposób sygnalizacja sodowa wpływa na funkcje komórkowe oraz jakie zmiany w sygnalizacji prowadzą do określonych chorób.
Zastosowanie fluorescencyjnych nanoczujników in vivo stanowi małoinwazyjną alternatywę czasu rzeczywistego dla monitorowania analitów w porównaniu z innymi metodami, takimi jak pobieranie krwi.3 Wykazano, że nanoczujniki sodu i glukozy oparte na powyższej technologii pozwalają na śledzenie zmian odpowiednio poziomu sodu i glukozy in vivo.3,13 Obecnie istnieją jednak ograniczenia tej metody jako narzędzia monitorującego. Na przykład czujniki muszą zawierać fluorofor o widmie wystarczająco przesuniętym w stronę bliskiej podczerwieni, aby zminimalizować tło autofluorescencji skóry.15 Po drugie, obecna technika wstrzykiwania nie zapewnia jednorodnego wprowadzenia nanoczujników, co może wynikać z błędów takich jak zmienność głębokości iniekcji. Mimo tych ograniczeń, opracowanie tych fluorescencyjnych nanoczujników i ich pomyślna demonstracja mogą uczynić z tych sensorów nieocenione narzędzie badawcze oraz metodę monitorowania stanu zdrowia pacjentów.

<table><tbody><tr><td>Zestaw aparatury IVIS Lumina II</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>126273</td><td></td></tr><tr><td>Myszy nago CD-1</td><td>Charles River Laboratories</td><td>Kod szczepu: 086</td><td>Z niedoborem odporności</td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe</td><td>BD Biosciences</td><td>328438</td><td>3/10 &lt;sub&gt;cc&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;ml&lt;/sup&gt; , 8 mm, 31G</td></tr><tr><td>PVC o wysokiej masie cząsteczkowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaTFPB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaIX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenna kapilara szklana</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lipid PEG</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Zawiera listę odczynników i sprzętu użytych w tej procedurze. Wszystkie pozostałe powszechnie stosowane odczynniki zostały zakupione w firmie Sigma.</td></tr></tbody></table>

nanocząstki fluorescencyjne do pomiaru stężenia jonów w systemach biologicznych

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Ścisła regulacja homeostazy jonowej w całym organizmie jest niezbędna do zapobiegania takim wyniszczającym stanom jak odwodnienie.1 Z drugiej strony, szybkie przepływy jonów na poziomie komórkowym są wymagane do inicjacji potencjałów czynnościowych w komórkach pobudliwych.2 Regulacja sodu odgrywa ważną rolę w obu tych przypadkach; jednak obecnie nie istnieje metoda ciągłego monitorowania poziomu sodu in vivo 3, a wewnątrzkomórkowe sondy sodowe 4 nie dostarczają tak szczegółowych wyników jak sondy wapniowe. W celu wypełnienia obu tych luk opracowano fluorescencyjne nanoczujniki, które mogą monitorować stężenia sodu in vitro oraz in vivo.5,6 Czujniki te opierają się na technologii optodów selektywnych wobec jonów i składają się z plastyfikowanych cząsteczek polimerowych, w których osadzone są elementy specyficzne dla rozpoznawania sodu, fluorofory wrażliwe na pH oraz dodatki.7-9 Mechanicznie, element rozpoznający sód ekstrahuje sód do czujnika. 10 Ekstrakcja ta powoduje, że fluorofor wrażliwy na pH uwalnia jon wodoru w celu zachowania neutralności ładunku wewnątrz czujnika, co wywołuje zmianę fluorescencji. Czujniki sodowe są odwracalne i selektywne względem sodu w stosunku do potasu, nawet przy wysokich stężeniach wewnątrzkomórkowych.6 Mają one średnicę około 120 nm i są powlekane glikolem polietylenowym w celu zapewnienia biokompatybilności. Wykorzystując techniki mikroiniekcji, czujniki mogą być wprowadzane do cytoplazmy komórek, gdzie wykazano ich zdolność do monitorowania czasowej i przestrzennej dynamiki sodu w bijących miocytach serca.11 Dodatkowo śledzono one zmiany stężeń sodu w czasie rzeczywistym in vivo po podaniu podskórnym u myszy.3 W niniejszej pracy szczegółowo wyjaśniamy i demonstrowamy metodologię wytwarzania fluorescencyjnych nanoczujników sodu oraz krótko prezentujemy zastosowania biologiczne, do których nasze laboratorium wykorzystuje te nanoczujniki: mikroiniekcję czujników do komórek oraz podskórną iniekcję czujników u myszy.

