Name: Polimery z pamięcią kształtu do aktywnej hodowli komórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Poznaj metodę aktywnej hodowli komórkowej z wykorzystaniem polimerów z pamięcią kształtu do dynamicznej zmiany topografii podłoża. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi komórek na zmiany mechaniczne w środowisku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Kelly A. Burke za pomoc techniczną przy przygotowaniu podłoża ACC. Na podstawie artykułu opublikowanego w Biomaterials, Davis KA, et al., Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates, Biomaterials, doi:10.1016/j.biomaterials.2010.12.006, Copyright Elsevier (2011). Materiał ten powstał w ramach prac finansowanych przez NSF w ramach grantu nr DMR-0907578.

1. Izotermiczne utwardzanie UV NOA63
<ol>
<li>Niestandardową komorę utwardzania wykonano przy użyciu szkiełka przedmiotowego (75 mm x 25 mm x 1 mm), teflonowego dystansera o grubości 1 mm oraz aluminiowej płytki (75 mm x 25 mm x 3 mm), jak pokazano na Rysunku 1. Komora jest utrzymywana w całości za pomocą małych klipsów biurowych.</li>
<li>Wstrzyknij NOA63 do komory przez otwór w teflonowym dystanserze, używając igły o rozmiarze 18 G. NOA63 można delikatnie podgrzać, aby ułatwić wstrzykiwanie.</li>
<li>Umieść komorę na płycie grzejnej ustawionej na 125 °C i pozostaw do nagrzania do jednolitej temperatury przez 5 min.</li>
<li>Wstępnie utwardź NOA63 w komorze z lampą UV (λmax = 365 nm; patrz Tabela) przez 20 min, przy zachowaniu odległości 6,5 cm lampy od powierzchni szkła.</li>
<li>Wyjmij NOA63 z komory, gdy jest jeszcze ciepły, używając żyletki.</li>
<li>Dokonaj końcowego utwardzania NOA63 pod światłem UV przez 3 h 40 m na płycie grzejnej w temperaturze 125 °C.</li>
<li>Przechowuj NOA63 w warunkach osuszonych w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Charakterystyka pamięci kształtu NOA63
<ol>
<li>Przygotuj próbkę w kształcie hantla poprzez prasowanie na gorąco utwardzonej folii NOA63 za pomocą dostosowanego wycinaka (patrz Tabela), którego wymiary przedstawiono na Rysunku 2.</li>
<li>Umieść próbkę w analizatorze dynamiczno-mechanicznym (DMA; patrz Tabela) z uchwytem do rozciągania. Ustaw instrument w tryb „sterowania siłą” (force controlled), a następnie zaprogramuj procedurę testową w następujący sposób:
<ol>
<li>Ustabilizuj temperaturę do 95.00 °C</li>
<li>Utrzymuj izotermicznie przez 10.00 min</li>
<li>Zwiększaj siłę w tempie 0.300 N/min do 2.500 N</li>
<li>Utrzymuj izotermicznie przez 5.00 min</li>
<li>Obniżaj temperaturę w tempie 2.00 °C/min do 20.00 °C</li>
<li>Utrzymuj izotermicznie przez 10.00 min</li>
<li>Zmniejszaj siłę w tempie 0.300 N/min do 0.015 N</li>
<li>Utrzymuj izotermicznie przez 5.00 min</li>
<li>Zwiększaj temperaturę w tempie 2.00 °C/min do 95.00 °C</li>
<li>Powtórz kroki 2-9 jeszcze dwa razy</li>
</ol></li>
</ol>
3. Przygotowanie aktywnych podłoży do hodowli komórkowych
<ol>
<li>Poszczególne próbki można przygotować z izotermicznie utwardzonej folii SMP. Przytnąć folię SMP żyletką do pożądanego rozmiaru próbki. Umieścić SMP na płycie grzejnej ustawionej na temperaturę wyższą niż Tg, aby zmniejszyć moduł i ułatwić cięcie.</li>
<li>Kształt tymczasowy można utrwalić na kilka różnych sposobów. W tym przypadku używamy laboratoryjnej prasy hydraulicznej z podgrzewanymi/chłodzonymi płytami w celu wytłoczenia tymczasowej topografii. Ustawić temperaturę płyt powyżej Tg.</li>
<li>Wytłaczarkę wykonano poprzez utwardzenie żywicy epoksydowej na płycie winylowej. Pozwoli to na uzyskanie tymczasowego kształtu w postaci równoległych rowków. W tym przypadku wytłaczarka miała trójkątne wierzchołki o wysokości od 35 do 40 μm i szerokości 60 μm, rozmieszczone w odstępach 80 μm. Wytłaczarkę można wykonać z innych materiałów i o innej topografii, ale musi być ona sztywniejsza niż NOA63 w temperaturze tłoczenia. Umieścić próbki SMP stroną roboczą do dołu na wytłaczarce, a następnie umieścić próbki wraz z wytłaczarką w prasie.</li>
<li>Przyłożyć obciążenie wstępne o wartości ~100 kPa, aby zapewnić kontakt między płytami grzejnymi a próbkami, i utrzymać przez ~5 minut, aby próbki osiągnęły jednorodną temperaturę.</li>
<li>Przyłożyć do próbek nacisk 1-6 MPa i utrzymać przez 1 minutę. Naprężenie rzędu 4,7 MPa prowadzi do niepełnego odwzorowania topografii wytłaczarki. Uzyskana tymczasowa topografia ma zaokrąglone wierzchołki o wysokości od 25 do 35 μm i szerokości 150 μm. SMP ulegnie pęknięciu, jeśli zostanie przyłożone większe naprężenie. Przyłożyć mniejsze naprężenia, aby wprowadzić topografie o mniejszych amplitudach.</li>
