Fluorescencyjne nanocząstki do pomiaru stężenia jonów w systemach biologicznych

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wytworzenie nanosensorów sodu do zastosowań in vitro oraz in vivo. Osiąga się to poprzez przygotowanie mieszaniny opto zawierającej komponenty sensorowe dla nanosensorów. W drugim kroku surfaktant jest poddawany sonikacji w roztworze wodnym w celu jego równomiernego rozprzestrzenienia, co umożliwi formowanie się nanosensorów po dodaniu mieszaniny opto.

Następnie, w obecności sonikacji, do wodnej mieszaniny surfaktantów dodaje się mieszaninę optyczną, aby utworzyć nanoczujniki w roztworze. Niniejsze wideo demonstruje, że odpowiedź czujnika jest regulowana. Czujniki można wstrzykiwać za pomocą mikroiniekcji do kardiomiocytów, a także podskórnie u myszy.

Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak fluorescencyjne barwniki wskaźnikowe, jest możliwość dostrojenia czujników do zakresu dynamicznego odpowiadającego środowisku fizjologicznemu, pomiar szerszego zakresu analitów oraz przeprowadzanie pomiarów ratiometrycznych w celu analizy ilościowej. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ po wykonaniu czujników wprowadzenie ich do środowiska biologicznego może wydawać się onieśmielające. Roztwory zapasowe suchego sodu ion four x, suchego sodu TFPB oraz chromo four three muszą zostać przygotowane przed wykonaniem opto zgodnie z protokołem pisemnym.

W dygestorium należy połączyć wszystkie materiały w szklanej fiolce o pojemności 1,5 mililitra. Po zamknięciu fiolki nakrętką z teflonową powłoką, należy ją delikatnie wstrząsnąć w wiertleksie, aż cały PVC zostanie rozpuszczony. Roztwór powinien mieć czerwony kolor.

Rozpocznij przygotowanie nanosensorów, dodając 100 µL PEG-lipid w stężeniu 10 mg/mL do szklanej fiolki o pojemności 4 g. Następnie dodaj 4 mL odpowiedniego roztworu wodnego, na przykład 10 mM HEPES.

Zanurz końcówkę sonikatora na siedem milimetrów do fiolki, korzystając z podnośnika laboratoryjnego, i zastosuj niską moc sonikacji przez 30 sekund. W probówce o pojemności 0,6 mililitra połącz 50 µl materiału optycznego i 50 µl dichlorometanu, używając pipety, aby zapewnić równomierne wymieszanie. Następnie rozpocznij trzyminutową sonikację.

Wraz z rozpoczęciem sonikacji dodać 100 µL mieszaniny opto, zanurzając końcówkę pipety i dozując całą objętość jednym szybkim, równomiernym wtryskiem. Roztwór zmieni kolor na niebieski, jeśli pH wzrośnie powyżej siedmiu i jeśli nie ma sodu, który usunąłby resztki THF i dichlorometanu z roztworu. Przesunąć końcówkę sonikatora na głębokość dwóch milimetrów.

W ciągu pozostałych trzech minut roztwór stanie się nieprzezroczysty. Po zakończeniu sonikacji pobierz roztwór nanoczujnika do strzykawki o pojemności 5 ml. Przymocuj filtr i przelej roztwór nanoczujnika do szklanej fiolki z nakrętką.

Rozpocznij od przygotowania 10 roztworów o stopniowo zwiększającym się stężeniu sodu, które posłużą do pomiaru czułości nanoczujnika. Połącz roztwory stokowe sodu o stężeniu 0 M i 1 M w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Następnie do płytki 96-dołkowej z dnem optycznym dodaj po 100 µl każdego stężenia sodu do trzech dołków w jednej kolumnie.

Następnie do każdej studzienki dodaje się 100 µL świeżo przygotowanych nanoczujników, umieszcza płytkę we fluorymetrze do mikropłytek i wprowadza długości fal wzbudzenia, emisji oraz odcięcia, które są optymalne dla stosowanego chromoforu. Wybór mierzonych długości fal zależy od zastosowania. Długości fal te umożliwiają pomiary szybkiej dynamiki wewnątrzkomórkowej lub redukcję szumów.

Aby uzyskać wartości alfa, należy podzielić stosunek intensywności przy 570 nanometrach przez intensywność przy 670 nanometrach lub 680 nanometrach. Następnie należy nanieść wartości alfa na wykres w funkcji logarytmu stężenia sodu, przyjmując wartość logarytmu dla zerowego stężenia sodu jako minus jeden.

