Name: Test wyciszania genów indukowany wirusem Agrobacterium w bawełnie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Poznaj technikę VIGS w bawełnie do analizy funkcji genu GrCLA1 przy użyciu wektorów TRV i Agrobacterium. Obserwuj albinotyczny fenotyp w siewkach w ciągu dwóch tygodni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni dr. S.P. Dinesh-Kumarowi i dr. Yule Liu za wektory TRV-VIGS, a także dr. Chuckowi Kenerleyowi, Terry'emu Wheelerowi, Jimowi Starrowi oraz firmie Bayer CropScience za udostępnienie nasion bawełny. Praca ta była finansowana przez NSF dla L.S. oraz NIH dla P.H.

1. Hodowla siewek bawełny
<ol>
 <li>Wysiać nasiona bawełny wysokopiennej (Gossypium hirsutum) odmian Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR oraz Deltapine 90 w doniczkach (o średnicy 7 cm) zawierających podłoże Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, WA).</li>
 <li>Doniczki przechowywać w tacy przykrytej plastikową kopułą w temperaturze 23°C, przy natężeniu światła 120 μE m-2 S-1 i fotoperiodzie 12 godzin światła / 12 godzin ciemności w pomieszczeniu wzrostowym.</li>
 <li>Zdjąć kopułę po wykiełkowaniu dwóch liści przysadznych.</li>
 <li>Około dwa tygodnie później wykorzystać rośliny z dwoma w pełni rozwiniętymi liśćmi przysadznymi do testu VIGS. Na tym etapie liście właściwe nie wykształciły się jeszcze (Rysunek 1).</li>
</ol>
2. Konstrukcja wektora VIGS przenoszącego gen GrCLA1
<ol>
 <li>Przeprowadzić amplifikację genu Cloroplastos alterados 1 bawełny (GrCLA1) metodą PCR z użyciem starterów GrCLA1-F, 5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3' oraz GrCLA1-R, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3', wykorzystując bibliotekę cDNA z tkanek liści G. raimondii. </li>
 <li>Produkty PCR GrCLA1 poddać trawieniu enzymami EcoRI i KpnI, a następnie wprowadzić do wektora pYL156 (pTRV-RNA2) poprzez ligację.</li>
 <li>Przesiać klony na płytkach z agarem LB zawierającym 50 μg/mL kanamycyny. Zweryfikować konstrukty za pomocą trawienia enzymami restrykcyjnymi oraz sekwencjonowania.</li>
 <li>Przenieść plazmid do szczepu Agrobacterium tumefaciens GV3101 metodą elektroporacji i inkubować w celu regeneracji w płynnym medium LB w temperaturze 28°C. Wyselekcjonować transformanty na płytkach z LB+kanamycyną (50 μg/mL) + gentamycyną (25 μg/mL). Bakterie można przechowywać w 25% glicerolu w temperaturze –80°C do długotrwałego użytku.</li>
</ol>
3. Przeprowadzenie inokulacji VIGS
<ol>
 <li>Na trzy dni przed inokulacją wysiać metodą kreskową zamrożone zapasy glicerolowe Agrobacterium tumefaciens niosące pYL192 (TRV):RNA1, pYL156 (TRV):RNA2 (sam wektor) oraz pYL156 (TRV):RNA2-GrCLA1 na płytki z agarem LB zawierającym 50 μg/mL kanamycyny i 25 μg/mL gentamycyny. Inkubować płytki w temperaturze 28°C przez 24 godziny.</li>
 <li>Na dwa dni przed infiltracją VIGS wybrać pojedynczą kolonię dla każdego konstruktu z powyższych płytek i zaszczepić ją do 5 mL medium LB uzupełnionego o 50 μg/mL kanamycyny i 25 μg/mL gentamycyny; hodować kulturę bakteryjną w temperaturze 28°C przez noc w bębnie obrotowym przy prędkości 50 rpm.</li>
 <li>Przenieść powyższą kulturę do kolby z 50 mL medium LB uzupełnionego o 50 μg/mL kanamycyny i 25 μg/mL gentamycyny, a także 10 mM MES (kwas 2-(4-morfolino)etanosulfonowy) i 20 μM acetosyringonu. Hodować kulturę w temperaturze 28°C przez noc w inkubatorze wytrząsowym przy prędkości 50 rpm.</li>
 <li>Następnego dnia odwirować komórki agro-bakteryjne przy 4000 rpm przez 5 minut; zawiesić kulturę ponownie w buforze do infiltracji zawierającym 10 mM MgCl2, 10 mM MES i 200 μM acetosyringonu. Dostosować OD 600 kultury do wartości 1,5.</li>
 <li>Pozostawić kulturę na blacie w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.</li>
 <li>Przed infiltracją agro-bakteryjną nakłuć dolną stronę liści zakotwiczeniowych roślin bawełny igłą 25 G, nie przebijając liści na wylot. W każdej sekcji liścia zakotwiczeniowego wykonano jeden lub dwa otwory (zależnie od miękkości tkanki) (Rysunek 2).</li>
 <li>Zmieszać zawiesinę kultury agro-bakteryjnej pYL192 (TRV):RNA1 oraz pYL156 (TRV):RNA2 lub pYL156 (TRV):RNA2-GrCLA1 w stosunku 1:1; infiltrować mieszaninę ręcznie od strony dolnej liści zakotwiczeniowych przez miejsca zranień, używając strzykawki 1 mL bez igły (Rysunek 3).</li>
 <li>Przykryć rośliny plastikową kopułą i pozostawić infiltrowane rośliny w temperaturze pokojowej w warunkach przyćmionego światła przez noc.</li>
 <li>Przenieść rośliny do pomieszczenia wzrostowego o temperaturze 23°C, natężeniu światła 120 μE m-2 S-1 z cyklem 12 godzin światła / 12 godzin ciemności.</li>
</ol>
Uwaga: VIGS działa, gdy rośliny znajdują się w temperaturze 23°C lub w szklarni (25-28°C). Przy stosunkowo niskiej temperaturze (23 do 25°C) inokulacja jest łatwiejsza, a fenotyp bardziej jednolity w porównaniu z temperaturami wyższymi (28-30°C) lub wahającymi się. Przykrycie roślin kloszem również zwiększa efektywność VIGS.
<ol start="10">
 <li>Ocenić fenotyp wyciszenia w 7–8 dni po infiltracji. Liście prawdziwe roślin wyciszonych za pomocą pYL156 (TRV):RNA2-GrCLA1 zaczęły wykazywać fenotyp albinizmu (Rysunek 4). Rośliny infiltrowane Agrobacterium niosącymi pYL156 (TRV): RNA2 służą jako kontrola.</li>
 <li>Zweryfikować wydajność wyciszania genów poprzez badanie poziomu ekspresji genów endogennych za pomocą reakcji polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), wykorzystując RNA wyizolowane z kontrolnych i wyciszonych roślin bawełny.</li>
</ol>
Uwaga: Rośliny poddane VIGS należy przechowywać w warunkach kontrolowanej kwarantanny, a po zakończeniu analiz powinny zostać poddane odpowiedniej autoklawacji i utylizacji, ponieważ TRV charakteryzuje się szerokim zakresem gospodarzy i jest patogenem podlegającym obowiązkowi zgłaszania.
4. Reprezentatywne wyniki:
Około dwóch tygodni po infiltracji ręcznej mieszaniną Agrobacterium, na liściach właściwych wyraźnie zaobserwowano fenotyp albinizmu wywołany wyciszeniem GrCLA1. Efektywność wyciszenia osiągnęła prawie 100% w wielu eksperymentach przeprowadzonych na ponad 50 roślinach. Rośliny z wyciszonym genem wykazują jednorodnie rozłożony i bardzo silny fenotyp albinizmu na nowo rozwijających się liściach oraz mozaikę na liściach starszych (Rycina 4).
<img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig1.jpg" alt="Wzrost siewki w glebie; badanie rozwoju roślin, eksperyment wczesnego etapu kiełkowania." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Siewka bawełny w wieku około dwóch tygodni z dwoma w pełni rozwiniętymi liśćmi zasadniczymi, wykorzystana do infiltracji Agrobacterium.
<img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig2.jpg" alt="Eksperyment z sekcją liścia; przygotowanie do mikroskopii; metoda badania botanicznego; obchodzenie się z próbką." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wykonywanie niewielkich otworów na spodniej stronie liści zasiedlonych bawełny za pomocą igły 25 G w celu ułatwienia infiltracji Agrobacterium.
<img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig3.jpg" alt="Eksperyment roślinny; strzykawka wstrzykująca do liścia; badanie wzrostu; oznakowane doniczki; badania w szklarni." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Ręczna infiltracja mieszaniny Agrobacterium do liści zasadniczych bawełny poprzez miejsca zranienia przy użyciu strzykawki bez igły
<img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig4.jpg" alt="Badanie zmienności genetycznej roślin; eksperyment nad mutacją chlorofilu; porównanie wzrostu roślin liściastych." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Fenotyp albinizmu wystąpił u roślin bawełny poddanych wyciszaniu VIGS. Przedstawiono cztery odmiany. A) Fibermax 832; B) Phytogen 480WR; C) Phytogen 425RF; D) Deltapine 90.

