Nanocząstki fluorescencyjne do pomiaru stężenia jonów w systemach biologicznych

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wytworzenie nanoczujników sodu do zastosowań in vitro oraz in vivo. Osiąga się to poprzez przygotowanie mieszaniny opto zawierającej komponenty czujników do nanoczujników. W drugim kroku surfaktant jest poddawany sonikacji w roztworze wodnym w celu jego równomiernego rozproszenia, co umożliwi formowanie nanoczujników po dodaniu mieszaniny opto.

Następnie mieszaninę optyczną dodaje się do wodnej mieszaniny surfaktantów podczas sonikacji, aby utworzyć nanosensory w roztworze. Niniejszy film demonstruje, że odpowiedź sensora jest regulowana. Sensory mogą być wstrzykiwane za pomocą mikroiniekcji do kardiomiocytów, a także mogą być wstrzykiwane podskórnie myszom.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak fluorescencyjne barwniki wskaźnikowe, jest możliwość dostrojenia sensorów do zakresu dynamicznego odpowiadającego środowisku fizjologicznemu, pomiaru szerszego spektrum analitów oraz wykonywania pomiarów ratiometrycznych w celu analizy ilościowej. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ po przygotowaniu sensorów wprowadzenie ich do środowiska biologicznego może wydawać się onieśmielające. Przed przygotowaniem optod zgodnie z protokołem pisemnym należy wcześniej przygotować zapasy suchego jonu sodu four x dry sodium TFPB oraz chromo four three.

W dygestorium połączyć wszystkie materiały w szklanej probówce o pojemności 1,5 ml. Zakręcając probówkę nakrętką z powłoką teflonową, delikatnie mieszać na wortexie do czasu całkowitego rozpuszczenia PVC. Roztwór powinien mieć czerwony kolor.

Rozpocznij przygotowywanie nanoczujników, dodając 100 µL PEG-lipid o stężeniu 10 mg/mL do szklanej fiolki o pojemności 4 g. Następnie dodaj 4 mL pożądanego roztworu wodnego, na przykład 10 mM HEPES.

Zanurz końcówkę sonikatora na siedem milimetrów do fiolki, korzystając z podnośnika laboratoryjnego, i zastosuj niską moc sonikacji przez 30 sekund. W probówce o pojemności 0,6 ml połącz 50 µl materiału optycznego i 50 µl dichlorometanu, używając pipety, aby zapewnić równomierne zmieszanie. Następnie rozpocznij trzyminiutową sonikację.

W momencie rozpoczęcia sonikacji należy dodać 100 µL mieszaniny optycznej, zanurzając końcówkę pipety i dozując całą objętość jednym szybkim, równomiernym wtryskiem. Roztwór zmieni kolor na niebieski, jeśli pH wzrośnie powyżej siedmiem oraz w przypadku braku sodu do usunięcia z roztworu pozostałości THF i dichlorometanu. Przesuń końcówkę sonikacyjną na głębokość dwóch milimetrów.

W ciągu pozostałych trzech minut roztwór stanie się nieprzezroczysty. Po zakończeniu sonikacji naciągnij roztwór nanoczujnika do strzykawki o pojemności 5 ml. Przymocuj filtr i przelej roztwór nanoczujnika do szklanej fiolki z nakrętką.

Zacznij od przygotowania 10 roztworów o stopniowo zwiększającym się stężeniu sodu, w celu pomiaru czułości nanoczujnika. Połącz roztwory sodu o stężeniu 0 M oraz 1 M w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Następnie do płytki 96-dołkowej z przejrzystym dnem dodaj 100 µL każdego stężenia sodu do trzech dołków w kolumnie.

Następnie do każdej studzienki należy dodać 100 µL świeżo przygotowanych nanoczujników, umieścić płytkę we fluorymetrze do mikropłytek i wprowadzić długości fal wzbudzenia, emisji oraz odcięcia, które są optymalne dla stosowanego chromoforu. Wybór mierzonych długości fal zależy od zastosowania. Długości fal te umożliwiają pomiary szybkiej dynamiki wewnątrzkomórkowej lub redukcję szumów.

Aby uzyskać wartości alfa, należy podzielić natężenie przy 570 nanometrach przez natężenie przy 670 nanometrach lub 680 nanometrach. Należy wykreślić wartości alfa w funkcji logarytmu stężenia sodu, przyjmując wartość logarytmu dla stężenia sodu równego zero jako minus jeden.

