Name: Tanie wytwarzanie etapów mikroskopii krioświetlnej do skorelowanej mikroskopii świetlnej / elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj metodę budowy taniego kriogenicznego stolika do mikroskopii świetlnej i elektronowej. Technika umożliwia skorelowane obrazowanie próbek biologicznych przy niskich temperaturach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Brandonowi J. Zippowi oraz Kenowi B. Kaplanowi za udostępnienie szczepu drożdży wykorzystanego w niniejszym badaniu. Autorzy dziękują również Julio Leninowi Dominguez-Ramirezi za pomoc w nagrywaniu wideo. J.E.E. potwierdza wsparcie finansowe z NIH w ramach grantu nr 5RC1GM91755.

1. Wykonanie i montaż
 <ol>
	<li>Umieść aluminiowy radiator wewnątrz formy do tarty o średnicy 22,96 cm (9"), w odległości około 2 cm od krawędzi formy, jak pokazano na rysunku 1c. Za pomocą czarnego pisaka zaznacz miejsca otworów dla radiatora aluminiowego. Uwaga: Jeśli blok aluminiowy (zakupiony w lokalnym sklepie z metalowymi odpadami lub online pod adresem <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a>) nie posiada fabrycznych otworów, należy je wywiercić i wykonać w nich pogłębiacze przed przystąpieniem do kroku 1, aby przymocować blok aluminiowy do formy do tarty. Użyliśmy 5 otworów do przymocowania bloku do platformy oraz 4 dodatkowych otworów, aby umożliwić ucieczkę pęcherzyków gazowego azotu spod aluminium.</li>
	<li>Umieść pudełko na siatki kriogeniczne w pobliżu miejsca, w którym znajdzie się radiator aluminiowy, i zaznacz wycięcie oraz każdą z jego stron.</li>
	<li>Wywierć otwory prowadzące w każdym zaznaczonym miejscu, używając wiertła #17 dla otworów radiatora aluminiowego oraz wiertła #35 dla otworów pudełka na siatki kriogeniczne.</li>
	<li>Zamontuj radiator aluminiowy, używając 5 śrub z łbem walcowym z nacięciem płaskim #10 o długości 1,9 cm (3/4") z odpowiednimi nakrętkami oraz 15 podkładek #10. Pod blokiem aluminiowym i z drugiej strony formy do tarty umieść po dwie podkładki na każdy otwór. Uwaga: Niezamocowane wystające części bloku aluminiowego w pobliżu obszaru obserwacji mogą powodować wibracje, które ograniczają możliwości obrazowania stolika. Upewnij się, że wszystkie śruby montażowe są mocno dokręcone.</li>
	<li>Wprowadź od tylnej strony formy do tarty 3 okrągłe śruby z nacięciem płaskim #4 o długości 0,95 cm (3/8") z odpowiednimi nakrętkami, które będą służyć jako mocowanie pudełka na siatki kriogeniczne.</li>
	<li>Zlep taśmą 4 pałeczki w pary, kładąc jedną na drugiej. Przymocuj każdą parę taśmą do przeciwległych krawędzi formy do ciasta, aby służyły jako dystanse.</li>
	<li>Zmocz odpowiednio górną powierzchnię formy do ciasta i dolną powierzchnię formy do tarty wodą ddH2O.</li>
	<li>Wypełnij formę do ciasta dwiema warstwami izolacyjnej pianki w sprayu, zwilżając każdą warstwę przed przejściem do następnego kroku.</li>
	<li>Wciśnij formę do tarty w piankę.</li>
	<li>Odwróć formy do góry dnem i naciskaj formę do ciasta, aż dystanse dotkną formy do tarty. Umieść dowolny ciężki przedmiot na górze formy do ciasta i pozostaw do utwardzenia na noc.</li>
	<li>Za pomocą noża z ząbkami odetnij nadmiar wyschniętej pianki izolacyjnej z krawędzi form i usuń pałeczki.</li>
	<li>Wyjmij formę do ciasta z formy do tarty. Forma do tarty z radiatorem aluminiowym jest teraz zaizolowana i będzie określana jako „stolik kriogeniczny” (Rys. 1a).</li>
	<li>Połóż przezroczysty plastikowy podkładnik (w dowolnym kolorze i o grubości powyżej 3 mm) na górze stolika kriogenicznego. Zaznacz czarnym pisakiem miejsce mocowania pudełka na siatki kriogeniczne, rysując okrąg o średnicy około 1,5 raza większej niż średnica pojedynczego okrągłego pudełka na siatki kriogeniczne. Wytnij otwór za pomocą otwornicy 1,9 cm (3/4"). Ten podkładnik będzie określany jako „ekran załadowczy” (Rys. 1b).</li>
	<li>Połóż nowy przezroczysty podkładnik na stoliku kriogenicznym i umieść go na mikroskopie tak, aby radiator znajdował się bezpośrednio pod obiektywami. Za pomocą czarnego pisaka zaznacz ścieżkę obiektywów podczas ich obrotu.</li>
	<li>Wytnij wzdłuż zaznaczonej linii, usuwając półkole z krawędzi podkładnika. Można to zrobić za pomocą wyrzynarki lub wielokrotnie używając otwornicy 7,62 cm (3"), jak pokazano na filmie.</li>
	<li>Na koniec wytnij otwór o średnicy 1,9 cm (3/4") w pewnej odległości od półkola, ale wciąż w obrębie naczynia. Będzie on służył jako port do uzupełniania ciekłego azotu (lN2), jeśli jego poziom spadnie podczas obrazowania. Ten podkładnik będzie określany jako „ekran obserwacyjny” (Rys. 1c).</li>
</ol>

2. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Rozcieńczyć komórki drożdży w fazie logarytmicznej hodowane w syntetycznym medium kompletnym (SC) do odpowiedniego stężenia 1x106 komórek/mL w wodzie.</li>
	<li>2 mL rozcieńczonych drożdży nanieść pipetą na miedzianą siatkę do krio-EM R2/1 400 mesh pokrytą dziurawym węglem (SPI Supplies, West Chester, PA) i pozostawić do adsorpcji przez 15 sekund.</li>
	<li>Usunąć nadmiar cieczy z powierzchni siatki, dotykając jej tyłu potarganym kawałkiem miękkiej chusteczki celulozowej (Kimwipe) przez 2 sekundy.</li>
	<li>W razie potrzeby siatkę można przemyć kroplami wody o objętości 3 μL (1-3 razy), a następnie osuszyć w sposób opisany w kroku 3, poprzez odsączanie od tyłu.</li>
	<li>Przed ostatnim przemyciem próbkę umieszcza się w pneumatycznym mroźniku zanurzeniowym, a zawieszoną siatkę przemywa zgodnie z opisem w punkcie 2.4. Po odsączeniu siatki potarganą chusteczką papierową (Kimwipe) w celu usunięcia większości wody z powierzchni, siatkę zanurza się w etanie w stanie ciekłym chłodzonym lN2 i przenosi do pudełka na kriosiatki w celu przechowywania 1. Uwaga: ważne jest, aby pozostawić na powierzchni warstwę cieczy tak cienką, jak to możliwe, aby utrzymać nawilżenie próbki. Nieprawidłowe odsączanie doprowadzi albo do wyschnięcia próbki, albo do powstania lodu nieprzezroczystego dla wiązki elektronów.</li>
</ol>

3. Kriomikroskopia świetlna
<ol>
	<li>Napełnić stopień kriogeniczny ciekłym azotem (lN2)2 następnie szybko przykryć ekranem do załadunku (plastikowy schowek z jednym otworem o średnicy 1,9 cm (3/4")).</li>
	<li>Gdy metal osiągnie lN2 temperaturze, przenieś pudełko z siatkami kriogenicznymi przez otwór o średnicy 1,9 cm (3/4") w ekranie załadunkowym do uchwytu transferowego utworzonego przez 3 śruby opisane w części A5. Odkręć pudełko z siatkami kriogenicznymi od jego wspornika i usuń wspornik, aby ułatwić dostęp. Przechowuj wspornik pudełka z siatkami kriogenicznymi pod lN2 w oddzielnym naczyniu Dewara
do kroku 3.10. Pudełko z siatkami kriogenicznymi powinno być również przechowywane w lN22 aby zapobiec nagrzewaniu się siatki z próbką.</li>
	<li>Uzupełnij lN2 w etapie kriogenicznym do poziomu tuż poniżej górnej krawędzi aluminiowego radiatora. Uwaga: lN2 poziomy muszą być okresowo sprawdzane i uzupełniane podczas procesu obrazowania, aby zapewnić lN2 znajduje się w ciągłym kontakcie z radiatorem. Co do zasady uzupełnianie odbywa się co 10 minut przez otwór wlewowy w ekranie obserwacyjnym.</li>
	<li>Wstępnie schłodź końcówkę pęsety w ciekłym azocie (lN2)2następnie za pomocą pęsety przenieś siatkę (siatki) na płaską powierzchnię obserwacyjną aluminiowego radiatora, korzystając z otworu o średnicy 1,9 cm (3/4") w ekranie załadowczym.</li>
	<li>Ostrożnie przesuń stolik kriogeniczny pod apertury obiektywów mikroskopu światła odbitego.</li>
	<li>Umieść przezroczysty ekran do obserwacji na ekranie do załadunku. Następnie powoli usuń ekran do załadunku, wysuwając go spod ekranu do obserwacji. 
	Uwaga: W tym momencie próbka jest najbardziej narażona na uszkodzenia. Należy zminimalizować wszelkie ruchy powietrza wokół mikroskopu, w tym: oddech, otwieranie pobliskich drzwi, przechodzenie osób obok itp. Jako środek ostrożności zalecamy noszenie maseczki ochronnej lub zawieszenie przezroczystej osłony twarzy poniżej okularów mikroskopu.</li>
	<li>Przesunąć obiektywy do środowiska zimnego gazu azotowego wewnątrz kriostatycznego stolika i wyszukać próbkę na płaskim obszarze obserwacyjnym radiatora. Korzystając ze standardowych technik mikroskopii świetlnej w polu jasnym, ustawić ostrość na siatce przy użyciu obiektywu o niskim powiększeniu, aby zlokalizować centrum i wykonać zdjęcie ogólne. Specyfikacje obiektywów do mikroskopii świetlnej użytych w tym doświadczeniu są wymienione w sekcji Materiały doświadczalne. Uwaga: lN2 nie styka się z obiektywami, a do tej pory nie zaobserwowano degradacji obrazu ani uszkodzeń soczewek w wyniku chłodzenia.</li>
	<li>Skup się przy dużym powiększeniu na obszarze zainteresowania i uzyskaj dane za pomocą obrazowania w polu jasnym, polu ciemnym, świetle spolaryzowanym lub fluorescencyjnym. Pamiętaj o zapisaniu lokalizacji obszaru zainteresowania na obrazie w polu jasnym przy małym powiększeniu w celu późniejszej korelacji. Jeśli wszystkie wymienione powyżej środki ostrożności dotyczące ponownego napełniania lN2 zostaną zachowane,
	wówczas dodatnie ciśnienie powstające w wyniku odparowywania azotu będzie wystarczające do utrzymania środowiska wolnego od zanieczyszczeń (niezależnie od wilgotności pomieszczenia) przez cały czas trwania
	obrazowania.</li>
	<li>Po zakończeniu zastąp ekran podglądu, nasuwając na niego ekran ładowania. Usuń ekran podglądu, powoli przesuwając go pod ekran ładowania.</li>
	<li>Zdejmij stolik kriogeniczny z mikroskopu i za pomocą schłodzonych wcześniej pęset przenieś siatkę z powrotem do pudełka na siatki kriogeniczne. Wkręć uchwyt pudełka na siatki kriogeniczne w pudełko, aby uszczelnić je przed wpływem środowiska zewnętrznego, a następnie przenieś uchwyt do naczynia Dewar z ciekłym azotem (lN2) w celu przechowywania i przyszłego obrazowania.</li>
</ol>