Następnie dopasuj krzywą sigmoidalną do odpowiedzi, a na podstawie tej krzywej oblicz stężenie sodu, przy którym wartość alfa wynosi 0,5. Reprezentuje ono stężenie sodu, przy którym czujnik reaguje optymalnie. Wykorzystując te informacje, dostosuj stosunek sodium iono four x sodium TFPB oraz chromo iono four three w opto, aby stworzyć nanoczujniki o optymalnym stężeniu sodu.

Na przykład, krzywe odpowiedzi dla pięciu różnych zestawów nanoczujników reprezentujących różne formulacje optyczne, różniące się jedynie ilością sodu z czterech 10. Do obrazowania wewnątrzkomórkowego należy zastąpić pożywkę komórkową przezroczystą pożywką, taką jak roztwór Tyro, a następnie przenieść komórki do komory obrazowania. Teraz należy wypełnić od tyłu wypaloną pipetę szklaną roztworem nanoczujników przygotowanym w wodzie z glukozą o stężeniu 5 mg/mL.

Następnie zamocuj pipetę w mikromanipulatorze i podłącz ją do systemu wstrzykiwania sterowanego ciśnieniem. Opuść pipetę na komórkę i wprowadź ją do cytoplazmy. Czasami konieczne jest delikatne stuknięcie uchwytu manipulatora, aby przebić błonę.

Wstrzyknij kilkaset pikolitrów roztworu nanoczujnika i szybko wycofaj pipetę. Znieczul mysz naga szczepu CD-1 izofluranem, używając komory anestezjologicznej. Po znieczuleniu umieść mysz w zdezynfekowanej komorze obrazowej.

Następnie napełnij sterylną strzykawkę insulinową o rozmiarze 31 G 10 µL nanoczujników o odpowiedniej stałej KD w 10 mM PBS. Upewnij się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte za pomocą pęsety. Chwyć pęsetą niewielką fałdę skóry na grzbiecie myszy w wybranym miejscu wstrzyknięcia.

Wprowadź strzykawkę w skórę ściętym końcem igły skierowanym do góry, prowadząc igłę równolegle do powierzchni skóry. Następnie odciągnij tłok strzykawki, aby upewnić się, że igła nie została wprowadzona do naczynia krwionośnego. Aby zminimalizować ciśnienie wsteczne, delikatnie przesuwaj igłę w prawo i w lewo, tworząc w skórze niewielką przestrzeń.

Następnie wstrzyknij sensory i ostrożnie wyjmij strzykawkę. Delikatnie uciśnij miejsce wstrzyknięcia i wytrzyj roztwór, który mógł wypłynąć z miejsca wkłucia. Zazwyczaj wykonuje się sześć równomiernie rozmieszczonych wstrzyknięć wzdłuż grzbietu.

W przypadku wykonywania procedury na różnych myszach, należy wymienić igłę, aby zminimalizować ryzyko przenoszenia chorób i zanieczyszczeń krzyżowych. Po wykonaniu wstrzyknięć należy wykonać obrazy w świetle białym i fluorescencyjne, używając zestawów filtrów ściśle dopasowanych do widma wzbudzenia i emisji nanoczujników. Pozwala to również zminimalizować autofluorescencję skóry.

Te neonatalne kardiomiocyty hodowano na szkiełku podstawnym i wstrzyknięto im nanoczujniki sodu. Ten obraz fluorescencyjny został wykonany przy długości fali wzbudzenia 639 nanometrów. Jest to obraz w polu jasnym tych samych komórek, a tutaj znajduje się nałożenie obu obrazów.

Występuje pewne skupianie się czujników, jednak komórki zachowują prawidłową morfologię. Czujniki rozprzestrzeniły się w całym cytosolu i nie obserwuje się ich akumulacji w jądrach komórkowych. Ta nałożona na siebie obraz z jasnego pola i obraz fluorescencyjny przedstawia dziewięć różnych podskórnych iniekcji nanoczujników sodu do przestrzeni podskórnej myszy nagoj.

Po opanowaniu techniki, wytwarzanie nanoczujników Masten może zająć zaledwie kilka minut, jeśli proces zostanie przeprowadzony prawidłowo, a metoda ta może być zastosowana w dowolnych badaniach w celu pomiaru odwracalnych w czasie rzeczywistym zmian stężenia analitu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wprowadzać nanoczujniki do przestrzeni wewnątrzkomórkowej lub podskórnej w celu przeprowadzenia pomiarów ilościowych w środowisku biologicznym.