<li>Obniżyć temperaturę poniżej Tg. W tym przypadku wykorzystujemy funkcję chłodzenia wodnego płyt prasy.</li>
<li>Gdy temperatura spadnie poniżej Tg, usunąć przyłożoną siłę.</li>
<li>Próbki można przechowywać w warunkach osuszonych w temperaturze -20 °C. Przy przechowywaniu w tych warunkach zaobserwowaliśmy spadek odzysku amplitudy o mniej niż 1 μm po dwóch miesiącach dla próbek wytłoczonych za pomocą wytłaczarki z płyty winylowej.</li>
</ol>
4. Eksperyment z aktywną hodowlą komórkową
<ol>
<li>Światło UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) służy do sterylizacji próbek. Rozmieścić próbki stroną aktywną do dołu w sterylnych naczyniach bez pokrywek i włączyć lampę UV w BSC na 6 h.</li>
<li>Przenieść próbki do nowych sterylnych naczyń stroną aktywną do góry. Włączyć lampę UV w BSC na 6 h.</li>
<li>Próbki muszą teraz zostać doprowadzone do stanu względnej równowagi przed wysianiem komórek. Umieścić próbki na płytce 96-dołkowej i dodać 150 μl pełnej pożywki wzrostowej.</li>
<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 30 °C z 5% CO2 do momentu osiągnięcia pożądanego częściowego powrotu. W tym przypadku zastosowano czas 30 h, aby uzyskać próbki o amplitudzie wystarczająco dużej do wyrównania komórek.</li>
<li>Można teraz wysiać komórki na próbki. Przenieść próbki na nową płytkę 96-dołkową.</li>
<li>Dodać do próbek 150 μl zawiesiny komórkowej. W tym przypadku zastosowano mysie fibroblasty embrionalne C3H/10T1/2 w stężeniu 20 000 komórek/ml, aby uzyskać izolowane komórki (zazwyczaj niekontaktujące się z innymi komórkami).</li>
<li>Aby umożliwić komórkom przytwierdzenie i rozprzestrzenienie się na tymczasowej topografii, inkubować w temperaturze 30 °C przez 9,5 h.</li>
<li>W celu analizy morfologii komórek przed przejściem, wyjąć próbki i przeprowadzić ich barwienie oraz obrazowanie fluorescencyjne. Materiał ten wykazuje autofluorescencję w większości zakresu UV i światła widzialnego. Aby zredukować tło, zaleca się stosowanie fluoroforów z dalekiej czerwieni widma, takich jak Alexa Fluor 647.</li>
<li>Aby zainicjować powrót próbek, przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C i kontynuować hodowlę przez 19 h, aby umożliwić regenerację materiału oraz adaptację morfologii komórek do nowej topografii.</li>
<li>Wyjąć próbki, zastosować odpowiedni barwnik (faloidynę do obrazowania aktyny filamentowej) i przeprowadzić procedury obrazowania.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Utwardzony NOA63 jest przezroczystym, szklistym ciałem stałym o doskonałych właściwościach pamięci kształtu, co pokazano na Rysunku 3. W tym przypadku materiał został utwardzony zgodnie z Protokółem 1 opisanym powyżej i wykazuje jednorodną temperaturę przejścia szklistego Tg wynoszącą 51,1 °C (wyznaczoną na podstawie początku spadku E'). Z jednokierunkowych cykli pamięci kształtu (ogrzewanie, odkształcanie, chłodzenie, powrót, Rysunek 3) wynika, że po odciążeniu w temperaturze 20 °C utrwalił się znaczny procent odkształcenia, co odpowiada wskaźnikowi utrwalenia15 (Rf) wynoszącemu 89,3% (średnia z trzech cykli; analogicznie poniżej dla Rr). Odkształcenie utrwalone zostało odzyskane ze wskaźnikiem powrotu (Rr) wynoszącym 84,4% w stosunkowo wąskim zakresie temperatur podczas ogrzewania. Ponadto wydajność pamięci kształtu nie uległa pogorszeniu do trzech cykli włącznie, co potwierdza fakt, że wszystkie krzywe niemal dokładnie się pokrywają.
W niniejszym protokole zastosowano NOA63, ponieważ jest on łatwo dostępny u producenta i dostarczany w formie łatwo utwardzalnego, bezrozpuszczalnikowego prepolimeru z fotoinicjatorem. Należy jednak zauważyć, że jego skład nie został ujawniony przez dostawcę. Stwierdzono, że pozwala on na wysoką adhezję oraz przeżywalność komórek. Ponadto temperaturę przejścia można było dostosować tak, aby uzyskać znaczną wartość regeneracji pomiędzy dwiema temperaturami kompatybilnymi z komórkami. W tym protokole można by zastosować szereg innych systemów polimerowych, pod warunkiem, że temperatura ich przejścia jest zgodna z wymaganiami hodowli komórkowej oraz że sprzyjają one adhezji i przeżywalności komórek.
