Polimery z pamięcią kształtu do aktywnej hodowli komórkowej

Ogólnym celem tej procedury jest hodowla komórek w podłożu o topografii, która zmienia się w czasie. Osiąga się to poprzez najpierw zaprogramowanie polimeru z pamięcią kształtu w trwały kształt, który można zapamiętać. Polimer z pamięcią kształtu jest następnie programowany w tymczasowy kształt, na którym komórki są później platerowane.

Ostatnim etapem procedury jest wywołanie, aby polimer z pamięcią kształtu powrócił do swojego stałego kształtu poprzez zwiększenie temperatury, ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują zmianę zachowania komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Cześć, nazywam się Pat Mather. Jestem profesorem inżynierii biomedycznej i chemicznej oraz dyrektorem Instytutu Biomateriałów w Syracuse na Uniwersytecie w Syracuse.

Główną przewagą tej techniki nad komercyjnymi lub niestandardowymi aparatami do rozciągania komórek jest to, że w jednym systemie polimerowym jesteśmy w stanie zastosować do komórek szeroką gamę złożonych szczepów. Nazywam się Jay Henderson. Jestem adiunktem inżynierii biomedycznej i chemicznej oraz członkiem Instytutu Biomateriałów w Syracuse.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mechanobiologii, takie jak to, jak komórki reagują na dynamiczne zmiany w ich środowisku fizycznym. Nazywam się Kevin Davis i jestem doktorantem na Uniwersytecie Syracuse na Wydziale Inżynierii Biomedycznej i Inżynierii Chemicznej. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w biologię mechaniczną 2D, może być również stosowana w innych systemach, takich jak rusztowania zmieniające kształt 3D dla inżynierii tkankowej.

Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować niestandardową komorę utwardzania za pomocą szkiełka podstawowego, teflonowej przekładki o grubości jednego milimetra i aluminiowej płytki. Zabezpiecz komorę za pomocą małych klipsów do segregatora, aby rozpocząć, wstrzyknij NOA 63 do komory przez otwór w przekładce teflonowej za pomocą igły o rozmiarze 18. Następnie umieść komorę w płycie grzejnej ustawionej na 125 stopni Celsjusza.

Pozwól komorze nagrzać się do jednolitej temperatury przez pięć minut po podgrzaniu komory. Zaopatrz NOA 63 na 20 minut, umieszczając lampę UV 6.5 centymetra od powierzchni szkła. Wyjmij NOA 63 z komory, gdy jest jeszcze ciepły, za pomocą żyletki.

Następnie polimer z pamięcią kształtu należy utwardzić pod wpływem światła UV przez trzy godziny i 40 minut bezpośrednio na płycie grzejnej w temperaturze 125 stopni Celsjusza. Aby scharakteryzować pamięć kształtu NOA 63, przygotuj próbkę hantli, naciskając na gorąco utwardzoną folię za pomocą niestandardowego stempla. Na koniec wrzuć próbkę do dynamicznego analizatora mechanicznego z uchwytem rozciągającym.

Ustaw przyrząd w trybie sterowania siłowego i zaprogramuj procedurę testowania, jak znajduje się w pisemnym protokole dołączonym do tego filmu. Wynikiem zabiegu jest utwardzany izotermicznie polimer z pamięcią kształtu lub folia SMP, umieszczanie CSMP w płycie grzejnej i ustawienie temperatury wyższej niż temperatura zeszklenia w celu zmniejszenia modułu i ułatwienia cięcia. Do przygotowania pojedynczych próbek z izotermicznie utwardzanej folii s i p.

Przytnij film s i p za pomocą brzytwy do żądanego rozmiaru próbki. Tymczasowy kształt można przymocować na wiele różnych sposobów. Tu. Stołowa prasa hydrauliczna z płytami, które można podgrzewać i chłodzić, służy do wytłaczania tymczasowej topografii.

Najpierw ustaw temperaturę PLA na temperaturę wyższą od tg. Na potrzeby tej demonstracji wykonano wytłaczarkę poprzez utwardzenie żywicy epoksydowej na płycie winylowej w celu uzyskania tymczasowego kształtu równoległych rowków. Wytłaczarka może być wykonana z innych materiałów i o innej topografii, ale musi być sztywniejsza niż NOA 63.

W temperaturze wytłaczania umieść próbki s i p zadrukowaną stroną do dołu na wytłaczarce. Następnie umieść próbki i wytłaczarkę w prasie. Zastosować około 100 kilo paskali obciążenia wstępnego, aby nawiązać kontakt między ogrzewającymi PLA a próbkami przytrzymaj przez około pięć minut, aby umożliwić próbkom osiągnięcie jednolitej temperatury.

Po osiągnięciu jednolitej temperatury nanieść od jednego do sześciu megapaskali na próbki i przytrzymać przez jedną minutę. SMP pęknie. Jeśli zostanie przyłożone większe naprężenie.

Zastosuj mniejsze naprężenia, aby wprowadzić topografie o mniejszych amplitudach. Po przyłożeniu ciśnienia zmniejsz temperaturę poniżej TG, wykorzystując zdolność chłodzenia wodą tkanin prasy. Gdy temperatura spadnie poniżej tg, usuń przyłożoną siłę przed rozpoczęciem eksperymentu z aktywną hodowlą komórkową.