<ol><li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+sequencing+cotton+%28Gossypium%29+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li>
<li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li>
<li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li>
<li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li>
<li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li>
<li>Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+expression+of+CLA1%2C+a+gene+that+encodes+the+1-deoxyxylulose+5-phosphate+synthase+of+the+2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).</li>
<li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLA1%2C+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development%2C+is+highly+conserved+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li>
<li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Wykazano, że VIGS jest potężnym narzędziem w analizie genomiki funkcjonalnej poprzez przejściowe wyciszanie ekspresji genów endogennych. W niniejszym badaniu opracowaliśmy metodę VIGS zapośredniczoną przez Agrobacterium z wykorzystaniem wektora binarnego opartego na TRV. Gen CLA1 (GrCLA1) bawełny został opracowany jako marker wizualny do monitorowania wydajności wyciszania. Konsekwentnie uzyskiwaliśmy 100% wydajności wyciszania genów, co przejawiało się fenotypem albinizmu pojawiającym się na liściach w...

<table><tbody><tr><td>Bęben obrotowy</td><td>Glas-Col</td><td>099A TC108</td><td>Kultura Agro-bacterium</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Sheldon Manufacturing, Inc.</td><td>01046209</td><td>Kultura Agro-bacterium</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV/Vis</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Model: DU530</td><td>Pomiar OD</td></tr><tr><td>Elektroporator Gene Pulser</td><td>Bio-Rad</td><td>Model: 1652076; Serial: 154BR3880</td><td>Elektroporacja</td></tr><tr><td>Kontroler impulsora</td><td>Bio-Rad</td><td>Model: 1652098; Serial: 232BR4833</td><td>Elektroporacja</td></tr><tr><td>Kuweta do elektroporacji Micropulser</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2081</td><td>Elektroporacja</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>30962</td><td>Inokulacja agro-bacterium</td></tr><tr><td>Metro Mix 700</td><td>SUNGR</td><td>SKU# 553001</td><td>Wzrost siewek</td></tr><tr><td>Doniczka terakotowa</td><td>T.O.Plastics</td><td>GPS 3001B2</td><td>Wzrost siewek</td></tr><tr><td>MES monohydrat</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>18886</td><td>Bufor do infiltracji</td></tr><tr><td>Acetosyringon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td>Bufor do infiltracji</td></tr></tbody></table>

analiza wyciszania genów indukowanego wirusem za pośrednictwem agrobacterium w bawełnie