4. Kriomikroskopia elektronowa
<ol>
	<li>Zgodnie ze standardowymi i ustalonymi technikami, załaduj siatkę z próbką do uchwytu transferowego cryo-EM, utrzymując preparat przez cały czas w temperaturze ciekłego azotu.</li>
	<li>Wprowadź uchwyt cryo z siatką z próbką do transmisyjnego mikroskopu elektronowego.</li>
	<li>Przy odpowiednim niskim powiększeniu (nominalne powiększenie 50-500x), zlokalizuj środek siatki z próbką.</li>
	<li>Wykorzystaj wcześniej zebrane dane cryo-LM przy niskim powiększeniu z kroku 3.7, aby określić względną orientację centralnych miedzianych wypustek siatki (opisanych na Ryc. 2) i zidentyfikować dokładne obszary zainteresowania do korelacji.</li>
	<li>Przejdź do ustawiania mikroskopu, obrazowania cryo-EM z niską dawką oraz zbierania danych.</li>
</ol>

5. Reprezentatywne wyniki
Stołyk kriogeniczny (Rys. 1a) jest skutecznym sposobem gromadzenia danych cryo-LM dla krio-mikroskopii fluorescencyjnej oraz korelacyjnej analizy cryo-LM/cryo-EM. Rysunek 2 pokazuje, w jaki sposób połączenie obrazów cryo-LM o niskim i wysokim powiększeniu pozwala na stworzenie map referencyjnych, które kierują do konkretnych obszarów w cryo-EM. Powstała mapa referencyjna cryo-LM (Rys. 2b) została wykorzystana podczas akwizycji danych cryo-EM w celu zlokalizowania dokładnych regionów przedstawionych na Rysunku 3.
<img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="Układy równowagi statycznej na platformach; obraz serii eksperymentów z badań mechanicznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Stołyk kriogeniczny. a) Układ stopnia kriogenicznego składa się z uchwytu transferowego do kasetek z siatkami kriogenicznymi, wskazanego białą strzałką, oraz aluminiowego radiatora. Siatki są przenoszone w ciekłym azocie (lN2).2 z pudełka z siatkami kriogenicznymi i umieszczono bezpośrednio w obszarze obserwacyjnym radiatora, zgodnie ze wskazaniem czarnej strzałki. b) Rycina przedstawiająca stolik kriogeniczny z ekranem załadowczym. Otwór w ekranie załadowczym znajduje się bezpośrednio nad uchwytem pudełka na siatki kriogeniczne i służy jako port do przenoszenia próbek oraz przemieszczania ich pęsetą z pudełka na siatki kriogeniczne do obszaru obserwacji próbek na radiatorze. c) Stolik kriogeniczny w pozycji pod obiektywami z zamontowanym ekranem obserwacyjnym. Specjalny wycięcie w ekranie obserwacyjnym umożliwia łatwe obrócenie obiektywów do odpowiedniej pozycji bez konieczności przesuwania stolika kriogenicznego. Otwór w ekranie obserwacyjnym, oddalony od obszaru próbki, pełni funkcję lN2 port napełniający do uzupełniania LN22 poziomy, jeśli to konieczne.
<img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="Analiza mikroskopowa siatki materiału przedstawiająca wzbudzenie optyczne i pomiar fluorescencji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Nawigacja w kryo-LM w badaniach korelacyjnych. a) Obraz komórek drożdży przytwierdzonych do siatki próbki w kryo-LM przy niskim powiększeniu. b) Ten sam obraz co w (a), na który nałożono obraz fluorescencyjny obszaru zainteresowania przy dużym powiększeniu, z wypełnionym pomarańczowym wielokątem oznaczającym centrum siatki próbki. Centrum składa się z grupy czterech kwadratów, z czego trzy posiadają dodatkową metalową zakładkę, a czwarty jest otwarty. W przypadku trzech kwadratów z dodatkową metalową zakładką, dwie pary współdzielą zakładkę wzdłuż osi długiej i krótkiej, tworząc asymetryczne centrum. To asymetryczne centrum jest widoczne w lewym górnym rogu i zostało wykorzystane do określenia kąta obrotu oraz orientacji siatki pomiędzy kryo-LM a kryo-EM. Na podstawie jednego obrazu przy niskim powiększeniu można zaznaczyć wiele obszarów zainteresowania i wykorzystać je jako mapę referencyjną do zlokalizowania identycznych obszarów w kryo-EM. c) Powiększony obraz fluorescencyjny w kryo-LM obszaru zainteresowania z (b). HTA1-CFP, marker histonowy CFP na końcu C, jest widoczny jako zielona struktura punktowa oznaczająca lokalizację jądra. d) Obraz kryo-EM odpowiadającego obszaru z (c). Paski skali reprezentują 50 microns.
<img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="Analiza mikroskopowa; mikrofotografie fluorescencyjne i elektronowe; struktury komórkowe; obrazowanie fluorescencyjne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Korelacja kryo-LM i kryo-EM. Dwa pola widzenia przedstawiające identyczne komórki drożdży skorelowane z kryo-polem jasnym (a,d), 
kryo-fluorescencją (b,e) oraz kryo-EM (c,f). Paski skali reprezentują 5 microns.