Amplituda tymczasowej topografii (rowków) maleje w czasie w temperaturze 30 °C. Po 30 h w 30 °C amplituda zmniejszyła się o ~50% (Rysunek 4, czas 0)16. W ciągu kolejnych 9,5 h ulega ona dalszej redukcji o 10%. Gdy proces regeneracji zostaje zainicjowany poprzez zwiększenie temperatury do 37 °C, amplituda zmniejsza się do 0,5% amplitudy początkowej w ciągu 9,5 h. Dla zastosowanego tłocznika i naprężenia tłoczenia wynoszącego 4,9 MPa odpowiada to funkcjonalnej zmianie z rowków o głębokości 13 μm do powierzchni niemal płaskiej.
Przykładem zachowania komórek kontrolowanego za pomocą aktywnych podłoży do hodowli komórkowych jest zmiana organizacji cytoszkieletu. Na tymczasowych podłożach rowkowanych, przed wywołaniem regeneracji, mikrofilamenty aktynowe ustawiają się wzdłuż kierunku rowków (Rycina 5a)16. Po regeneracji wywołanej wzrostem temperatury mikrofilamenty ulegają reorganizacji i są zorientowane w sposób losowy. Próbki kontrolne posiadające statyczne rowki lub statyczną płaską powierzchnię nie ulegają reorganizacji po podwyższeniu temperatury (Rycina 5b,c).
<img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig1.jpg" alt="Schemat układu optycznego; warstwy szkła, teflonu i aluminium, klej NOA63. Wykorzystywany w badaniach fotonicznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1: Schemat komory utwardzania NOA63. Widok w przekroju (lewo) oraz widok z góry bez szklanej osłony (prawo).
<img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig2.jpg" alt="Schemat próbki do próby rozciągania; wymiary opisane dla analizy równowagi statycznej; jednostki w mm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2: Geometria w kształcie hantla stosowana do charakterystyki objętościowej pamięci kształtu. W: szerokość wąskiej sekcji, L: długość wąskiej sekcji, G: długość pomiarowa, WO: szerokość całkowita, LO: długość całkowita, D: odległość między uchwytami, R: promień zaokrąglenia i RO: promień zewnętrzny.
<img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig3.jpg" alt="Wykres naprężenie-odkształcenie-temperatura; zachowanie mechaniczne; przemiana fazowa; wykres 3D; nauka o materiałach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3: Zbiorowy jednokierunkowy efekt pamięci kształtu pojedynczego utwardzenia NOA63, powtórzony 3 razy (gwiazdka oznacza początek eksperymentu). W punkcie oznaczonym gwiazdką polimer został podgrzany, a następnie odkształcony poprzez przyłożenie naprężenia w celu zdefiniowania jego kształtu tymczasowego. Odkształcenie to utrzymywano na stałym poziomie, a temperaturę obniżono, aby utrwalić kształt tymczasowy poniżej Tg polimeru. Następnie zwiększono temperaturę, a materiał powrócił do swojego kształtu trwałego wraz ze zmniejszaniem się odkształcenia tymczasowego.
<img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig4.jpg" alt="Wykres aktywacji pamięci kształtu, amplituda względna w funkcji czasu (h), dane eksperymentalne, analiza wykresu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4: Przywrócenie kształtu SMP może zostać wywołane w temperaturach kompatybilnych z hodowlą komórkową. Amplituda wynosząca 25,6 ± 0,8 μm obecna po tłoczeniu powróciła do poziomu 12,6 ± 1,5 μm po 30 h równoważenia w 30 °C (czas 0, czarne kółka). Po przeniesieniu próbek do inkubatora w 37 °C (9,5 h), amplituda powróciła do 1,1 ± 0,2 μm w ciągu 3,5 h. Amplituda powróciła do ~0,3 ± 0,1 μm w ciągu 9,5 h i nie zaobserwowano wykrywalnego spadku w ciągu ostatnich 9,5 h (czerwone trójkąty). Słupki błędów reprezentują jedno odchylenie standardowe (n = 4-6). Krzywe przedstawiają skany profilometrii stykowej reprezentatywnych próbek.
<img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig5.jpg" alt="Schemat przejścia morfologii komórek, mikroskopia fluorescencyjna, kontrola żłobkowana vs płaska, skala 1200μm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> Rysunek 5: Przebudowa cytoszkieletu aktynowego komórek po przejściu topograficznym. a, Obrazy konfokalne komórek barwionych falloidyną na podłożach tłoczonych wykazują mikrofilamenty wyrównane zgodnie z kierunkiem żłobkowania (biała strzałka) przed przejściem i wzrostem temperatury. Po przejściu mikrofilamenty uległy przebudowie i są zorientowane losowo. b, Komórki na płaskich podłożach kontrolnych wykazują losowo zorientowane mikrofilamenty przed i po wzroście temperatury. c, Komórki na żłobkowanych podłożach kontrolnych wykazują mikrofilamenty wyrównane zgodnie z kierunkiem żłobkowania przed i po wzroście temperatury. Pasek skali wynosi 100 μm. Oznaczenia są zgodne z Rysunkiem 4.