Fluorescencyjne nanocząsteczki wytwarzane w naszym laboratorium są wykorzystywane do obrazowania stężeń jonów i strumieni jonowych w systemach biologicznych, takich jak komórki podczas sygnalizacji oraz płyn śródmiąższowy podczas homeostazy fizjologicznej.

Nanocząstki fluorescencyjne do pomiaru stężenia jonów w systemach biologicznych

Ściśle regulowana homeostaza jonowa w całym organizmie jest niezbędna do zapobiegania takim wyniszczającym stanom, jak odwodnienie.1 W przeciwieństwie do tego, szybkie jonowe...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wytworzenie nanoczujników sodu do zastosowań in vitro i in vivo. Osiąga się to poprzez przygotowanie mieszaniny optycznej zawierającej komponenty czujników dla nanoczujników. W drugim kroku surfaktant poddawany jest sonikacji w roztworze wodnym w celu jego równomiernego rozprowadzenia, co umożliwi formowanie nanoczujników po dodaniu mieszaniny optycznej.Następnie, w warunkach sonikacji, do wodnej mieszaniny surfaktantów dodaje się mieszaninę optyczną w celu utworzenia nanoczujników w roztworze. Niniejszy film demonstruje, że odpowiedź czujnika jest regulowana. Czujniki mogą być wstrzykiwane mikroiniekcyjnie do kardiomiocytów, a także wstrzykiwane podskórnie u myszy.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak fluorescencyjne barwniki wskaźnikowe, jest możliwość dostrojenia czujników do zakresu dynamicznego odpowiadającego środowisku fizjologicznemu, pomiaru szerszego zakresu analitów oraz przeprowadzania pomiarów ratiometrycznych w celu analizy ilościowej. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotykać trudności, ponieważ po wytworzeniu czujników ich wprowadzenie do środowiska biologicznego może wydawać się onieśmielające. Przed przygotowaniem optod zgodnie z protokołem należy wcześniej przygotować roztwory zapasowe suchego jonu sodu four x, suchego sodu TFPB oraz chromo four three.W dygestorium należy połączyć wszystkie materiały w szklanej fiolce o pojemności 1,5 ml. Zamykając fiolkę nakrętką z powłoką teflonową, należy ją delikatnie wymieszać w wstrząsarce wirowej (vortex), aż cały PVC zostanie rozpuszczony. Roztwór powinien mieć czerwony kolor.Rozpocznij przygotowywanie nanoczujników, dodając 100 µL roztworu lipidów PEG o stężeniu 10 mg/mL do szklanej fiolki o pojemności 4 g. Następnie dodaj 4 mL odpowiedniego roztworu wodnego, na przykład 10 mM HEPES.Zanurz końcówkę sonikatora na siedem milimetrów w fiolce, korzystając z podnośnika laboratoryjnego, i zastosuj niską moc sonikacji przez 30 sekund. W probówce o pojemności 0,6 ml połącz 50 µl materiału optycznego i 50 µl dichlorometanu, używając pipety, aby zapewnić równomierne wymieszanie. Następnie rozpocznij trzy minutową sonikację.Po rozpoczęciu sonikacji należy dodać 100 µL mieszaniny opto, zanurzając końcówkę pipety i dozując całą objętość jednym szybkim, równomiernym wtryskiem. Roztwór zmieni kolor na niebieski, jeśli pH wzrośnie powyżej siedmiem i jeśli w roztworze nie ma sodu, który usunąłby pozostałości THF i dichlorometanu. Przesuń końcówkę sonikacyjną na głębokość 2 mm.W ciągu pozostałych trzech minut roztwór stanie się mętny. Po zakończeniu sonikacji naciągnij roztwór nanoczujnika do strzykawki o pojemności 5 ml. Podłącz filtr i przelej roztwór nanoczujnika do szklanej fiolki z nakrętką.Należy rozpocząć od przygotowania 10 roztworów o progresywnie zwiększającym się stężeniu sodu, względem których będzie można zmierzyć czułość nanoczujnika. Połączyć roztwory zasobowe sodu o stężeniu zero moli i jednego mola w stożkowych probówkach o pojemności 50 mililitrów. Następnie w płycie 96-dołkowej z dnem optycznym dodać 100 mikrolitrów każdego stężenia sodu do trzech dołków w jednej kolumnie.Następnie należy dodać 100 µL świeżo przygotowanych nanoczujników do każdej studni, umieścić płytkę w fluorymetrze do mikropłytek i wprowadzić długości fal wzbudzenia, emisji oraz odcięcia, które są optymalne dla stosowanego chromoforu. Wybór mierzonych długości fal zależy od zastosowania. Długości fal te umożliwiają