<ol><li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li>
<li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%3A+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li>
<li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li>
<li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li>
<li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy%3A+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li>
<li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li>
<li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li>
<li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li>
</ol>

Autorzy declare, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

Dzięki zastosowaniu naszego stolika kriogenicznego oraz technik przygotowania próbek, badania korelacyjne pomiędzy cryo-LM a cryo-EM wykazują szereg zalet w porównaniu do tradycyjnych metod prowadzonych w temperaturze pokojowej, w tym między innymi: szybką fiksację1,2, zredukowany fotobleaching3 oraz możliwość oceny integralności próbki przed badaniem cryo-EM4,5 lub fiksacją chemiczną i zatopieniem6. Jednym z wąskich gardeł podczas zbierania danych w cryo-EM jest czas wymagany zarówno na przeniesienie próbki do TEM, jak i skanowanie siatki w celu znalezienia odpowiednich obszarów do obrazowania. Dzięki szybkiej akwizycji danych w cryo-LM5 czas poświęcony na poszukiwanie odpowiednich komórek może zostać znacznie skrócony. W ten sposób, poprzez wstępne skanowanie i mapowanie obszarów zainteresowania w cryo-LM, możemy zaoszczędzić czas i fundusze oraz wyeliminować to ograniczenie.
Bardziej kosztowne lub złożone stopnie kriogeniczne mogą umożliwić obrazowanie cryo-LM o wyższej rozdzielczości. Jednak stopień wykonany w niniejszej pracy jest w pełni wystarczający dla wielu zastosowań. Jeśli obrazowanie cryo-LM i przenoszenie siatek z próbkami będą przeprowadzane z ostrożnością, zgodnie z opisem w tekście i filmie, można uzyskać obrazy całkowicie wolne od zanieczyszczeń. Metoda ta pozwala na bezpośrednią korelację danych z mikroskopii fluorescencyjnej i elektronowej dla tej samej komórki, organelli lub kompleksu makromolekularnego rozproszonego na podłożu węglowym lub zawartego w cienkim przekroju tkankowym7. Należy zauważyć, że wartość tego stopnia kriogenicznego wykracza poza korelacyjne badania cryo-LM/cryo-EM i obejmuje dziedzinę mikroskopii świetlnej jako całości. Stopień kriogeniczny ten jest odpowiedni zarówno dla delikatnych próbek, jak i barwników fluoroforowych8, kropek kwantowych lub białek znakowanych fluorescencyjnie9, które mogą być niestabilne podczas chemicznej fiksacji i zatapiania w temperaturze pokojowej z użyciem glutaraldehydu i paraformaldehydu. W związku z tym mamy nadzieję, że ten stopień kriogeniczny zwiększy dostępność dla osób zainteresowanych cryo-LM, które wcześniej były zniechęcone kosztami i ograniczonym dostępem do sprzętu.
Rozwiązywanie problemów w krio-mikroskopii świetlnej
1. Adsorpcja próbki: Różne próbki mogą wykazywać zróżnicowane właściwości adsorpcyjne względem podłoża węglowego. Może okazać się konieczne zastosowanie innych typów siatek wsporczych, takich jak siatki z ciągłą warstwą węgla, węglem z otworami (holey carbon) lub powlekane Formvarem. Ponadto, jeśli próbka wiąże się z miedzianymi prętami siatki, a nie z powierzchnią węglową, konieczne może być dostosowanie chemii powierzchni węgla poprzez inkubację siatki z czynnikiem zwilżającym lub poddanie jej żarzeniu plazmowym (glow discharge) przed dodaniem próbki.
2. Stabilność stolika: Jeśli zauważysz wibracje, prawdopodobnie wynikają one z nadmiernego obciążenia stolika z próbką, a nie z pęcherzyków lN2. Dodatkowa masa stolika kriogenicznego może czasami powodować przenoszenie niskoczęstotliwościowych wibracji wzdłuż standardowego trójosiowego stolika mikroskopu, co negatywnie wpływa na obrazowanie poprzez rozmycie. Można to łatwo skorygować, wspierając stolik mikroskopu od spodu za pomocą regulowanego mini-podnośnika lub regulowanego adaptera z ramionami na dwie śruby, jak pokazano na filmie. Oba te regulowane mechanizmy wsporcze oddziałują na nieruchomą część stolika, co pozwala na zachowanie translacji w osiach X i Y, niezbędnej do obrazowania.