<ol><li>Liu, C., Qin, H., Mather, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+progress+in+shape-memory+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Review of progress in shape-memory polymers.</a> J. Mater. Chem. 17, 1543-1543 (2007).</li>
<li>Mather, P. T., Luo, X. F., Rousseau, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+Memory+Polymer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Shape Memory Polymer Research.</a> Annu. Rev. Mater. Res. 39, 445-445 (2009).</li>
<li>Lendlein, A., Kelch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+Memory+Polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Edit%22%5BJournal%5D)">Shape Memory Polymers.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 41, 2034-2034 (2002).</li>
<li>Ratna, D., Karger-Kocsis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+shape+memory+polymers+and+composites%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci%22%5BJournal%5D)">Recent advances in shape memory polymers and composites: a review.</a> J. Mater. Sci. 43, 254-254 (2008).</li>
<li>Rousseau, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+shape+memory+polymers%3A+A+review+of+the+progress+toward+overcoming+SMP%27s+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Polym.+Eng.+Sci%22%5BJournal%5D)">Challenges of shape memory polymers: A review of the progress toward overcoming SMP's limitations.</a> Polym. Eng. Sci. 48, 2075-2075 (2008).</li>
<li>Pelham, R. J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13661-13661 (1997).</li>
<li>Addae-Mensah, K. A., Kassebaum, N. J., Bowers, M. J., Reiserer, R. S., Rosenthal, S. J., Moore, P. E., Wikswo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flexible%2C+quantum+dot-labeled+cantilever+post+array+for+studying+cellular+microforces%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor+Actuat.+a-Phys%22%5BJournal%5D)">A flexible, quantum dot-labeled cantilever post array for studying cellular microforces.</a> Sensor Actuat. a-Phys. 136, 385-385 (2007).</li>
<li>du Roure, O., Saez, A., Buguin, A., Austin, R. H., Chavrier, P., Siberzan, P., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+mapping+in+epithelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Force mapping in epithelial cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2390-2390 (2005).</li>
<li>Lam, T., Clem, W. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+on-demand+cell+alignment+using+reconfigurable+microtopography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Reversible on-demand cell alignment using reconfigurable microtopography.</a> Biomaterials. 29, 1705-1705 (2008).</li>
<li>Stevens, M. M., George, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+and+engineering+the+cell+surface+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Exploring and engineering the cell surface interface.</a> Science. 310, 1135-1135 (2005).</li>
<li>Tan, L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles%3A+an+approach+to+isolate+mechanical%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical.</a> 100, 1484-1484 (2003).</li>
<li>Teixeira, A. I., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+human+keratocytes+to+micro-+and+nanostructured+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Responses of human keratocytes to micro- and nanostructured substrates.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 71A, 369-369 (2004).</li>
<li>Yang, M., Sniadecki, N., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+Considerations+of+Micro-+to+Nanoscale+Elastomeric+Post+Arrays+to+Study+Cellular+Traction+Forces%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Geometric Considerations of Micro- to Nanoscale Elastomeric Post Arrays to Study Cellular Traction Forces.</a> Adv. Mater. 19, 3119-3119 (2007).</li>
<li>Zhao, Y., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Mechanics+Study+in+Cardiac+Myocytes+Using+PDMS+Pillars+Array%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor+Actuat.+a-Phys%22%5BJournal%5D)">Cellular Mechanics Study in Cardiac Myocytes Using PDMS Pillars Array.</a> Sensor Actuat. a-Phys. 125, 398-398 (2006).</li>
<li>DiOrio, A. M., Luo, X., Lee, K. M., Mather, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functionally+Graded+Shape+Memory+Polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">A Functionally Graded Shape Memory Polymer.</a> Soft Matter. 7, 68-68 (2011).</li>
<li>Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+behavior+on+shape+memory+polymer+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates.</a> Biomaterials. 32, 2285-2285 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Temperaturę Tg NOA63 można łatwo kontrolować poprzez temperaturę utwardzania. Wykorzystaliśmy to do wytworzenia podłoży SMP, które mogą być aktywowane w zakresie temperatur kompatybilnym z komórkami. NOA63 ulega plastyfikacji przez wodę, co obniża suchą Tg, dlatego zwiększyliśmy suchą Tg, utwardzając materiał w 125 °C, aby przesunąć zakres mokrej Tg pomiędzy 30 a 37 °C.
Zaprezentowane aktywne podłoża do hodowli komórkowej umożliwiają kontrolowanie zachowania ko...