pomiary szybkiej dynamiki wewnątrzkomórkowej lub redukcję szumów.Aby uzyskać wartości alfa, należy podzielić natężenie przy 570 nanometrach przez natężenie przy 670 nanometrach lub 680 nanometrach. Następnie należy nanieść wartości alfa na wykres w funkcji logarytmu stężenia sodu, przyjmując wartość minus jeden dla logarytmu zerowego stężenia sodu.Następnie dopasuj krzywą sigmoidalną do odpowiedzi i na podstawie tej krzywej oblicz stężenie sodu, przy którym wartość alfa wynosi 0,5. Reprezentuje ono stężenie sodu, przy którym czujnik reaguje optymalnie. Wykorzystując tę informację, dostosuj stosunek sodium iono four x sodium TFPB oraz chromo iono four three w opto, aby stworzyć nanoczujniki o optymalnym stężeniu sodu.Na przykład, krzywe odpowiedzi hero pięciu różnych zestawów nanoczujników reprezentujących różne formulacje optyczne, różniących się jedynie ilością sodu z czterech 10. Do obrazowania wewnątrzkomórkowego należy zastąpić pożywkę komórkową przejrzystą pożywką, taką jak roztwór Tyro, a następnie przenieść komórki do komory obrazowania. Teraz należy napełnić wyciągniętą pipetę szklaną roztworem nanoczujników przygotowanym w 5 mg/mL glukozy w wodzie.Następnie zamocuj pipetę do mikromanipulatora i podłącz ją do systemu wtryskiwania sterowanego ciśnieniem. Obniż pipetę nad komórką i wprowadź ją do cytoplazmy. Czasami konieczne jest stuknięcie w uchwyt manipulatora, aby przebić błonę.Wstrzyknij kilkaset pikolitrów roztworu nanoczujnika i szybko wycofaj pipetę. Znieczul mysz naga CD-1 przy użyciu izofluoranu w komorze do znieczulania. Po znieczuleniu umieść mysz w zdezynfekowanej komorze obrazującej.Następnie należy napełnić sterylną strzykawkę insulinową o rozmiarze 31G 10 µL nanoczujników o odpowiedniej wartości KD w 10 mM PBS. Należy upewnić się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte za pomocą pęsety. Chwyćcie niewielki fałd skóry na grzbiecie myszy w wybranym miejscu wstrzyknięcia, trzymając skórę.Wprowadź strzykawkę w skórę ściętym końcem igły skierowanym do góry i igłą równolegle do powierzchni skóry. Następnie odciągnij tłok strzykawki, aby upewnić się, że igła nie została wprowadzona do naczynia krwionośnego. Aby zminimalizować ciśnienie wsteczne, delikatnie przesuń igłę w prawo i w lewo, tworząc w skórze niewielką przestrzeń.Następnie wstrzyknij sensory i ostrożnie wyjmij strzykawkę. Delikatnie uciśnij miejsce wstrzyknięcia i przemyj wszelki roztwór, który mógł wycieknąć z miejsca iniekcji. Zazwyczaj wykonuje się sześć równomiernie rozmieszczonych wstrzyknięć wzdłuż grzbietu.W przypadku wykonywania procedury na różnych myszach, należy wymienić igłę, aby zminimalizować ryzyko przeniesienia choroby oraz kontaminacji krzyżowej. Po iniekcjach należy wykonać obrazy w świetle przechodzącym oraz fluorescencyjne, korzystając z zestawów filtrów ściśle dopasowanych do widma wzbudzenia i emisji nanoczujników. Pozwala to również zminimalizować autofluorescencję skóry.Te neonatalne kardiomiocyty hodowano na szkiełku podstawowym i wstrzyknięto w nie nanoczujniki sodu. Ten obraz fluorescencyjny został wykonany przy długości fali wzbudzenia 639 nanometrów. Jest to obraz w świetle przechodzącym tych samych komórek, a tutaj znajduje się nałożenie obu obrazów.Występuje pewna agregacja sensorów, jednak komórki zachowują prawidłową morfologię. Sensory rozprzestrzeniły się w całym cytosolu i nie obserwuje się ich gromadzenia w jądrach komórkowych. Ta nałożona na siebie obraz z jasnego pola oraz obraz fluorescencyjny przedstawia dziewięć różnych podskórnych wstrzyknięć nanosensorów sodu do przestrzeni podskórnej gołego myszy.Wytwarzanie nanoczujników Masten może zająć zaledwie kilka minut, jeśli zostanie przeprowadzone prawidłowo, i może zostać zastosowane w dowolnych badaniach do pomiaru odwracalnego przepływu anality w czasie rzeczywistym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat wprowadzania nanoczujników do przestrzeni wewnątrzkomórkowej lub podskórnej w celu wykonania pomiarów ilościowych w środowisku biologicznym.

