Polimery z pamięcią kształtu do aktywnej hodowli komórek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest hodowla komórek na podłożu o topografii zmieniającej się w czasie. Osiąga się to poprzez wstępne zaprogramowanie polimeru z pamięcią kształtu do trwałej formy, która może zostać zapamiętana. Następnie polimer z pamięcią kształtu jest programowany do formy tymczasowej, na której w późniejszym etapie wysiewa się komórki.

Ostatnim etapem procedury jest wywołanie powrotu polimeru z pamięcią kształtu do jego pierwotnej formy poprzez zwiększenie temperatury, co w konsekwencji pozwala uzyskać wyniki wykazujące zmianę zachowania komórek w badaniu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Dzień dobry, nazywam się Pat Mather. Jestem profesorem inżynierii biomedycznej i chemicznej oraz dyrektorem Instytutu Biomateriałów w Syracuse na Uniwersytecie Syracuse.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z komercyjnymi lub specjalistycznymi urządzeniami do rozciągania komórek jest możliwość zastosowania szerokiej gamy złożonych odkształceń w obrębie pojedynczego systemu polimerowego. Nazywam się Jay Henderson. Jestem adiunktem w Katedrze Inżynierii Biomedycznej i Chemicznej oraz członkiem Syracuse Biomaterials Institute.

Ta metoda może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mechanobiologii, takie jak sposób, w jaki komórki reagują na dynamiczne zmiany w ich środowisku fizycznym. Nazywam się Kevin Davis i jestem doktorantem na Uniwersytecie w Syracuse w Departamencie Inżynierii Biomedycznej i Inżynierii Chemicznej. Chociaż metoda ta pozwala zgłębić wiedzę na temat mechanobiologii 2D, może być ona również wykorzystana w innych systemach, takich jak trójwymiarowe (3D) rusztowania zmieniające kształt w inżynierii tkankowej.

Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować specjalną komorę utwardzania, wykorzystując szkiełko przedmiotowe, teflonowy dystans o grubości 1 mm oraz płytkę aluminiową. Zabezpieczyć komorę za pomocą małych żabek biurowych, a następnie wstrzyknąć NOA 63 do wnętrza komory przez otwór w teflonowym dystansie, używając igły o rozmiarze 18 G. Następnie umieścić komorę na płycie grzewczej ustawionej na 125 °C.

Po nagrzaniu komory należy odczekać pięć minut, aby osiągnęła ona jednolitą temperaturę. Utwardzać NOA 63 przez 20 minut, umieszczając lampę UV w odległości 6,5 centymetrów od powierzchni szkła. Wyjąć NOA 63 z komory, gdy jest jeszcze ciepły, używając żyletki.

Następnie przeprowadź dotwardzanie polimeru z pamięcią kształtu pod światłem UV przez trzy godziny i 40 minut bezpośrednio na płycie grzejnej w temperaturze 125 °C. Aby scharakteryzować pamięć kształtu NOA 63, przygotuj próbkę w kształcie hantla poprzez prasowanie na gorąco utwardzonej folii za pomocą specjalnie dostosowanego wycinaka. Na koniec zamocuj próbkę w analizatorze mechanicznym (DMA) z uchwytem do rozciągania.

Ustaw instrument w trybie kontroli siły i zaprogramuj procedurę testową zgodnie z protokołem pisemnym dołączonym do tego filmu. Wynikiem procedury jest izotermicznie utwardzona folia z polimeru z pamięcią kształtu lub folia SMP. Umieść CSMP na płycie grzewczej i ustaw temperaturę wyższą niż temperatura przejścia szklistego, aby obniżyć moduł i ułatwić wycinanie. W celu przygotowania pojedynczych próbek z izotermicznie utwardzonej folii SMP.

Wytnij folię s i p żyletką do pożądanej wielkości próbki. Tymczasowy kształt można utrwalić na kilka różnych sposobów. W tym przypadku zastosowano laboratoryjną prasę hydrauliczną z płytami, które mogą być podgrzewane i chłodzone, aby wytłoczyć tymczasową topografię.

Najpierw ustaw temperaturę PLA powyżej tg. Na potrzeby tej demonstracji wykonano wytłaczarkę poprzez utwardzenie żywicy epoksydowej na płycie winylowej w celu uzyskania tymczasowego kształtu równoległych rowków. Wytłaczarkę można wykonać z innych materiałów i o innej topografii, jednak musi być ona sztywniejsza niż NOA 63.

W temperaturze tłoczenia umieść próbki s i p stroną roboczą do dołu na tłoczniku. Następnie umieść próbki wraz z tłocznikiem w prasie. Zastosuj wstępne obciążenie o wartości około 100 kilo pascals, aby zapewnić kontakt między grzewczymi płytami PLA a próbkami, i utrzymaj ten stan przez około pięć minut, aby próbki osiągnęły jednorodną temperaturę.

Po osiągnięciu jednolitej temperatury należy przyłożyć do próbek nacisk od jednego do sześciu megapaskali i utrzymać go przez jedną minutę. SMP ulegnie pęknięciu, jeśli zostanie przyłożone większe naprężenie.

Zastosuj mniejsze naprężenia, aby wprowadzić topografie o mniejszych amplitudach. Po przyłożeniu nacisku obniż pole temperatur poniżej TG, wykorzystując funkcję chłodzenia wodą płyt prasy. Gdy temperatura spadnie poniżej tg, zdejmij przyłożoną siłę przed rozpoczęciem eksperymentu z aktywną hodowlą komórkową.