<table><tbody><tr><td>NOA63</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA63</td><td>Numer partii 111</td></tr><tr><td>Wykrojnik do próbek typu „dogbone”</td><td>TestResource, Inc. Shakopee, MN</td><td></td><td>Zmniejszony próbnik typu IV w kształcie hantla (ASTM D638-03)</td></tr><tr><td>Laboratoryjna prasa hydrauliczna</td><td>Carver</td><td>3851</td><td></td></tr><tr><td>embrionalne fibroblasty mysie C3H10T1/2</td><td>ATCC</td><td>CCL-226</td><td></td></tr><tr><td>Komiczna szafa z laminarnym przepływem powietrza (BSC)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>1357</td><td></td></tr><tr><td>Lampa UV</td><td>Spectroline</td><td>SB-100PC</td><td></td></tr><tr><td>Dynamiczny analizator mechaniczny (DMA)</td><td>TA Instruments</td><td>Q800</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica DMI 4000B</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny skaningowy mikroskop laserowy</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM 710</td><td>obiektyw 20x/0,8 NA (powietrzny) lub 40x/1,30 NA (olejowy)</td></tr></tbody></table>

polimery z pamięcią kształtu do aktywnej hodowli komórek

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Polimery z pamięcią kształtu (SMP) to klasa „inteligentnych” materiałów, które posiadają zdolność zmiany z ustalonego, tymczasowego kształtu do wcześniej zdefiniowanego kształtu trwałego pod wpływem bodźca, takiego jak ciepło1-5. W typowym cyklu pamięci kształtu polimer SMP jest najpierw deformowany w podwyższonej temperaturze, która jest wyższa od jego temperatury przejścia, Ttrans [będącej albo temperaturą topnienia (Tm), albo temperaturą przejścia szklistego (Tg)]. Deformacja ta ma charakter sprężysty i prowadzi głównie do zmniejszenia entropii konformacyjnej łańcuchów sieci tworzących materiał (zgodnie z teorią sprężystości gumowej). Następnie zdeformowany SMP jest schładzany do temperatury poniżej Ttrans przy zachowaniu stałego zewnętrznego odkształcenia lub naprężenia. Podczas chłodzenia materiał przechodzi w stan bardziej sztywny (półkrystaliczny lub szklisty), co kinetycznie więzi lub „zamraża” materiał w tym niskoentropowym stanie, prowadząc do makroskopowego utrwalenia kształtu. Odzyskiwanie kształtu jest inicjowane przez ciągłe ogrzewanie materiału powyżej Ttrans w warunkach bezstresowych (bez ograniczeń). Pozwalając łańcuchom sieci (które odzyskały ruchliwość) na relaksację do ich termodynamicznie preferowanego stanu maksymalnej entropii, materiał zmienia kształt tymczasowy na kształt trwały.
Komórki są zdolne do badania właściwości mechanicznych otaczającego je środowiska6. Mechanizmy, poprzez które oddziaływania mechaniczne między komórkami a ich fizycznym otoczeniem kontrolują zachowanie komórek, stanowią obszar intensywnych badań. Podłoża o zdefiniowanej topografii stały się potężnymi narzędziami w badaniu tych mechanizmów. Wykazano, że wzory topografii podłoża w skali mezo, mikro i nano kierują orientacją komórek, ich adhezją oraz siłami trakcyjnymi7-14. Wyniki te podkreśliły potencjał topografii podłoża w kontrolowaniu i analizowaniu oddziaływań mechanicznych między komórkami a ich fizycznym środowiskiem podczas hodowli komórkowej, jednak podłoża stosowane do tej pory były zazwyczaj pasywne i nie można było ich zaprogramować tak, aby uległy znacznym zmianom w trakcie hodowli. Ta fizyczna statyczność ograniczała potencjał podłoży topograficznych w kontrolowaniu komórek w hodowli.
W niniejszym opracowaniu przedstawiono podłoża SMP do aktywnej hodowli komórek (ACC), które wykorzystują powierzchniową pamięć kształtu w celu zaprogramowanej kontroli topografii i odkształcenia podłoża. Podłoża te wykazują zdolność do przejścia z tymczasowej topografii rowkowanej do drugiej, zapamiętanej topografii, która jest niemal płaska. Zmiana ta może być wykorzystana do kontrolowania zachowania komórek w standardowych warunkach hodowli komórkowej.

Opisano metodę opracowania podłoży do hodowli komórkowych z możliwością zmiany topografii w trakcie hodowli. Metoda ta wykorzystuje inteligentne materiały znane jako polimery z pamięcią kształtu, które mają zdolność zapamiętywania kształtu trwałego. Koncepcja ta jest możliwa do zastosowania w szerokim zakresie materiałów i aplikacji.