fluorescent-nanoparticles-for-measurement-ion-concentration

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Fluorescencyjne Nanocząstki do Pomiaru Stężenia Jonów w Systemach Biologicznych

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Poniższe podejście do konfiguracji szczegółowo opisuje pułapkowanie optyczne nanocząstek dielektrycznych o niskiej mocy z wykorzystaniem podwójnego nanootworu w cienkiej warstwie metalu.

Optyczne pułapkowanie nanocząsteczek

Ten film demonstruje technikę wykrywania zanieczyszczeń bakteryjnych w próbkach żywności i wody za pomocą nanosensorów. Docelowe bakterie chorobotwórcze są wykrywane poprzez połączenie modalności relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Wykrywanie skażenia bakteryjnego za pomocą nanoczujników magnetofluorescencyjnych

Analiza interakcji nanocząsteczek z określonymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Wykrywanie oddziaływań nanocząstek fluorescencyjnych z pierwotnymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej

Pojedyncze fluorofory mogą być lokalizowane z nanometrową precyzją za pomocą FIONA. W tym miejscu przedstawiono podsumowanie techniki FIONA oraz opisano sposób przeprowadzania eksperymentów FIONA.

Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (FIONA)

Użycie fluoroforów do obrazowania in vivo może być znacznie ograniczone przez opsonizację, szybki klirens, niską czułość wykrywania i cytotoksyczne działanie na gospodarza. Enkapsulacja fluoroforów w liposomach poprzez hydratację i ekstruzję filmu prowadzi do wygaszania i ochrony fluorescencji, co umożliwia obrazowanie in vivo o wysokiej czułości wykrywania.

Wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo

Ten manuskrypt opisuje nowatorską technikę, która pozwala na wykrywanie wewnątrzkomórkowej ekspresji genów po endocytozie nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie bezpośrednio w żywych komórkach. Metoda nie wymaga manipulacji komórkami i nie jest ograniczona w odniesieniu do docelowego genu lub gatunku.

Wykrywanie wewnątrzkomórkowej ekspresji genów w żywych komórkach pochodzenia mysiego, ludzkiego i świńskiego za pomocą nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Tutaj opisujemy protokół przygotowania nanokulek kropek kwantowych (QDNB) i wykrywania biomarkerów choroby za pomocą pasków do testów immunologicznych opartych na przepływie bocznym opartych na QDNB. Wyniki testu można ocenić jakościowo przy oświetleniu światłem UV i zmierzyć ilościowo za pomocą fluorescencyjnego czytnika pasków w ciągu 15 minut.

Fluorescencyjny test immunologiczny przepływu bocznego oparty na nanokulkach kropek kwantowych

Poznaj metodę wytwarzania nanocząstek fluorescencyjnych do pomiaru stężenia jonów sodu w układach biologicznych. Technika umożliwia precyzyjne badania in vitro i in vivo z możliwością dostrojenia zakresu dynamicznego.

Nanocząstki fluorescencyjne do pomiaru stężenia jonów w systemach biologicznych

Przeglądaj więcej filmów