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Bawełna (Gossypium hirsutum) jest jedną z najważniejszych roślin uprawnych na świecie. Podjęto znaczne wysiłki w zakresie hodowli molekularnej nowych odmian. Wielkoskalowa analiza funkcjonalna genów bawełny pozostaje w tyle za większością nowoczesnych gatunków roślin, prawdopodobnie ze względu na duży rozmiar genomu, duplikacje genów i poliploidię, długi cykl wzrostu oraz trudności w transformacji genetycznej1. Aby ułatwić wysokoprzepustowe badania genetyczne i genomiczne u bawełny, dążymy do opracowania szybkich i wydajnych testów przejściowych do oceny funkcji genów bawełny.
Wyciszanie genów indukowane wirusowo (VIGS) to potężna technika opracowana na podstawie posttranskrypcyjnego wyciszania genów (PTGS) gospodarza w celu hamowania proliferacji wirusów2,3. VIGS zapośredniczony przez Agrobacterium został z sukcesem zastosowany w szerokim zakresie gatunków dwuliściennych, takich jak Solanaceae, Arabidopsis i gatunki strączkowe, a także gatunków jednoliściennych, w tym jęczmienia, pszenicy i kukurydzy, w różnych badaniach genomiki funkcjonalnej3,4. Ponieważ to szybkie i wydajne podejście pozwala uniknąć transformacji roślin i pokonuje redundancję funkcjonalną, jest ono szczególnie atrakcyjne i odpowiednie do badań genomiki funkcjonalnej u gatunków uprawnych, takich jak bawełna, które nie nadają się do transformacji.
W niniejszym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół systemu VIGS za pośrednictwem Agrobacterium w bawełnie. spośród kilku wirusowych wektorów VIGS, wirus rzęsy tytoniu (TRV) infekuje szerokie spektrum gospodarzy i potrafi intensywnie rozprzestrzenić się w całej roślinie, wywołując jednocześnie łagodne objawy u gospodarzy5. W celu monitorowania wydajności wyciszania, gen GrCLA1, homolog genu Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 (AtCLA1) w bawełnie, został sklonowany i wprowadzony do binarnego wektora VIGS pYL156. Gen CLA1 bierze udział w rozwoju chloroplastów6, a wcześniejsze badania wykazały, że utrata funkcji AtCLA1 prowadzi do powstania fenotypu albinistycznego na liściach właściwych7, co stanowi doskonały marker wizualny dla wydajności wyciszania. Około dwóch tygodni po infiltracji Agrobacterium, na liściach właściwych zaczął pojawiać się fenotyp albinistyczny, przy 100% wydajności wyciszania we wszystkich powtórzonych eksperymentach. Wyciszenie ekspresji genu endogennego zostało również potwierdzone analizą RT-PCR. Co istotne, wyciszanie mogło skutecznie zachodzić we wszystkich testowanych przez nas kultywarach, w tym w różnych odmianach uprawianych komercyjnie w Teksasie. Ten szybki i wydajny test VIGS za pośrednictwem Agrobacterium stanowi bardzo potężne narzędzie do szybkiej, wielkoskalowej analizy funkcji genów na poziomie całego genomu w bawełnie.

Przedstawiamy szczegółowy protokół badania wyciszania genów indukowanego wirusem (VIGS) za pośrednictwem Agrobacterium w bawełnie. Do indukowania wyciszania RNA genu GrCLA1 (Cloroplastos alterados 1) bawełny wykorzystano wektory VIGS pochodzące z wirusa TRV (tobacco rattle virus). Albino fenotyp wywołany wyciszeniem GrCLA1 zaobserwowano w stadium siewki w ciągu 2 tygodni po inokulacji.

Analiza wyciszania genów indukowanego wirusem za pośrednictwem Agrobacterium w bawełnie