Polimery z pamięcią kształtu do aktywnej hodowli komórek

Polimery z pamięcią kształtu (SMP) to klasa „inteligentnych” materiałów, które mają zdolność zmiany z ustalonego, tymczasowego kształtu w predefiniowany kształt trwały...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest hodowla komórek na podłożu o topografii zmieniającej się w czasie. Osiąga się to poprzez zaprogramowanie polimeru z pamięcią kształtu w trwałą formę, która zostanie zapamiętana. Następnie polimer z pamięcią kształtu programuje się w kształt tymczasowy, na który w późniejszym etapie wysiewa się komórki.Ostatnim krokiem procedury jest wywołanie powrotu polimeru z pamięcią kształtu do jego pierwotnej formy poprzez podniesienie temperatury, co w rezultacie pozwala uzyskać obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej wykazujące zmiany w zachowaniu komórek. Witam, nazywam się Pat Mather. Jestem profesorem inżynierii biomedycznej i chemicznej oraz dyrektorem Instytutu Biomateriałów w Syracuse na Uniwersytecie Syracuse.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z komercyjnymi lub niestandardowymi aparatami do rozciągania komórek jest możliwość zastosowania szerokiej gamy złożonych odkształceń w ramach jednego systemu polimerowego. Nazywam się Jay Henderson. Jestem adiunktem w katedrze Inżynierii Biomedycznej i Chemicznej oraz członkiem Syracuse Biomaterials Institute.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mechanobiologii, takie jak sposób, w jaki komórki reagują na dynamiczne zmiany w ich środowisku fizycznym. Nazywam się Kevin Davis i jestem doktorantem na Uniwersytecie w Syracuse w Katedrze Inżynierii Biomedycznej i Inżynierii Chemicznej. Chociaż metoda ta może dostarczyć wglądu w dwuwymiarową (2D) mechanobiologię, może być również stosowana w innych systemach, takich jak trójwymiarowe (3D) rusztowania zmieniające kształt, wykorzystywane w inżynierii tkankowej.Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować specjalną komorę utwardzania, wykorzystując szkiełko przedmiotowe, teflonowy dystans o grubości 1 mm oraz płytkę aluminiową. Po zabezpieczeniu komory za pomocą małych klipsów biurowych, należy wstrzyknąć NOA 63 do wnętrza komory przez otwór w teflonowym dystansie, używając igły o rozmiarze 18 G. Następnie komorę należy umieścić na płycie grzewczej ustawionej na 125 °C.Po podgrzaniu komory należy odczekać pięć minut, aby osiągnęła ona jednorodną temperaturę. Następnie należy utwardzić NOA 63 przez 20 minut, umieszczając lampę UV w odległości 6,5 centymetrów od powierzchni szkła. Usuń NOA 63 z komory, gdy jest jeszcze ciepły, używając żyletki.Następnie przeprowadź dotwardzanie polimeru z pamięcią kształtu pod światłem UV przez trzy godziny i 40 minut bezpośrednio na płycie grzejnej w temperaturze 125 °C. Aby scharakteryzować pamięć kształtu NOA 63, przygotuj próbkę w kształcie hantla, prasując na gorąco utwardzoną folię za pomocą specjalnie dostosowanego wykrojnika. Na koniec zamocuj próbkę w analizatorze dynamiczno-mechanicznym z uchwytem do rozciągania.Ustaw instrument w trybie sterowania siłą i zaprogramuj procedurę testową zgodnie z protokołem pisemnym dołączonym do tego filmu. Wynikiem procedury jest izotermicznie utwardzony polimer z pamięcią kształtu lub folia SMP. Umieść CSMP na płycie grzejnej i ustaw temperaturę wyższą niż temperatura przejścia szklistego, aby zmniejszyć moduł i ułatwić wycinanie. W celu przygotowania poszczególnych próbek z izotermicznie utwardzonej folii SMP.Wytnij z folii s i p za pomocą żyletki próbkę o pożądanej wielkości. Tymczasowy kształt można utrwalić na kilka różnych sposobów. W tym przypadku użyto laboratoryjnej prasy hydraulicznej z płytami, które mogą być podgrzewane i chłodzone, aby wytłoczyć tymczasową topografię.Najpierw ustaw temperaturę PLA powyżej temperatury tg. Na potrzeby tej demonstracji wytłaczarka została wykonana poprzez utwardzenie żywicy epoksydowej na płycie winylowej, aby uzyskać tymczasowy kształt równoległych rowków. Wytłaczarkę można wykonać z innych materiałów i z inną topografią, jednak musi być ona sztywniejsza niż NOA 63.W temperaturze tłoczenia umieść próbki s i p stroną roboczą do dołu na tłoczniku. Następnie umieść próbki wraz z tłocznikiem w prasie. Zastosuj obciążenie wstępne o wartości około 100 kPa, aby zapewnić kontakt między grzejnymi płytami PLA a próbkami; utrzymaj ten stan przez około pięć minut, aby próbki osiągnęły jednolitą temperaturę.Po osiągnięciu jednorodnej temperatury należy przyłożyć do próbek nacisk od 1 do 6 MPa i utrzymać go przez jedną minutę. SMP ulegnie pęknięciu. W przypadku przyłożenia większego naprężenia.Zastosuj mniejsze naprężenia, aby wprowadzić topografie o mniejszych amplitudach. Po przyłożeniu nacisku obniż temperaturę poniżej TG, korzystając z funkcji chłodzenia wodnego płyt prasy. Gdy temperatura spadnie poniżej tg, zdejmij przyłożoną siłę przed rozpoczęciem eksperymentu z aktywną hodowlą komórkową.