<table><tbody><tr><td>1 &amp;#8211; 22,86 cm (9&quot;) forma do tarty ze skośnymi brzegami</td><td>Dobry kucharz</td><td></td><td>Lokalny sklep spożywczy</td></tr><tr><td>1 &amp;#8211; 22,86 cm (9&quot;) forma do pieczenia ciasta</td><td>Dobry kucharz</td><td></td><td>Lokalny sklep spożywczy</td></tr><tr><td>4 pary pałeczek</td><td></td><td></td><td>Lokalny sklep spożywczy</td></tr><tr><td>1 - pianka montażowa w sprayu Great Stuff</td><td>Świetna robota</td><td></td><td>Lokalny sklep sprzętowy</td></tr><tr><td>1 - blok aluminium o wymiarach 4 cm x 8 cm x 1 cm </td><td></td><td></td><td>Lokalny sklep z artykułami budowlanymi lub złomowisko</td></tr><tr><td>5 - #10 1,91 cm (3/4&quot;) śruby z płaskim łbem i nacięciem w postaci szczeliny z nakrętkami</td><td></td><td></td><td>Lokalny sklep z artykułami budowlanymi</td></tr><tr><td>3 - #4 0,95 cm (3/8&quot;) okrągłe śruby z wycięciem i nakrętkami</td><td></td><td></td><td>Lokalny sklep z artykułami budowlanymi</td></tr><tr><td>15 podkładek nr 10</td><td></td><td></td><td>Lokalny sklep sprzętowy</td></tr><tr><td>2 – przezroczyste plastikowe podkładki z klipsem</td><td></td><td></td><td>Lokalny sklep biurowy</td></tr><tr><td>1 - Uchwyt do kasetek z siatkami do krio-EM </td><td>Ted Pella</td><td>160-41</td><td></td></tr><tr><td>1 - Pręt do manipulowania pudełkiem z siatkami do Cryo-EM</td><td>Ted Pella</td><td>160-46</td><td></td></tr><tr><td>1 - siatka wspierająca do kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) z miedzianym nośnikiem 400-mesh i perforowaną błoną węglową R2/1</td><td>SPI Supplies</td><td>4340C-XA</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Materiały eksperymentalne&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;Proszę o przesłanie tekstu źródłowego do tłumaczenia.&gt; &lt;li&gt;&lt;em&gt;Szczep drożdży:&lt;/em&gt; Hta1-CFP::Kan (KSC-3382: MATa, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-&amp;#916;63, his3-&amp;#916;200, leu2-&amp;#916;1, Hta1-CFP::KanMX6 z laboratorium Kaplana na UC Davis).&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;em&gt;Kriomikroskopia świetlna:&lt;/em&gt; Obrazy z kriomikroskopii świetlnej wykonano przy użyciu mikroskopu refleksyjnego Leica DM4000M z kamerą CCD Leica DFC310 FX. Obrazy w polu jasnym, polu ciemnym oraz obrazy fluorescencyjne uzyskano, korzystając z obiektywu powietrznego HCX PL FLUOTAR 5x 0,15 N.A., obiektywu powietrznego HCX PL FLUOTAR 10x 0,30 N.A., obiektywu powietrznego PL FLUOTAR 50x 0,55 N.A. lub obiektywu powietrznego NPLAN 100x 0,75 N.A. W przypadku obrazowania w polu jasnym i polu ciemnym jako źródło światła zastosowano lampę wolframową 12V 100W. Do obrazowania fluorescencyjnego wykorzystano lampę UV EL6000 w połączeniu z zestawem Leica JC1 (Ex.F.: BP 480/30, D.M.: LP 505, S.F. BP 535/40). &amp;kostka filtra (np. LP 580).&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;em&gt;Kriomikroskopia elektronowa w transmisji:&lt;/em&gt; Obrazy cryo-EM uzyskano przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego JEM-2100-FEG (JEOL, Japonia) pracującego przy napięciu 200 KeV z wykorzystaniem uchwytu do transferu kriogenicznego Gatan 626 (Gatan, USA). Mikrografie zarejestrowano przy nominalnych powiększeniach 50, 200, 1200 i 4000X za pomocą kamery CCD Tietz o rozdzielczości 4096 x 4096 pikseli (TVIPS, Gauting, Niemcy).&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

budowa niskokosztowego stolika do kriomikroskopii świetlnej na potrzeby skorelowanej mikroskopii świetlnej i elektronowej

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Połączenie kriomikroskopii świetlnej (cryo-LM) i kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) stwarza szereg zalet w zrozumieniu dynamiki i ultrastruktury komórkowej. Po pierwsze, w obu technikach komórki mogą być obrazowane w środowisku zbliżonym do naturalnego. Po drugie, dzięki procesowi witryfikacji próbki są utrwalane poprzez szybką immobilizację fizyczną, a nie powolną fiksację chemiczną. Po trzecie, obrazowanie tej samej próbki za pomocą cryo-LM i cryo-EM umożliwia korelację danych z pojedynczej komórki, a nie porównywanie „próbek reprezentatywnych”. Choć korzyści te są dobrze znane z wcześniejszych badań, powszechne zastosowanie korelacyjnej cryo-LM i cryo-EM pozostaje ograniczone ze względu na koszt i złożoność zakupu lub budowy odpowiedniego kriogenicznego stolika do mikroskopii świetlnej. W niniejszej pracy prezentujemy montaż i zastosowanie niedrogiego stolika kriogenicznego, który może zostać wykonany w każdym laboratorium za mniej niż 40 USD przy użyciu części dostępnych w lokalnych sklepach budowlanych i spożywczych. Ten stolik cryo-LM został zaprojektowany do pracy z mikroskopami światła odbitego wyposażonymi w obiektywy powietrzne o dużej odległości roboczej. Do korelacyjnych badań cryo-LM i cryo-EM dostosowujemy użycie standardowych siatek cryo-EM o średnicy 3 mm pokrytych węglem jako podłoży dla preparatów. Po adsorpcji próbki na siatce stosuje się wcześniej opracowane protokoły witryfikacji próbki oraz przenoszenia i obchodzenia się z siatką, aby umożliwić obrazowanie wielotechniczne. W rezultacie zestaw ten pozwala każdemu laboratorium dysponującemu mikroskopem światła odbitego na dostęp do bezpośredniego obrazowania korelacyjnego mrożonych próbek uwodnionych.

Prezentujemy wykonanie niskokosztowego stopnia kriogenicznego, zaprojektowanego tak, aby pasował do większości mikroskopów światła odbitego. Ten zbudowany w laboratorium stopień kriogeniczny umożliwia efektywne i niezawodne obrazowanie korelacyjne pomiędzy kriomikroskopią świetlną a kriomikroskopią elektronową.

