Test labiryntu wodnego Morrisa w ocenie deficytów uczenia się i pamięci u myszy w modelu choroby Alzheimera
20 lipca 2011
Labirynt wodny Morrisa to zadanie behawioralne służące do badania uczenia się i pamięci zależnej od hipokampa. Jest on szeroko stosowany w badaniach nad neurobiologią, neurofarmakologią oraz zaburzeniami neuropoznawczymi w modelach gryzoni.
Ogólnym celem następnego eksperymentu jest przetestowanie uczenia się i pamięci zależnej od hipokampa. Pierwszego dnia mysz jest trenowana w odnajdywaniu wynurzonej platformy z flagą, która jest rozmieszczona losowo w basenie z przejrzystą wodą, aby mysz mogła nauczyć się, że zadanie posiada punkt wyjścia umożliwiający ucieczkę. W drugim kroku, w kolejnych dniach, mysz jest trenowana poprzez wpuszczanie do basenu z nieprzezroczystą wodą z różnych pozycji, podczas gdy platforma jest zanurzona i przymocowana w jednej lokalizacji.
Pozwala to myszy nauczyć się położenia platformy, wykorzystując wskazówki z otoczenia. Następnie, w ostatnim dniu platforma zostaje usunięta, a wzorzec pływania myszy jest śledzony przez jedną minutę w celu oceny nabycia umiejętności w zadaniu. W ten sposób uzyskuje się wyniki dotyczące uczenia się i pamięci.
Wskazują one na upośledzenie uczenia przestrzennego i pamięci, w oparciu o czasy opóźnienia ucieczki oraz długość ścieżki zaobserwowane w trzech różnych warunkach testowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod jest względna łatwość odróżnienia warunków z ukrytą platformą przestrzenną od warunków z widoczną platformą nieprzestrzenną. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ jest ona wrażliwa na sposób prowadzenia eksperymentu.
Należy upewnić się, że myszy nie odczuwają stresu podczas procedur, gdyż mogłoby to wpłynąć na wyniki. Procedurę zaprezentują pani Kelly Bromley oraz studentka studiów podyplomowych z mojego laboratorium, Miss Sweden. Najpierw należy przygotować okrągłą arenę. Jeśli myszy doświadczalne są czarne, należy użyć białej areny, a jeśli myszy są białe, należy użyć czarnej areny.
Zorganizuj przestrzeń za pomocą przegród w taki sposób, aby testowane zwierzęta nie widziały eksperymentatora podczas przebywania w miejscu testowym. Umieść wysoko kontrastowe wskazówki przestrzenne wokół pomieszczenia oraz wewnątrz basenu, w miejscu znajdującym się ponad powierzchnią wody. Napełnij basen wodą i doprowadź ją do temperatury pokojowej.
Następnie umieść w basenie platformę o średnicy 10 centymetrów, jeden centymetr powyżej powierzchni wody – białą w przypadku białego basenu lub z przezroczystego pleksiglasu w przypadku czarnego basenu. Skalibruj basen w oprogramowaniu komputerowym, aby kamera mogła wygenerować informacje o odległości fizycznej na podstawie danych pikselowych.
Podziel basen na cztery kwadranty. Zdefiniuj strefę platformy jako strefę zmienną, która może zmieniać się w każdej próbie. Następnie utwórz pięć podstref platformy: po jednej w każdym kwadrancie oraz jedną w centrum basenu.
Zapisz kalibrację i używaj jej przez pozostałe dni testów. Następnie ustaw maksymalny czas próby na 60 sekund. Jeśli mysz odnajdzie platformę przed upływem tego czasu, zaprogramuj oprogramowanie tak, aby zakończyło próbę w momencie znalezienia platformy.
Należy również określić program tak, aby śledzenie rozpoczynało się automatycznie w momencie, gdy eksperymentator opuści obszar testowy. Należy wykorzystać wszelkie dostępne w pakiecie oprogramowania opcje minimalizacji refleksów. Na koniec należy śledzić przebieg ścieżki, jej długość, ucieczkę, latencję oraz czas spędzony w każdym kwadrancie.
W dniu testów przenieś myszy z pomieszczenia hodowlanego do pokoju behawioralnego, w miejsce, z którego nie będą widzieć basenu ani wskazówek przestrzennych. Pozostaw je na co najmniej 30 minut, aby zaadaptowały się do nowego środowiska. Przed rozpoczęciem testów wprowadź kalibrację basenu do oprogramowania śledzącego.
Przygotuj pięć prób z odpowiednim programem odstępów między próbami, różną lokalizacją platformy oraz różnym kierunkiem startowym dla każdej próby. Umieść na platformie flagę, aby zwiększyć jej widoczność. Aby rozpocząć testowanie, wyjmij mysz z klatki domowej, chwytając ją za nasadę ogona i podtrzymując zwierzę podczas przenoszenia do obszaru testowego.