Światło UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego służy do sterylizacji próbek. Rozmieść próbki stroną aktywną do dołu w sterylnych szalkach bez przykrywek i włącz lampę UV na sześć godzin. Następnie przełóż próbki do nowych sterylnych szalek, układając je stroną aktywną do góry.Włącz lampę UV na dodatkowe sześć godzin. Próbki muszą zostać doprowadzone do stanu względnej równowagi przed wysianiem komórek. Umieść próbki na płytce 96-dołkowej i dodaj 150 µL pełnego medium wzrostowego.Medium na dołek. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 30 °C z 5% CO2 do momentu uzyskania pożądanej częściowej regeneracji. W tej demonstracji próbki są inkubowane przez 30 godzin, aby uzyskać wystarczająco dużą amplitudę do wyrównania komórek.Po uzyskaniu częściowej regeneracji można przystąpić do wysiewu komórek na próbki. Przenieś próbki do nowej płytki 96-dołkowej. Następnie do każdej z tych próbek dodaj 150 µL zawiesiny komórek, C3 H 10 t i połowę.Większość fibroblastów embrionalnych stosuje się w zagęszczeniu 20 000 komórek na mililitr. Aby uzyskać wyizolowane komórki, należy pozwolić im przytwierdzić się i rozprzestrzenić na tymczasowej topografii poprzez inkubację w temperaturze 30 °C przez 9,5 godziny. Następnie, przed przejściem do kolejnego etapu, należy ocenić morfologię komórek, pobierając próbki, a następnie wykonując ich barwienie i obrazowanie fluorescencyjne.Materiał ten wykazuje autofluorescencję w większości zakresu UV i światła widzialnego, dlatego w celu zmniejszenia tła zaleca się stosowanie fluoroforów z dalekiej czerwieni widma, takich jak Alexa Fluor 647. Aby próbki zregenerowały się, należy przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C i kontynuować hodowlę przez 19 godzin. Pozwala to materiałowi na regenerację, a komórkom na dostosowanie morfologii do nowej topografii. Po inkubacji należy zastosować odpowiednie barwniki, np. falloidynę do obrazowania aktyny filamentowej.W ostatnim kroku można przeprowadzić obrazowanie komórek na nowej topografii; przedstawiony tutaj jest jednokierunkowy efekt pamięci kształtu materiału objętościowego po utwardzeniu pojedynczej warstwy NOA 63. Procedurę powtórzono trzykrotnie, gdzie gwiazdka oznacza początek utwardzania eksperymentalnego. NOA 63 jest przezroczystym, szklistym ciałem stałym o doskonałych właściwościach pamięci kształtu.W tym przypadku materiał został utwardzony i wykazuje jednorodną temperaturę przejścia szklistego (TG) wynoszącą 51.1 °C, wyznaczoną na podstawie początku spadku modułu magazynowania. Widoczny tutaj spadek odkształcenia następuje przy zmierzonej tg. Znaczna część z przyłożonego odkształcenia 4.7% została utrwalona po odciążeniu w temperaturze 20 °C, co odpowiada stopniowi utrwalenia wynoszącemu 89.3%. Utrwalone odkształcenie zostało następnie odzyskane z wydajnością 84.4% w stosunkowo niewielkim zakresie temperatur podczas ogrzewania.Wydajność pamięci kształtu nie wykazała pogorszenia do trzech cykli, co potwierdza fakt, że wszystkie krzywe przebiegały niemal identyczną ścieżką. Amplituda tymczasowej topografii zmniejsza się w czasie w temperaturze 30 °C w ciągu 30 godzin. W temperaturze 30 °C.Amplituda została zredukowana o około 50% w czasie zero, co wskazano tutaj. W ciągu kolejnych 9,5 godziny ulega ona dalszej redukcji o 10%. Po zainicjowaniu regeneracji poprzez zwiększenie temperatury do 37 °C, amplituda spada do 0,5% amplitudy początkowej w ciągu 9,5 godziny dla zastosowanego urządzenia do tłoczenia i naprężenia tłoczenia wynoszącego 4,9 MPa.Odpowiada to zmianie funkcjonalnej z rowków o szerokości 13 µm na powierzchnię niemal płaską. Polimer ten regeneruje się w zakresie temperatur od 30 do 37 °C w warunkach hodowli komórkowej. Jest to spowodowane pobieraniem wody z pożywki hodowlanej; woda plastyfikuje polimer, co obniża tg, umożliwiając regenerację w temperaturach poniżej suchego TG wynoszącego 51 °C.Przykładem zachowania komórek kontrolowanego za pomocą aktywnych podłoży do hodowli komórkowych jest zmiana organizacji cytoszkieletu na tymczasowych podłożach rowkowanych. Przed wywołaniem regeneracji mikrofilamenty aktynowe ustawiają się wzdłuż kierunku rowków. Po regeneracji wywołanej wzrostem temperatury mikrofilamenty ulegają reorganizacji i są zorientowane w sposób losowy.Z kolei próbki kontrolne o powierzchni gładkiej lub ze statycznymi rowkami nie reorganizują się po zwiększeniu temperatury. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że geometrię komory utwardzania, temperaturę przejścia polimeru, metodę utrwalania odkształcenia oraz skład samego polimeru można dostosować, aby uzyskać pożądane przejście w ramach własnego eksperymentu z zastosowaniem tej procedury. Do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak zmiany w ekspresji genów w odpowiedzi na stymulację mechaniczną z podłoża po jego opracowaniu, można wykorzystać inne metody, np. real-time PCR.Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny mechanobiologii komórki do badania cytoszkieletu komórkowego, jego reorganizacji oraz fizyki materii miękkiej w dwóch wymiarach. Dziękujemy za zainteresowanie naszą pracą i za obejrzenie materiału.