Budowa niskokosztowego stolika do kriomikroskopii świetlnej na potrzeby skorelowanej mikroskopii świetlnej i elektronowej

Połączenie krio-mikroskopii świetlnej (cryo-LM) i krio-mikroskopii elektronowej (cryo-EM) niesie ze sobą szereg zalet w kontekście zrozumienia dynamiki komórkowej...

Witajcie, jestem David Carlson, doktorant w laboratorium Jamesa Evansa w Zakładzie Biochemii i Biologii Molekularnej na University of California Davis. W tym filmie pokażę Państwu, jak zbudować prosty i skuteczny kriostolik świetlny do korelacyjnej kriomikroskopii świetlno-elektronowej. Kriostolik składa się z przezroczystej szyby obserwacyjnej, otworu na obiektywy, doprowadzenia ciekłego azotu, radiatora do obserwacji próbki oraz uchwytu do transferu próbki.Większość wykorzystanych materiałów została zakupiona w lokalnym sklepie sprzętowym i spożywczym. Składają się one z dziewięciocalowej formy do pieczenia w kształcie rury, dziewięciocalowej formy do ciasta, czterech par pałeczek, ekspandującej pianki montażowej, bloku aluminium o wymiarach 4 cm x 8 cm x 1 cm z wywierconymi otworami montażowymi na śruby nr 10, pięciu śrub płaskich z nacięciem śrubowca nr 10 o długości 3/4 cala wraz z nakrętkami, trzech okrągłych śrub z nacięciem śrubowca nr 4 o długości 3/8 cala wraz z nakrętkami, 15 podkładek nr 10, dwóch przezroczystych plastikowych podkładek do notatek, wody oraz pojemnika na siatki do cryo-EM i pręta do manipulacji, które można nabyć w firmie Ted Pella.Umieść formę do tarty na stole mikroskopu pod obiektywami. Umieść blok aluminiowy w pobliżu krawędzi formy i ustaw ostrość na powierzchni aluminium. Sprawdź, czy obiektywy mogą swobodnie przemieszczać się nad brzegiem formy do tarty.Jeśli nie, należy ponownie ustawić blok aluminiowy i sprawdzić pozycję. Po ustaleniu położenia bloku aluminiowego należy zaznaczyć pozycje śrub montażowych za pomocą markera. Następnie należy umieścić pudełko na siatki kriogeniczne obok bloku aluminiowego i za pomocą markera zapisać położenie wcięcia oraz każdej strony pudełka na siatki kriogeniczne, uwzględniając układ śrub zaznaczony na powierzchni szalki Petriego.Za pomocą ostrego wkręta i młotka należy wykonać otwory startowe w każdym z zaznaczonych punktów, używając wierteł nr 17. Następnie należy wywiercić otwory do montażu bloku aluminiowego, zaokrąglając każdy otwór w celu wygładzenia krawędzi.Następnie, używając wiertła nr 35, należy wywiercić i zaokrąglić otwory do montażu pojemnika na siatki kriogeniczne, czyli spodka. Po przygotowaniu i wywierceniu, w otwory w bloku aluminiowym należy włożyć dziesięć śrub z łbem płaskim z nacięciem, o rozmiarze 3/4 cala, a na każdym z bloków aluminiowych umieścić dwie podkładki SAE nr 10.Otwory montażowe w naczyniu typu pie dish. Następnie, montując blok, wkręć palcami każdy z zacisków, a następnie dokręć je za pomocą wiertarki. Odwróć naczynie i nałóż podkładkę nr 10 na każdy zacisk, a następnie zabezpiecz je nakrętką.Za pomocą klucza upewnij się, że wszystkie nakrętki są mocno dokręcone. Następnie, od spodu naczynia, włóż śruby nr 4 z okrągłą łbem i szczeliną w otwory montażowe obudowy siatek kriogenicznych i zabezpiecz je nakrętkami od góry naczynia.Po zakończeniu prac nad górną częścią stanowiska kriogenicznego, demonstrujemy sposób przenoszenia pudełka z siatkami kriogenicznymi w przypadku braku zarówno plastikowego podkładnika, jak i ciekłego azotu. Następnie rozpoczynamy przygotowanie formy z pianki izolacyjnej. Zacznij od związania pałeczek w pary za pomocą taśmy.Następnie przyklej taśmą każdy pęczek pałeczek do krawędzi formy do ciasta, naprzeciwko siebie. Zastosowanie pałeczek ma na celu zapewnienie jednolitej grubości izolacji piankowej. Następnie zwilż wodą formę do ciasta oraz dolną powierzchnię formy do tarty.Zacznij od nałożenia pojedynczej warstwy pianki montażowej typu „great stuff”. Rozpyl piankę na całym dnie formy do ciasta, a następnie spryskaj wodą. Nałóż drugą warstwę pianki montażowej „great stuff” i ponownie spryskaj wodą.Równomiernie i mocno dociśnij formę do tarty do formy do ciasta. Odwróć obie formy do góry dnem i połóż na nich ciężki obciążnik. Pozostaw piankę do utwardzenia na noc.Po utwardzeniu pianki należy za pomocą ząbkowanego noża wyciąć formę i usunąć nadmiar pianki z jej boków. Należy wyjąć pałeczki służące jako dystansowe i oddzielić formę do tarty od formy do ciasta. Pianka powinna pozostać w formie do tarty.Następnie umieść stolik kriogeniczny pod obiektywem i połóż na nim plastikowy podkład z klipsem. Za pomocą markera odrysuj tor ruchu obiektywów podczas ich wysuwania i chowania. Zaznacz znak X z dala od półkola, blisko krawędzi naczynia typu pie dish.Za pomocą drugiej podkładki z klipsem zaznacz miejsce montażu obudowy siatki tłumu. Wytnij otwór na obudowę siatki tłumu, używając wiertarki z otwornicą o