Bawełna (Gossypium hirsutum) jest jedną z najważniejszych roślin uprawnych na świecie. Podjęto znaczne wysiłki w zakresie hodowli molekularnej nowych odmian. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie testu wyciszania genów indukowanego wirusem za pośrednictwem bakterii z rodzaju Agrobacterium w bawełnie w celu zbadania funkcji genów. Jest to realizowane poprzez uprawę siewek bawełny do stadium od 10 dni do dwóch tygodni. Następnie gen rados1 z chloroplastów bawełny jest klonowany do wektora VIGS opartego na wirusie mozaiki tytoniu (tobacco rattle virus).Trzecim krokiem jest przygotowanie kultur agrobacterium zawierających P-T-R-V-R-N-A one oraz P-T-R-V-G-R-C-A one. Ostatnim etapem jest ręczna inokulacja kultur agrobacterium do bawełnianych kotyledonów. Ostatecznie wyniki wyciszenia genu można potwierdzić, obserwując fenotyp albinizmu na liściach właściwych roślin bawełny po około dwóch tygodniach.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transformacja, jest to, że VIGs zapewnia szybką i wydajną platformę do badania funkcji genów u bawełny. Choć metoda ta może okazać się potężnym narzędziem do szybkiej, wielkoskalowej analizy funkcji genów na poziomie całego genomu bawełny, można ją zastosować również do innych ważnych gatunków roślin uprawnych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ ręczna inokulacja kultur agrobacterium oraz kiełków bawełny jest wymagająca.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie genetyki i genomiki bawełny, na przykład podczas badania funkcji genów. Aby wyhodować siewki bawełny do wyciszania genów indukowanego wirusem, należy wsypać podłoże Metro Mix 700 do kilku doniczek o średnicy 7 cm i umieścić wypełnione doniczki w tacy. Następnie należy zasiać nasiona kilku odmian bawełny wysokorosnącej (upland cotton), takich jak FiberMax 832 PhytoGen 4, 25 RF PhytoGen 4 80 WR oraz Delta Pine 90.W przygotowanych doniczkach przykryć tacę z doniczkami plastikową kopułą i umieścić tacę w pomieszczeniu wzrostowym, w temperaturze 23 °C, przy natężeniu światła 120 µEinsteins/m²/s i fotoperiodzie 12 godzin światła oraz 12 godzin ciemności. Po trzech do czterech dniach, gdy wykiełkują dwa liścienie, zdjąć plastikową kopułę. Pozostawić rośliny bawełny do wzrostu przez około 10 dni, aż osiągną stadium, w którym rozwiną się dwa w pełni rozszerzone liścienie, lecz przed pojawieniem się liści właściwych. Rośliny są wówczas gotowe do wykorzystania w teście wyciszania genów indukowanego wirusem.Poniższe procedury klonowania należy przeprowadzić w okresie dwóch tygodni, kiedy rośliny bawełny osiągają stadium pełnego rozkwitu liści. Najpierw, zgodnie ze standardowymi procedurami PCR, należy przeprowadzić amplifikację genu cotton chloroplasts one z biblioteki cDNA tkanek liści CACI remondi, wykorzystując primery podane w protokole pisemnym. Następnie produkt PCR GCA one należy poddać trawieniu enzymami Echo R one i K PN one zgodnie z protokołami producenta enzymów.Wizualizuj produkt PCR o długości 500 par zasad na żelu z bromkiem etydyny. Wytnij prążek i wyizoluj DNA, a następnie liguj oczyszczony produkt PCR do wektora PYL 1 56. Używając ligazy T4 DNA, przeprowadź transformację kompetentnych komórek E. coli wektorem z ligacją, a następnie wysiej od 10 do 50 µL transformowanych komórek na płytki z agarem LBA zawierającym 50 µg/mL kanamycyny.Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia wybierz kolonie z płytki i hoduj je przez noc w 2 mL bulionu LB zawierającego 50 µg/mL kanamycyny. Zbierz bakterie poprzez wirowanie i przeprowadź izolację DNA zgodnie ze standardowymi procedurami. Aby oczyścić plazmidowe DNA, zweryfikuj konstrukty za pomocą trawienia enzymami restrykcyjnymi oraz sekwencjonowania.Po potwierdzeniu obecności i orientacji wstawki w wektorze PYL 1 56, przeprowadź elektroporację plazmidu do szczepu Agrobacterium tumefaciens GV 3 1 0 1 i przeprowadź regenerację w płynnej pożywce LB w temperaturze 28 °C. Transformanty wyselekcjonuj na płytkach z agarem LB zawierającym 50 µg/mL kanamycyny i 25 µg/mL