shape-memory-polymers-for-active-cell-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Polimery o pamięci kształtu do aktywnej kultury komórkowej

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Ten manuskrypt przedstawia technikę wywierania lub uwalniania sił na przylegające komórki lub tkanki za pomocą jednokierunkowego rozciągania.

Rozciąganie komórek z mikrowzorem na błonie PDMS

Prezentujemy w tym artykule nowatorską platformę rozciągającą, która może być wykorzystana do badania reakcji pojedynczych komórek na złożone anizotropowe dwuosiowe deformacje mechaniczne i ilościowego określania właściwości mechanicznych tkanek biologicznych.

Nowatorska platforma do rozciągania do zastosowań w mechanobiologii komórek i tkanek

Tutaj opisana jest metoda, która umożliwia szybkie, efektywne i niedrogie przygotowanie żeli poliakrylamidowych w formacie wielodołkowej płytki. Metoda nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być z łatwością zaadoptowana przez każde laboratorium badawcze. Byłoby to szczególnie przydatne w badaniach skoncentrowanych na zrozumieniu odpowiedzi komórek zależnych od sztywności.

Prosty test sztywności wielodołkowej na bazie poliakrylamidu do badania odpowiedzi komórek zależnych od sztywności

Interesujące są rusztowania zdolne do dopasowania się do ubytków kostnych czaszkowo-szczękowo-twarzowych (CMF), wykazując jednocześnie osteoprzewodnictwo i bioaktywność. Protokół ten opisuje przygotowanie rusztowania z pamięcią kształtu na bazie dikrylanu polikaprolaktonu (PCL-DA) przy użyciu metody odlewania rozpuszczalnikiem i ługowania cząstek stałych (SCPL) z wykorzystaniem stopionej matrycy solnej i nałożeniu bioaktywnej powłoki polidopaminowej .

Produkcja bioaktywnego, opartego na PCL "samodopasowanego" rusztowania polimerowego z pamięcią kształtu

Rusztowania dla inżynierii tkankowej muszą podsumować złożone biochemiczne i biofizyczne mikrośrodowisko niszy komórkowej. W tym miejscu pokazujemy zastosowanie międzyfazowych włókien kompleksowania polielektrolitów jako platformy do tworzenia kompozytowych, wieloskładnikowych rusztowań polimerowych o przedłużonym uwalnianiu biochemicznym.

Rusztowania kompozytowe z międzyfazowych włókien polielektrolitowych do czasowo kontrolowanego uwalniania biomolekuł

Demonstrujemy przygotowanie elastomerów ciekłokrystalicznych (LCE) na bazie siloksanów i epoksydów oraz nanokompozytów LCE. LCE są charakteryzowane pod względem odkształcenia odwracalnego, uporządkowania ciekłokrystalicznego i sztywności. Jako potencjalne zastosowanie demonstrujemy ich zastosowanie jako substratów reagujących na kształt w niestandardowym urządzeniu do aktywnej hodowli komórek.

Otrzymywanie monodomenowych elastomerów ciekłokrystalicznych i nanokompozytów elastomerów ciekłokrystalicznych

To badanie przedstawia metodologię przygotowania 3D, biodegradowalnych, pianopodobnych rusztowań komórkowych opartych na biokompatybilnych elastomerach ciekłokrystalicznych o łańcuchu bocznym (LCE). Eksperymenty z mikroskopią konfokalną pokazują, że podobne do piany LCE pozwalają na przyłączanie komórek, proliferację i spontaniczne ustawianie mioblastów C2C12.

Synteza biokompatybilnych pianek elastomerowych ciekłokrystalicznych jako rusztowań komórkowych do przestrzennych hodowli komórkowych 3D

Przedstawiono protokół procesu produkcji polimerowych cienkowarstwowych struktur kompozytowych o różnych modułach lub grubościach Younga. Folie są produkowane do zaawansowanych badań nad kulturami komórkowymi lub jako kleje do skóry.

Cienkowarstwowe kompozytowe elastomery krzemowe do hodowli komórkowych i zastosowań skórnych: produkcja i charakterystyka

Ta metodologia ma na celu zilustrowanie mechanizmów, za pomocą których sygnały macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak sztywność substratu, skład białka i morfologia komórki, regulują fenotyp komórek Schwanna (SC).

Przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej w celu oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna

Poznaj metodę aktywnej hodowli komórkowej z wykorzystaniem polimerów z pamięcią kształtu do dynamicznej zmiany topografii podłoża. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi komórek na zmiany mechaniczne w środowisku.

Polimery z pamięcią kształtu do aktywnej hodowli komórek

Przeglądaj więcej filmów