średnicy trzech czwartych cala, dociskając ją do drugiej podkładki. Wytnij kształt X za pomocą otwornicy o średnicy trzech czwartych cala.Usuń półkolisty obszar, wykonując kilka nacięć za pomocą trzymilowej otwornicy i wiertarki stołowej. Proces wykonania jest teraz zakończony. Materiały potrzebne do przygotowania próbek obejmują pudełko na siatki kriogeniczne, pęsetę do manipulacji, blok transferowy do pudełka na siatki kriogeniczne, chłonną chusteczkę bezpyłową, kubek chłodzący, kubek z ciekłym etanem, siatki EM z dziurkowanym węglem o gęstości 400 mesh R2/1, pudełko styropianowe oraz pneumatyczny mroźnik zanurzeniowy. Umieść pionowo w pudełku styropianowym pudełko na siatki kriogeniczne, blok transferowy, kubek chłodzący oraz kubek z ciekłym etanem, a następnie zalej je ciekłym azotem.Następnie umieść pudełko z siatkami kriogenicznymi w bloku transferowym. Używając pęsety, przytrzymaj siatkę EM stroną węglową do góry. Nanieś 2 µL zawiesiny komórek o stężeniu 2 × 10⁶ komórek/mL na górną powierzchnię siatki.Zamocuj pęsetę na tłoku pneumatycznym i odciągnij ciecz z powierzchni siatki, dociskając kawałek rozerwanej chusteczki do przecierania chem wipe do tylnej strony siatki EM, a następnie zanurz ją w zawiesinie ciekłego etanu. Szybko przenieś siatkę z ciekłego etanu do ciekłego azotu i umieść ją w pudełku na siatki kriogeniczne. Aby skorzystać ze stolika kriogenicznego, zacznij od napełnienia naczynia ciekłym azotem i przykryj je podkładką.Po przeniesieniu pudełka z siatkami kriogenicznymi przez otwór w plastikowym uchwycie, wyjmij jedną siatkę z pudełka i umieść ją na powierzchni oglądania bloku aluminiowego. Po ustawieniu stolika kriogenicznego w mikroskopie, połóż drugi uchwyt na pierwszym i ostrożnie wysuń pierwszy uchwyt.Włóż obiektywy i korzystaj z mikroskopu w zwykły sposób. Rozpocznij od skanowania przy niskim powiększeniu w celu zlokalizowania środka siatki, oznaczonego trzema metalowymi wypustkami. W tym miejscu ustaw ostrość przy powiększeniu 50 x.Widać cienką warstwę lodu witryfikowanego pokrywającą siatkę, która zmienia się w fluorescencję. Widoczny jest marker histonowy CFP zlokalizowany w jądrze komórkowym. Następnie zmieniam obiektyw na 100 x i ustawiam ostrość na poszczególne komórki drożdży.Aby zdjąć stolik kriogeniczny z mikroskopu, należy położyć pierwszy schowek na drugim i ostrożnie wysunąć dolny schowek. Zdejmij stolik kriogeniczny z mikroskopu i umieść siatkę z powrotem w pudełku na siatki kriogeniczne, korzystając z otworu w schowku. Na koniec wkręć pręt do przenoszenia do pudełka na siatki kriogeniczne i przenieś je do ciekłego azotu w celu późniejszej analizy.W mikroskopii elektronowej stabilność stolika jest bardzo ważna. W badaniach mikroskopowych stwierdziliśmy, że większość niestabilności obrazu w naszym systemie wynika z dodatkowej masy stolika kriogenicznego na stoliku mikroskopu. W przypadku braku ciekłego azotu można zaobserwować znaczną niestabilność podczas ustawiania ostrości na bloku aluminiowym.Poprzez dodanie wspornika z przodu stolika mikroskopu znacznie zredukowano niestabilność. Przedstawiam tutaj strukturę wspierającą składającą się z regulowanego mechanizmu śrubowego, którą umieszczam pomiędzy stolikiem a podstawą mikroskopu. Korzyść z dodatkowego wsparcia jest widoczna również w kriomikroskopii świetlnej, co dowodzi, że niestabilność wynika z dodanego ciężaru, a nie z pęcherzyków ciekłego azotu.Jak widać, ten kriostolik oświetleniowy jest niedrogim i użytecznym sposobem na pozyskiwanie informacji fluorescencyjnych z zamrożonych uwodnionych komórek. Skanowanie w polu jasnym i ciemnym pozwala na zmapowanie obszarów jednolitego lodu. Po zlokalizowaniu tych obszarów zainteresowania możemy użyć kanału fluorescencji, aby zobaczyć fluorofor służący do znakowania białek zainteresowania, w tym przypadku marker CFP histone.Po zarejestrowaniu obrazów w kriofluorescencji, możemy wykorzystać obrazy o niskim powiększeniu do zmapowania i odnalezienia tej samej siatki oraz pola, a następnie obrazować te same komórki w kriomikroskopii elektronowej. Jak widać, ta stacja do krioświetlenia jest użytecznym i niedrogim sposobem na gromadzenie obrazów fluorescencyjnych zamrożonych próbek wodoru. Ten sam obszar można zaobserwować również w krio EM, stosując standardowe techniki transferu i obrazowania w krio EM.W tym przypadku dane z kriomikroskopii świetlnej służą jako mapa referencyjna do zidentyfikowania dokładnego obszaru do badań korelacyjnych. Etap ten można zastosować w obrazowaniu korelacyjnym wielu rodzajów próbek, w tym całych komórek, reakcji kompleksów makromolekularnych in vitro, izolowanych organelli oraz cienkich krioprzestrojów tkankowych. Dziękujemy za oglądanie i mamy nadzieję, że ta platforma do kriomikroskopii świetlnej okaże się dla Państwa tak użyteczna, jak dla nas.