gentamycyny. W razie potrzeby bakterie można przechowywać w 25% glicerolu w temperaturze -80 °C.Na trzy dni przed inokulacją wykonaj posiew smugowy zamrożonych w glicerolu szczepów agrobacterium tumor facies niosących PYL 1 9 2 RNA one PY, 1 56 RNA two oraz PY 1 56 RNA two GLA one na płytki agarowe LB z antybiotykiem; inkubuj płytki w temperaturze 28 degrees Celsius przez 24 godziny. Następnego dnia wybierz pojedynczą kolonię dla każdego konstruktu i zaszczep każdą kolonię do 5 mL medium LB uzupełnionego o 50 µg/mL kanamycyny i 25 µg/mL gentamycyny.Kulturę bakteryjną inkubować przez noc w temperaturze 28°C w inkubatorze wytrząsowym ustawionym na prędkość 50 obr./min. Przenieść kulturę PYL 1 56 RNA two GLA one oraz kultury kontrolne do osobnych kolb zawierających 50 ml pożywki LB uzupełnionej o 50 µg/ml kanamycyny i 25 µg/ml gentamycyny oraz 10 mM MES i 20 µM acetocyringu. Inkubować kulturę przez noc w temperaturze 28°C w inkubatorze wytrząsowym ustawionym na prędkość 50 obr./min.Następnego dnia przenieś kultury do probówek wirówkowych i odwiruj komórki bakterii agrobacterium z prędkością 4 000 obr./min przez pięć minut, a następnie resuspenduj kulturę w buforze do infiltracji zawierającym 10 mM chlorku magnezu, 10 mM MES oraz 200 µM acetosyryny. Zmierz OD 600 kultury i dostosuj ją do wartości 1,5 za pomocą buforu do infiltracji. Inkubuj kulturę na blacie w temperaturze pokojowej przez trzy godziny przed infiltracją liści bakteriami agrobacterium.Wykonać nakłucia od spodu nerwu głównego liści rośliny bawełny za pomocą igły 25G, uważając, aby nie przebić nerwu na wylot. W każdej sekcji nerwu głównego należy wykonać jeden lub dwa otwory. Następnie zmieszać kulturę agrobakterii PYL 1 92 RNA one z kulturą PYL 1 56 RNA two lub PY 1 56 RNA two GRCA one w stosunku jeden do jednego.Następnie, używając igły lub strzykawki o pojemności 1 ml, wprowadź mieszaninę do dolnej części łodyżek rośliny przez wykonane otwory. Przykryj rośliny plastikową kopułą i pozostaw zinfiltrowane rośliny w temperaturze pokojowej, w warunkach przyćmionego światła, na noc.Przenieś rośliny do pomieszczenia wzrostowego o temperaturze 23 °C, przy natężeniu światła 120 µE m⁻² s⁻¹ i cyklu 12 godzin światła oraz 12 godzin ciemności. Oceń fenotyp wyciszenia od siedmiu do ośmiu dni po infiltracji. W tym czasie liście właściwe roślin, w których wyciszono PY 1 56 RNA two GLA one, zaczynają wykazywać fenotyp albinizmu.Rośliny infiltrowane agrobakteriami niosącymi PYL 1 56 RNA two służą jako kontrola. Wydajność wyciszania genów należy zweryfikować poprzez badanie poziomu ekspresji genów endogennych przy użyciu reakcji RT-PCR z RNA wyizolowanym z kontrolnych i wyciszonych roślin bawełny zgodnie ze standardowymi procedurami.Na tym zdjęciu przedstawiono odmianę fiber max 8 3 2 po wyciszeniu genu GLA one indukowanym przez wirusy. Należy zwrócić uwagę na białe liście, w których doszło do wyciszenia genu. Odmiana PHYTO four 80 WR również wykazuje fenotyp albinotyczny po wyciszeniu genu indukowanym przez wirusy.Podobnie, ta odmiana phyto 4 2 5 RF wykazuje białe liście w miejscach, w których nastąpiło wyciszenie genów indukowane wirusem. Na koniec, ten obraz przedstawia kolejny udany eksperyment wyciszania genów indukowanego wirusem, tym razem w odmianach Delta PINE 90. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o dodaniu acetonu do kultur agrobacterium przed pozostawieniem ich na stole laboratoryjnym na trzy godziny po wykonaniu tego etapu.Następnie można zastosować inne metody, takie jak klonowanie biblioteki cDNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. zbadać nowe funkcje genów po ich opracowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie genetyki roślin do analizy funkcji genów oraz odpowiedzi obronnej na stresy biotyczne i abiotyczne w roślinach uprawnych o dużym znaczeniu gospodarczym. Po uzyskaniu danych, technika ta może zostać zrealizowana w ciągu dwóch do trzech dni, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić wyciszanie genów indukowane wirusem u bawełny.