Następnie dopasuj krzywą sigmoidalną do odpowiedzi i na podstawie tej krzywej oblicz stężenie sodu, przy którym wartość alfa wynosi 0,5. Reprezentuje ono stężenie sodu, przy którym czujnik reaguje optymalnie. Wykorzystując te informacje, dostosuj stosunek sodium iono four x sodium TFPB do chromo iono four three w opto, aby stworzyć nanoczujniki o optymalnym stężeniu sodu.

Na przykład, krzywe odpowiedzi pięciu różnych zestawów nanoczujników reprezentujących różne formulacje optyczne, różniących się jedynie ilością sodu z czterech 10. Do obrazowania wewnątrzkomórkowego należy zastąpić pożywkę komórkową przezroczystym medium, takim jak roztwór Tyro, a następnie przenieść komórki do komory obrazowania. Teraz należy napełnić od tyłu dociągniętą pipetę szklaną roztworem nanoczujników przygotowanym w wodzie z 5 mg/mL glukozy.

Następnie zamocuj pipetę do mikromanipulatora i podłącz ją do systemu wtryskiwania sterowanego ciśnieniem. Opuść pipetę na komórkę i wprowadź ją do cytoplazmy. Czasami konieczne jest delikatne uderzenie w uchwyt manipulatora, aby przebić błonę.

Wstrzyknij kilkaset pikolitrów roztworu nanoczujnika i szybko wycofaj pipetę. Znieczul mysz nagojową szczepu CD-1 izofluranem, korzystając z komory anestezjologicznej. Po znieczuleniu umieść mysz w zdezynfekowanej komorze obrazującej.

Następnie należy napełnić sterylną strzykawkę insulinową o rozmiarze 31 G 10 µL nanoczujników z odpowiednią wartością KD w 10 mM PBS. Należy upewnić się, że za pomocą pęsety usunięto wszystkie pęcherzyki powietrza. Chwytając skórę, należy ująć niewielki fałd skóry na grzbiecie myszy w wybranym miejscu wstrzyknięcia.

Wprowadź strzykawkę w skórę ściętym końcem igły skierowanym do góry, prowadząc igłę równolegle do powierzchni skóry. Następnie delikatnie odciągnij tłok strzykawki, aby upewnić się, że igła nie została wprowadzona do naczynia krwionośnego. Aby zminimalizować ciśnienie wsteczne, ostrożnie przesuń igłę w prawo i w lewo, tworząc w skórze niewielką przestrzeń.

Następnie wstrzyknij sensory i delikatnie wyjmij strzykawkę. Delikatnie uciśnij miejsce wstrzyknięcia i przetrzyj wszelki roztwór, który mógł wycieknąć z miejsca wstrzyknięcia. Zazwyczaj wykonuje się sześć równomiernie rozmieszczonych wstrzyknięć wzdłuż grzbietu.

W przypadku przeprowadzania procedury na różnych myszach należy zmienić igłę, aby zminimalizować ryzyko przeniesienia choroby oraz kontaminacji krzyżowej. Po iniekcjach należy wykonać obrazy w polu jasnym oraz fluorescencyjne, korzystając z zestawów filtrów ściśle dopasowanych do widma wzbudzenia i emisji nanoczujników. Pozwala to również zminimalizować autofluorescencję skóry.

Te neonatalne kardiomiocyty hodowano na szkiełku podstawnym i wstrzyknięto w nie nanoczujniki sodu. Ten obraz fluorescencyjny został wykonany przy długości fali wzbudzenia 639 nanometrów. To jest obraz tych samych komórek w polu jasnym, a tutaj znajduje się nałożenie obu obrazów.

Występuje pewne skupianie się sensorów, jednak komórki zachowują prawidłową morfologię. Sensory rozprzestrzeniły się w całym cytozolu i nie stwierdzono ich akumulacji w jądrach komórkowych. Ta nałożona na siebie obrazowanie w jasnym polu i fluorescencyjne przedstawia dziewięć różnych podskórnych iniekcji nanosensorów sodu do przestrzeni podskórnej myszy nude.

Wytwarzanie nanoczujników Masten może zająć zaledwie kilka minut, jeśli zostanie przeprowadzone prawidłowo, i może zostać zastosowane w dowolnych badaniach do pomiaru odwracalnego przepływu anality w czasie rzeczywistym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wprowadzać nanoczujniki do przestrzeni wewnątrzkomórkowej lub podskórnej w celu dokonania pomiarów ilościowych w środowisku biologicznym.