low-cost-cryo-light-microscopy-stage-fabrication-for-correlated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Tanie wykonanie podstawy kryo-świetlnej mikroskopii dla skorelowanych badań świetlnych/elektronowych

Bezsoczewkowa tomografia optyczna to trójwymiarowa technika mikroskopowa oferująca rozdzielczość przestrzenną &lt;1 μm × &lt;1 μm × &lt;3 μm odpowiednio w wymiarach x, y i z, przy dużej objętości obrazowania wynoszącej 15-100 mm3, co może być szczególnie użyteczne w integracji z platformami typu lab-on-a-chip.

Bezosobnikowa tomograficzna mikroskopia na chipie z wykorzystaniem wielokątnego oświetlenia i superrozdzielczości pikselowej

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Tutaj wytwarzamy 3D polimerowe mikro/nano struktury, w których zarówno kształt, jak i wyrównanie molekularne mogą być zaprojektowane z dokładnością do skali nanometrowej za pomocą bezpośredniego pisma laserowego. Indukowane światłem odkształcenia kilku typów mikrostruktur elastomerów ciekłokrystalicznych mogą być kontrolowane w skali mikroskopowej.

Siłowniki do oświetlenia o dowolnym kształcie -- Wytwarzanie i sterowanie uruchamianiem w skali mikroskopowej

Metoda korelacyjnej mikroskopii elektronów świetlnych (CLEM) jest stosowana do obrazowania indukowanych wirusem struktur wewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) w komórkach, które zostały wcześniej wybrane przez mikroskopię świetlną (LM). LM i EM są łączone jako hybrydowe podejście do obrazowania w celu uzyskania zintegrowanego obrazu interakcji wirus-gospodarz.

Korelacyjna mikroskopia świetlno-elektronowa (CLEM) do śledzenia i obrazowania struktur związanych z białkami wirusowymi w komórkach unieruchomionych kriogenicznie

Mikroskopia optyczna oparta na chipach jest nowatorskim podejściem do mikroskopii fluorescencyjnej i oferuje korzyści w zakresie efektywności kosztowej i przepustowości. W tym miejscu przedstawiono protokoły przygotowania i obrazowania chipów dla mikroskopii TIRF i mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji.

Wysokoprzepustowa mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia i bezpośredniej stochastycznej rekonstrukcji optycznej z wykorzystaniem chipa fotonicznego

Ten protokół pokazuje, jak obrazować biologiczne próbki kriokonserwowane za pomocą kriostrukturalnej mikroskopii świetlnej. Demonstrujemy metodologię, obrazując cytoszkielet komórek U2OS.

Mikroskopijne gromadzenie danych z komórek zakonserwowanych kriogenicznie

Używanie mielenia skupionej wiązki jonów do produkcji szklistych blaszek na siatce z zamrożonych próbek biologicznych do krioelektronowej tomografii.

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Protokół opisuje wysokoprzepustowe generowanie sferoidów do biodruku przy użyciu wieloparametrycznej analizy ich natlenienia i śmierci komórki pod standardowym mikroskopem fluorescencyjnym. Podejście to można zastosować do kontrolowania żywotności sferoid i przeprowadzania standaryzacji, co jest ważne w modelowaniu tkanki 3D, mikrośrodowiska guza i udanej biofabrykacji (mikro)tkanek.

Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

Multimodalny, szybki system obrazowania hiperspektralnego został opracowany w celu uzyskania szerokopasmowych obrazów generowania oscylacyjnej sumy częstotliwości (VSFG), wraz z modalnościami obrazowania jasnego pola i generacji drugiej harmonicznej (SHG). Ze względu na to, że częstotliwość podczerwieni rezonansuje z drganiami molekularnymi, ujawnia się mikroskopijna wiedza o morfologii strukturalnej i mezoskopowej próbek dopuszczonych do symetrii.

Multimodalne nieliniowe hiperspektralne obrazowanie chemiczne przy użyciu mikroskopii generacji drgań i częstotliwości ze skanowaniem liniowym

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak zbudować jednoobiektywowy, światło-arkuszowy mikroskop fluorescencyjny i jego zastosowanie do wizualizacji sieci cytoszkieletów.

Zaprojektowanie i zbudowanie konfigurowalnego, jednoobiektywowego, arkuszowego mikroskopu fluorescencyjnego do wizualizacji sieci cytoszkieletów

Ten proces umożliwia produkcję lamelli, ukierunkowaną na fluorescencyjne struktury biologiczne, które są małe (&lt;1 μm w zasięgu osiowym) i rzadkie (1 kopia na komórkę) przy użyciu kriogenicznej platformy obrazowania trójkokocyklnego. Ta platforma integruje mikroskopię fluorescencyjną, frezowanie wiązką jonową skupioną oraz skaningową mikroskopię elektronową w jednej pozycji ogniskowej, umożliwiając jednoczesną mikroskopię fluorescencyjną podczas frezowania.

Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek

Poznaj metodę budowy taniego kriogenicznego stolika do mikroskopii świetlnej i elektronowej. Technika umożliwia skorelowane obrazowanie próbek biologicznych przy niskich temperaturach.

Budowa niskokosztowego stolika do kriomikroskopii świetlnej na potrzeby skorelowanej mikroskopii świetlnej i elektronowej

Przeglądaj więcej filmów