Następnie delikatnie umieść mysz w wodzie, skierowaną w stronę brzegu basenu. Szybko opuść obszar testowy. Jeśli mysz znajdzie platformę przed 62. sekundą czasu końcowego, pozwól jej pozostać na platformie przez pięć sekund, a następnie przenieś ją z powrotem do klatki domowej.
Jeśli mysz nie odnajdzie platformy, umieść ją na niej i pozwól jej pozostać tam przez 20 sekund przed powrotem do klatki macierzystej. Powtórz tę czynność dla wszystkich myszy biorących udział w próbie. Każdą kolejną próbę rozpocznij z innym położeniem platformy i innym kierunkiem startowym zgodnie z oprogramowaniem programu.
Po zakończeniu testów należy przenieść myszy z powrotem do ich klatek w celu przygotowania ich do następnego dnia. Należy zdjąć flagę z platformy i dolać wody do basenu, aby platforma została zanurzona na jeden centymetr poniżej powierzchni. Należy wgrać kalibrację basenu do oprogramowania śledzącego i stworzyć pięć prób z odpowiednim odstępem między nimi.
Następnie zaprogramuj położenie platformy tak, aby pozostawało ono w tej samej pozycji podczas wszystkich prób i dni, ale spraw, by kierunek startowy różnił się w każdej próbie każdego dnia. W przypadku czarnych myszy dodaj do basenu nietoksyczną białą farbę temperową w proszku i dokładnie wymieszaj. Użyj takiej ilości farby, aby zanurzona platforma nie była widoczna z powierzchni wody.
Przejdź do testowania poszczególnych myszy w wodzie, zgodnie z wcześniejszym opisem dla końcowego badania sondy. Wgraj kalibrację basenu do oprogramowania śledzącego. Utwórz jedno badanie bez wyznaczonej strefy platformy i z jednym kierunkiem startowym.
Preferowany jest kierunek startowy najdalej oddalony od kwadrantu platformy wykorzystywanego w dniach od drugiego do piątego. Należy również ustawić czas trwania próby na 60 seconds. Następnie należy usunąć platformę z basenu i przetestować poszczególne myszy w wodzie, zgodnie z opisem dla każdego dnia; dla każdej myszy należy wyciągnąć średnią z pięciu prób, aby uzyskać pojedynczą wartość długości ścieżki i czasu latencji ucieczki dla każdego badanego osobnika.
Następnie przeanalizowano i zinterpretowano dane zgodnie ze szczegółowym opisem w towarzyszącym manuskrypcie, wykorzystując wodny labirynt Morrisa. Siedmiomiesięczne transgeniczne myszy APP 23, niosące ludzki gen APP z mutacją szwedzką, zostały przebadane po miesiącu codziennych iniekcji kwasu walproinowego lub roztworu nośnika, zaczynając od pierwszego dnia testów z widoczną platformą. Myszy APP 23 leczone VPA oraz myszy z grupy kontrolnej wykazały podobną latencję ucieczki na widoczną platformę.
Myszy PP 23 traktowane VPA oraz grupa kontrolna wykazały podobne dystanse pływania przed ucieczką na widoczną platformę. W teście z widoczną platformą oraz w testach z ukrytą platformą w trzecim i czwartym dniu, myszy PP 23 traktowane VPA wykazały krótszy czas latencji przed ucieczką na ukrytą platformę. W trzecim i czwartym dniu myszy PP 23 traktowane VPA pokonały krótszy dystans pływania przed ucieczką na ukrytą platformę.
W próbie badawczej w szóstym dniu, w porównaniu z myszami kontrolnymi, myszy z grupy VPA PP 23 znacznie częściej wchodziły do trzeciej ćwiartki, w której wcześniej znajdowała się ukryta platforma. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest monitorowanie czynników środowiskowych, które mogą wywołać stres, takich jak hałas, temperatura i światło. Po zakończeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak warunkowanie lękiem kontekstowym i sygnałowym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład czy deficyty w uczeniu się są specyficzne dla hipokampu, czy stanowią część szerszego problemu neuropoznawczego, który może obejmować ciało migdałowate.
Przegląd
Labirynt wodny Morrisa jest zadaniem behawioralnym zaprojektowanym w celu oceny uczenia się i pamięci zależnej od hipokampa w modelach gryzoni. Metoda ta jest szeroko wykorzystywana w badaniach z zakresu neurobiologii i neurofarmakologii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Neurofarmakologia
- Behawioralna neuronauka
Wstęp
- Test labiryntu wodnego Morrisa służy do badania uczenia się przestrzennego i pamięci.
- Myszy są trenowane w lokalizowaniu zanurzonej platformy z wykorzystaniem wskazówek przestrzennych.
- Metoda ta pomaga w zrozumieniu zaburzeń poznawczych w różnych schorzeniach.
- Prawidłowa obsługa doświadczalna jest kluczowa, aby uniknąć stresu u myszy.
Cel badania
- Ocena uczenia się i pamięci zależnej od hipokampa u myszy.
- Analiza wpływu zastosowanych terapii na uczenie się przestrzenne.
