Budowa niskokosztowego stolika do kriomikroskopii świetlnej na potrzeby skorelowanej mikroskopii świetlnej i elektronowej

Witajcie, jestem David Carlson, doktorant w laboratorium Jamesa Evansa w Zakładzie Biochemii i Biologii Molekularnej na University of California Davis. W tym filmie pokażę Państwu, jak zbudować prosty i skuteczny kriostolik świetlny do korelacyjnej kriomikroskopii świetlno-elektronowej. Kriostolik składa się z przezroczystej szyby obserwacyjnej, otworu na obiektywy, doprowadzenia ciekłego azotu, radiatora do obserwacji próbki oraz uchwytu do transferu próbki.

Większość wykorzystanych materiałów została zakupiona w lokalnym sklepie sprzętowym i spożywczym. Składają się one z dziewięciocalowej formy do pieczenia w kształcie rury, dziewięciocalowej formy do ciasta, czterech par pałeczek, ekspandującej pianki montażowej, bloku aluminium o wymiarach 4 cm x 8 cm x 1 cm z wywierconymi otworami montażowymi na śruby nr 10, pięciu śrub płaskich z nacięciem śrubowca nr 10 o długości 3/4 cala wraz z nakrętkami, trzech okrągłych śrub z nacięciem śrubowca nr 4 o długości 3/8 cala wraz z nakrętkami, 15 podkładek nr 10, dwóch przezroczystych plastikowych podkładek do notatek, wody oraz pojemnika na siatki do cryo-EM i pręta do manipulacji, które można nabyć w firmie Ted Pella.

Umieść formę do tarty na stole mikroskopu pod obiektywami. Umieść blok aluminiowy w pobliżu krawędzi formy i ustaw ostrość na powierzchni aluminium. Sprawdź, czy obiektywy mogą swobodnie przemieszczać się nad brzegiem formy do tarty.

Jeśli nie, należy ponownie ustawić blok aluminiowy i sprawdzić pozycję. Po ustaleniu położenia bloku aluminiowego należy zaznaczyć pozycje śrub montażowych za pomocą markera. Następnie należy umieścić pudełko na siatki kriogeniczne obok bloku aluminiowego i za pomocą markera zapisać położenie wcięcia oraz każdej strony pudełka na siatki kriogeniczne, uwzględniając układ śrub zaznaczony na powierzchni szalki Petriego.

Za pomocą ostrego wkręta i młotka należy wykonać otwory startowe w każdym z zaznaczonych punktów, używając wierteł nr 17. Następnie należy wywiercić otwory do montażu bloku aluminiowego, zaokrąglając każdy otwór w celu wygładzenia krawędzi.

Następnie, używając wiertła nr 35, należy wywiercić i zaokrąglić otwory do montażu pojemnika na siatki kriogeniczne, czyli spodka. Po przygotowaniu i wywierceniu, w otwory w bloku aluminiowym należy włożyć dziesięć śrub z łbem płaskim z nacięciem, o rozmiarze 3/4 cala, a na każdym z bloków aluminiowych umieścić dwie podkładki SAE nr 10.

Otwory montażowe w naczyniu typu pie dish. Następnie, montując blok, wkręć palcami każdy z zacisków, a następnie dokręć je za pomocą wiertarki. Odwróć naczynie i nałóż podkładkę nr 10 na każdy zacisk, a następnie zabezpiecz je nakrętką.

Za pomocą klucza upewnij się, że wszystkie nakrętki są mocno dokręcone. Następnie, od spodu naczynia, włóż śruby nr 4 z okrągłą łbem i szczeliną w otwory montażowe obudowy siatek kriogenicznych i zabezpiecz je nakrętkami od góry naczynia.

Po zakończeniu prac nad górną częścią stanowiska kriogenicznego, demonstrujemy sposób przenoszenia pudełka z siatkami kriogenicznymi w przypadku braku zarówno plastikowego podkładnika, jak i ciekłego azotu. Następnie rozpoczynamy przygotowanie formy z pianki izolacyjnej. Zacznij od związania pałeczek w pary za pomocą taśmy.

Następnie przyklej taśmą każdy pęczek pałeczek do krawędzi formy do ciasta, naprzeciwko siebie. Zastosowanie pałeczek ma na celu zapewnienie jednolitej grubości izolacji piankowej. Następnie zwilż wodą formę do ciasta oraz dolną powierzchnię formy do tarty.

Zacznij od nałożenia pojedynczej warstwy pianki montażowej typu „great stuff”. Rozpyl piankę na całym dnie formy do ciasta, a następnie spryskaj wodą. Nałóż drugą warstwę pianki montażowej „great stuff” i ponownie spryskaj wodą.

Równomiernie i mocno dociśnij formę do tarty do formy do ciasta. Odwróć obie formy do góry dnem i połóż na nich ciężki obciążnik. Pozostaw piankę do utwardzenia na noc.

Po utwardzeniu pianki należy za pomocą ząbkowanego noża wyciąć formę i usunąć nadmiar pianki z jej boków. Należy wyjąć pałeczki służące jako dystansowe i oddzielić formę do tarty od formy do ciasta. Pianka powinna pozostać w formie do tarty.

Następnie umieść stolik kriogeniczny pod obiektywem i połóż na nim plastikowy podkład z klipsem. Za pomocą markera odrysuj tor ruchu obiektywów podczas ich wysuwania i chowania. Zaznacz znak X z dala od półkola, blisko krawędzi naczynia typu pie dish.

Za pomocą drugiej podkładki z klipsem zaznacz miejsce montażu obudowy siatki tłumu. Wytnij otwór na obudowę siatki tłumu, używając wiertarki z otwornicą o średnicy trzech czwartych cala, dociskając ją do drugiej podkładki. Wytnij kształt X za pomocą otwornicy o średnicy trzech czwartych cala.