Światło UV w szafce bezpieczeństwa biologicznego służy do sterylizacji próbek. Próbki należy ułożyć stroną skierowaną w dół w sterylnych naczyniach bez przykrywek, a następnie włączyć lampę UV na sześć godzin. Następnie należy przenieść próbki do nowych sterylnych naczyń, układając je stroną skierowaną do góry.

Włącz lampę UV na dodatkowe sześć godzin. Próbki muszą zostać wyrównane do stanu względnej stabilności przed wysianiem komórek. Umieść próbki w płytce 96-dołkowej i dodaj 150 µL pełnej pożywki wzrostowej.

Medium na dołek. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 30 °C z 5% CO2 aż do uzyskania pożądanej częściowej regeneracji. W tej demonstracji próbki są inkubowane przez 30 godzin, aby uzyskać amplitudę wystarczająco dużą do wyrównania komórek.

Po osiągnięciu częściowej regeneracji próbki można zasiać komórkami. Umieść próbki w nowym 96-dołkowym copolymerze. Następnie dodaj 150 µL roztworu komórek do każdej z próbek w położeniu C3 H 10 t i pół.

Większość fibroblastów embrionalnych stosuje się w stężeniu 20 000 komórek na mililitr. Aby uzyskać odizolowane komórki, należy pozwolić im przytwierdzić się i rozprzestrzenić na tymczasowej topografii poprzez inkubację w temperaturze 30 °C przez 9,5 godziny. Następnie, przed przejściem do kolejnego etapu, należy ocenić morfologię komórek poprzez pobranie próbek, ich zabarwienie oraz wykonanie obrazowania fluorescencyjnego.

Materiał ten wykazuje autofluorescencję w większości zakresu UV i światła widzialnego; aby zredukować tło, zaleca się stosowanie fluoroforów z dalekiej czerwieni widma, takich jak Alexa Fluor 647. Aby próbki zostały poddane regeneracji, przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C i kontynuuj hodowlę przez 19 godzin. Pozwala to materiałowi na regenerację, a komórkom na dostosowanie morfologii do nowej topografii. Po inkubacji zastosuj odpowiednie barwniki, takie jak falloidyna, do obrazowania aktyny filamentowej.

W ramach ostatniego etapu można wykonać obrazowanie komórek na nowej topografii; przedstawiony tutaj jest efekt jednokierunkowego efektu pamięci kształtu materiału NOA 63. Proces powtórzono trzykrotnie, gdzie gwiazdka oznacza początek utwardzania eksperymentalnego. NOA 63 jest przezroczystym, szklistym ciałem stałym, które wykazuje doskonałe właściwości pamięci kształtu.

W tym przypadku materiał został utwardzony i wykazuje jednorodną TG wynoszącą 51,1 °C, określoną na podstawie początku spadku modułu zachowawczego. Spadek odkształcenia widoczny tutaj występuje przy zmierzonej tg. Duży procent z przyłożonego odkształcenia 4,7% został utrwalony po odciążeniu przy 20 °C, co odpowiada współczynnikowi utrwalenia wynoszącemu 89,3%. Odkształcenie utrwalone zostało następnie odzyskane ze współczynnikiem 84,4% w stosunkowo niewielkim zakresie temperatur podczas ogrzewania.

Właściwości pamięci kształtu nie uległy pogorszeniu do trzech cykli, co potwierdza fakt, że wszystkie krzywe przebiegały niemal dokładnie tą samą ścieżką. Amplituda tymczasowej topografii zmniejsza się w czasie w temperaturze 30 °C w ciągu 30 godzin. W temperaturze 30 °C.

Amplituda została zredukowana o około 50% wskazaną tutaj w czasie zero. Następnie zmniejsza się o kolejne 10% w ciągu następnych 9,5 godziny. Po wywołaniu regeneracji poprzez zwiększenie temperatury do 37 °C, amplituda spada do 0,5% amplitudy początkowej w ciągu 9,5 godziny dla użytego embossera i naprężenia tłoczenia wynoszącego 4,9 MPa.

Odpowiada to funkcjonalnej zmianie rowków o szerokości 13 µm w niemal płaską powierzchnię. Polimer ten odzyskuje pierwotny kształt w zakresie temperatur od 30 do 37 °C w warunkach hodowli komórkowej. Wynika to z absorpcji wody z pożywki hodowlanej; woda plastyfikuje polimer, co obniża tg, umożliwiając regenerację w temperaturach niższych niż sucha TG wynosząca 51 °C.

Przykładem zachowania komórki kontrolowanego za pomocą aktywnych podłoży do hodowli komórkowych jest zmiana organizacji cytoszkieletu na tymczasowych podłożach żłobkowanych. Przed wywołaniem regeneracji mikrofilamenty aktynowe ustawiają się wzdłuż kierunku żłobień. Po regeneracji wywołanej wzrostem temperatury mikrofilamenty ulegają reorganizacji i są zorientowane w sposób losowy.

Z kolei próbki kontrolne posiadające statyczne, płaskie powierzchnie lub statyczne rowki nie reorganizują się po podwyższeniu temperatury. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że geometrię komory utwardzania, temperaturę przejścia polimeru, metodę utrwalania odkształcenia oraz skład samego polimeru można dostosować, aby uzyskać pożądane przejście we własnym eksperymencie stosując tę procedurę. Do odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak zmiana ekspresji genów w odpowiedzi na stymulację mechaniczną ze strony podłoża po jego opracowaniu, można wykorzystać inne metody, np. real-time PCR.

Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie mechanobiologii komórki do badania cytozykoszkieletu komórkowego, jego reorganizacji oraz fizyki materii miękkiej w dwóch wymiarach. Dziękujemy za zainteresowanie naszą pracą i dziękujemy za oglądanie.