- Ocena przyswojenia zadania na podstawie wzorców pływania i latencji ucieczki.
Zastosowane metody
- Trenowanie myszy w celu odnalezienia platformy w basenie z wodą.
- Wykorzystanie różnych warunków wody (przezroczystej i mętnej) do oceny procesu uczenia się.
- Śledzenie wzorców pływania oraz latencji ucieczki podczas prób.
- Analiza danych w celu określenia zdolności uczenia się i zapamiętywania.
Główne wyniki
- Myszy traktowane VPA oraz myszy z grupy kontrolnej wykazały podobne opóźnienia w testach z widoczną platformą.
- W testach z ukrytą platformą myszy traktowane VPA wykazały krótsze opóźnienia w ucieczce.
- Długość ścieżki oraz opóźnienia w ucieczce były mierzone w kolejnych próbach.
- Wyniki wskazują na potencjalne efekty poznawcze zastosowanych terapii w zakresie uczenia się.
Wnioski
- Labirynt wodny Morrisa jest skutecznym narzędziem do badania uczenia się przestrzennego.
- Pozwala on na uzyskanie informacji na temat zaburzeń poznawczych oraz efektów stosowanego leczenia.
- Staranne obchodzenie się z myszami jest niezbędne dla uzyskania wiarygodnych wyników.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Labirynt wodny Morrisa (MWM) jest podstawowym testem behawioralnym służącym do ilościowej oceny uczenia się i pamięci zależnej od hipokampa w modelach gryzoni, co bezpośrednio wspiera walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Jego zdolność do wyraźnego rozróżnienia między pamięcią przestrzenną a nieprzestrzenną umożliwia wysoką pewność oceny deficytów poznawczych oraz efektów interwencji terapeutycznych w systemach modelowych choroby Alzheimera. Ilościowe wyniki i powtarzalność MWM sprawiają, że jest on krytycznym punktem zwrotnym w procesie rozwoju kandydatów przedklinicznych w portfolio neurofarmakologicznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczną weryfikację hipotez terapeutycznych ukierunkowanych na funkcje hipokampa.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez odróżnienie deficytów uczenia się przestrzennego od ogólnych problemów z wydajnością.
- Zapewnia funkcjonalną walidację celu poprzez mierzalne punkty końcowe behawioralne.
- Ułatwia przewidywanie skuteczności w wyborze modeli i priorytetyzacji portfela w przypadku wskazań neuropoznawczych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane systemy behawioralne do późniejszego przesiewania związków w modelach choroby Alzheimera.
- Dostarcza zestandaryzowanych, powtarzalnych i ilościowych miar, takich jak latencja ucieczki i długość ścieżki.
- Umożliwia przygotowanie testów do skalowalnej oceny wzmacniaczy poznawczych lub środków modyfikujących przebieg choroby.
- Wspiera niezawodne porównania międzybadawcze i międzyośrodkowe dzięki standaryzacji protokołu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica przedkliniczne punkty końcowe zachowania z domenami poznawczymi istotnymi dla choroby w badaniach nad chorobą Alzheimera.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkrywania po przedkliniczną walidację kandydatów na leki.
- Zapewnia kryteria postępu skorygowane o ryzyko, oparte na solidnych i istotnych translacyjnie wynikach.
- Wzmacnia predykcyjne ograniczanie ryzyka w późnych etapach rozwoju poprzez powiązanie fenotypów behawioralnych z hipotezami mechanistycznymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
MWM znajduje się na styku wczesnego etapu odkrywania, identyfikacji związków wiodących oraz walidacji przedklinicznej w procesach opracowywania leków na zaburzenia neuropoznawcze.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków dla mechanizmów pamięci zależnej od hipokampa.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty behawioralne do oceny związków.
- Analityka: Generuje dane dotyczące latencji ucieczki, długości ścieżki i zajętości kwadrantu w celu przeprowadzenia rzetelnego porównania statystycznego.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki przedkliniczne z klinicznymi punktami końcowymi funkcji poznawczych w chorobie Alzheimera.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Służy jako wielokrotnego użytku platforma behawioralna w wielu modelach chorób neurodegeneracyjnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów poznawczych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne oceny behawioralne.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez ograniczanie ryzyka w przypadku kandydatów we wczesnej fazie badań.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój terapeutyków neuropoznawczych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w dziedzinie neuronauki behawioralnej oraz w obchodzeniu się ze zwierzętami w celu zminimalizowania zakłóceń wywołanych stresem.
- Wymaga skalibrowanej aparatury oraz oprogramowania do automatycznego śledzenia w celu dokładnego rejestrowania danych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów i kontroli środowiskowych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja metody dla różnych szczepów myszy i modeli transgenicznych może wymagać optymalizacji protokołu.
- Czynniki środowiskowe, takie jak hałas, temperatura i oświetlenie, muszą być ściśle kontrolowane w celu zapewnienia integralności danych.