Usuń półkolisty obszar, wykonując kilka nacięć za pomocą trzymilowej otwornicy i wiertarki stołowej. Proces wykonania jest teraz zakończony. Materiały potrzebne do przygotowania próbek obejmują pudełko na siatki kriogeniczne, pęsetę do manipulacji, blok transferowy do pudełka na siatki kriogeniczne, chłonną chusteczkę bezpyłową, kubek chłodzący, kubek z ciekłym etanem, siatki EM z dziurkowanym węglem o gęstości 400 mesh R2/1, pudełko styropianowe oraz pneumatyczny mroźnik zanurzeniowy. Umieść pionowo w pudełku styropianowym pudełko na siatki kriogeniczne, blok transferowy, kubek chłodzący oraz kubek z ciekłym etanem, a następnie zalej je ciekłym azotem.

Następnie umieść pudełko z siatkami kriogenicznymi w bloku transferowym. Używając pęsety, przytrzymaj siatkę EM stroną węglową do góry. Nanieś 2 µL zawiesiny komórek o stężeniu 2 × 10⁶ komórek/mL na górną powierzchnię siatki.

Zamocuj pęsetę na tłoku pneumatycznym i odciągnij ciecz z powierzchni siatki, dociskając kawałek rozerwanej chusteczki do przecierania chem wipe do tylnej strony siatki EM, a następnie zanurz ją w zawiesinie ciekłego etanu. Szybko przenieś siatkę z ciekłego etanu do ciekłego azotu i umieść ją w pudełku na siatki kriogeniczne. Aby skorzystać ze stolika kriogenicznego, zacznij od napełnienia naczynia ciekłym azotem i przykryj je podkładką.

Po przeniesieniu pudełka z siatkami kriogenicznymi przez otwór w plastikowym uchwycie, wyjmij jedną siatkę z pudełka i umieść ją na powierzchni oglądania bloku aluminiowego. Po ustawieniu stolika kriogenicznego w mikroskopie, połóż drugi uchwyt na pierwszym i ostrożnie wysuń pierwszy uchwyt.

Włóż obiektywy i korzystaj z mikroskopu w zwykły sposób. Rozpocznij od skanowania przy niskim powiększeniu w celu zlokalizowania środka siatki, oznaczonego trzema metalowymi wypustkami. W tym miejscu ustaw ostrość przy powiększeniu 50 x.

Widać cienką warstwę lodu witryfikowanego pokrywającą siatkę, która zmienia się w fluorescencję. Widoczny jest marker histonowy CFP zlokalizowany w jądrze komórkowym. Następnie zmieniam obiektyw na 100 x i ustawiam ostrość na poszczególne komórki drożdży.

Aby zdjąć stolik kriogeniczny z mikroskopu, należy położyć pierwszy schowek na drugim i ostrożnie wysunąć dolny schowek. Zdejmij stolik kriogeniczny z mikroskopu i umieść siatkę z powrotem w pudełku na siatki kriogeniczne, korzystając z otworu w schowku. Na koniec wkręć pręt do przenoszenia do pudełka na siatki kriogeniczne i przenieś je do ciekłego azotu w celu późniejszej analizy.

W mikroskopii elektronowej stabilność stolika jest bardzo ważna. W badaniach mikroskopowych stwierdziliśmy, że większość niestabilności obrazu w naszym systemie wynika z dodatkowej masy stolika kriogenicznego na stoliku mikroskopu. W przypadku braku ciekłego azotu można zaobserwować znaczną niestabilność podczas ustawiania ostrości na bloku aluminiowym.

Poprzez dodanie wspornika z przodu stolika mikroskopu znacznie zredukowano niestabilność. Przedstawiam tutaj strukturę wspierającą składającą się z regulowanego mechanizmu śrubowego, którą umieszczam pomiędzy stolikiem a podstawą mikroskopu. Korzyść z dodatkowego wsparcia jest widoczna również w kriomikroskopii świetlnej, co dowodzi, że niestabilność wynika z dodanego ciężaru, a nie z pęcherzyków ciekłego azotu.

Jak widać, ten kriostolik oświetleniowy jest niedrogim i użytecznym sposobem na pozyskiwanie informacji fluorescencyjnych z zamrożonych uwodnionych komórek. Skanowanie w polu jasnym i ciemnym pozwala na zmapowanie obszarów jednolitego lodu. Po zlokalizowaniu tych obszarów zainteresowania możemy użyć kanału fluorescencji, aby zobaczyć fluorofor służący do znakowania białek zainteresowania, w tym przypadku marker CFP histone.

Po zarejestrowaniu obrazów w kriofluorescencji, możemy wykorzystać obrazy o niskim powiększeniu do zmapowania i odnalezienia tej samej siatki oraz pola, a następnie obrazować te same komórki w kriomikroskopii elektronowej. Jak widać, ta stacja do krioświetlenia jest użytecznym i niedrogim sposobem na gromadzenie obrazów fluorescencyjnych zamrożonych próbek wodoru. Ten sam obszar można zaobserwować również w krio EM, stosując standardowe techniki transferu i obrazowania w krio EM.

W tym przypadku dane z kriomikroskopii świetlnej służą jako mapa referencyjna do zidentyfikowania dokładnego obszaru do badań korelacyjnych. Etap ten można zastosować w obrazowaniu korelacyjnym wielu rodzajów próbek, w tym całych komórek, reakcji kompleksów makromolekularnych in vitro, izolowanych organelli oraz cienkich krioprzestrojów tkankowych. Dziękujemy za oglądanie i mamy nadzieję, że ta platforma do kriomikroskopii świetlnej okaże się dla Państwa tak użyteczna, jak dla nas.