Światło UV komory bezpieczeństwa biologicznego służy do sterylizacji próbek. Ułóż próbki stroną zadrukowaną do dołu w sterylnych naczyniach bez pokrywek i włącz światło UV na sześć godzin. Następnie odwróć próbki do nowych sterylnych naczyń w pozycji zadrukowaną do góry.

Włącz światło UV na dodatkowe sześć godzin. Próbki muszą być zrównoważone do względnie stabilnego stanu przed posiewem z komórkami. Umieść próbki na 96-dołkowej płytce i dodaj 150 mikrolitrów całkowitego wzrostu.

Medium na studzienkę. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza z 5% CO2, aż do osiągnięcia pożądanego częściowego odzysku. W tej demonstracji próbki są inkubowane przez 30 godzin, aby wytworzyć wystarczająco dużą amplitudę, aby wyrównać komórki.

Po osiągnięciu częściowego odzysku próbki można posiać z komórkami. Umieścić próbki na nowej płytce 96-dołkowej. Następnie dodaj 150 mikrolitrów roztworu komórkowego do każdej z próbek tutaj, C3 H 10 t i pół.

Większość fibroblastów embrionalnych jest używana w ilości 20 000 komórek na mililitr. Aby uzyskać izolowane komórki, pozwól komórkom przyczepić się i rozprzestrzenić w tymczasowej topografii, inkubując w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 9,5 godziny. Następnie oznacz morfologię komórek przed przejściem, usuwając próbki i wykonując barwienie i obrazowanie fluorescencyjne próbek.

Materiał ten wykazuje autofluorescencję w większości promieni UV i widzialnych czwórek fluorowych na dalekim czerwonym końcu spektrum, takich jak Alexa Fluor 6 47, zaleca się redukcję tła w celu wywołania odzyskania próbek, przenieś płytkę do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i kontynuuj hodowlę przez 19 godzin. Dzięki temu materiał może się zregenerować, a komórki dostosować swoją morfologię do nowej topografii. Po inkubacji nałóż odpowiednie barwniki, takie jak fallin, do obrazowania aktyny nitkowatej.

Ostatnim krokiem jest to, że komórki mogą zostać zobrazowane w nowej topografii, pokazanej tutaj jako masowa jednokierunkowa pamięć kształtu pojedynczego lekarstwa NOA 63. Powtórzone trzy razy, gdzie gwiazdka oznacza wyleczenie eksperymentalne. NOA 63 jest przezroczystym, szklistym ciałem stałym, które ma doskonałe właściwości pamięci kształtu.

W tym przypadku materiał został utwardzony i wykazuje jednolitą TG wynoszącą 51,1 stopnia Celsjusza, określoną od początku spadku modułu przechowywania. Widoczny tutaj spadek odkształcenia występuje przy zmierzonym tg. Duży procent z 4,7% zastosowanego szczepu został utrwalony po rozładowaniu o 20 stopni Celsjusza, co odpowiada współczynnikowi utrwalania 89,3%Utrwalone odkształcenie zostało następnie odzyskane w stosunku 84,4% w stosunkowo niewielkim zakresie temperatur podczas ogrzewania.

Wydajność pamięci kształtu nie wykazała pogorszenia do trzech cykli, o czym świadczy fakt, że wszystkie krzywe podążają prawie dokładnie tą samą ścieżką. Amplituda tymczasowej topografii zmniejsza się z czasem przy 30 stopniach Celsjusza o 30 godzin. W 30 stopniach Celsjusza.

Amplituda została zmniejszona o około 50%, co wskazuje tutaj w czasie zero. Zmniejsza się o kolejne 10% w ciągu następnych 9,5 godziny. Gdy odzyskiwanie jest wyzwalane przez zwiększenie temperatury do 37 stopni Celsjusza, amplituda zmniejsza się do 0,5% początkowej amplitudy w ciągu 9,5 godziny dla użytej wytłaczarki i naprężenia wytłaczającego 4,9 megapaskali

Odpowiada to funkcjonalnej zmianie 13 mikrometrów rowków na prawie płaską powierzchnię. Polimer ten odzyskuje się w zakresie temperatur od 30 do 37 stopni w warunkach hodowli komórkowej. Wynika to z poboru wody z pożywki hodowlanej, plastik wodny zalicza się do polimeru, co obniża tg, umożliwiając odzysk w temperaturach poniżej suchej TG wynoszącej 51 stopni.

Przykładem zachowania komórki kontrolowanego za pomocą aktywnych substratów do hodowli komórkowych jest zmiana organizacji cytoszkieletu na tymczasowych rowkowanych podłożach. Zanim dojdzie do odzysku, mikrofilamenty aktynowe ustawiają się wzdłuż kierunku rowków. Po odzyskaniu przez wzrost temperatury, mikrowłókna zreorganizowały się i są losowo zorientowane.

I odwrotnie, próbki kontrolne, które mają statyczne, płaskie lub statyczne rowki, nie reorganizują się po wzroście temperatury. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że geometria komory utwardzania, temperatura przejścia polimeru, metoda mocowania odkształcenia i skład samego polimeru mogą być dostosowane, aby osiągnąć pożądane przejście we własnym eksperymencie Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak Real Time PCR, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, jak zmienia się ekspresja genów w odpowiedzi na mechaniczną stymulację z substratu po jego rozwoju.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mechanobiologią komórek do zbadania fizyki cytoszkieletu, rearanżacji i miękkiej materii w dwóch wymiarach. Dziękujemy za zainteresowanie naszą pracą i dziękujemy za oglądanie.