agrobacterium-mediated-virus-induced-gene-silencing-assay-in-cotton

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test ciszenia genów indukowanych wirusem pośredniczony przez Agrobacterium w bawełnie

Opis metody wyciszania genów indukowanego wirusem (VIGS) w celu obniżenia ekspresji genów u Nicotiana benthamiana oraz pomidora.

Wyciszanie genów indukowane wirusem (VIGS) u Nicotiana benthamiana i pomidora

Źródło: Shi, J. i inni. Przesiewowe badania i identyfikacja supresorów tłumiących RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje test współinfiltracji w celu identyfikacji białek efektorowych patogenów, które hamują wyciszanie RNA w Nicotiana benthamiana 16c. Fluorescencjonujący raport oraz gen efektorowy kandydatów są dostarczane do liści rośliny za pomocą Agrobacterium. Zazwyczaj wyciszanie RNA degraduje transkrypcje reporterów, zmniejszając...

Badanie współinfiltracyjne w celu wykrywania efektorów patogenów tłumiących wyciszanie RNA roślin

Źródło: Shi, J. i in., Przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje procedurę przygotowania hodowli Agrobacterium tumefaciens poprzez indukowanie ekspresji genów za pomocą acetosyringonu, a następnie usunięcie antybiotyku poprzez płukanie i ponowną zawiesinę, aby wygenerować zawieszenie gotowe do transformacji do dostarczania genów do tkanek roślinnych.

Przygotowanie kultury Agrobacterium do dostarczania genów do komórek roślinnych

Źródło: Beernink, B. M. i in. Bezpośrednia agroinokulacja sadzonek kukurydzy poprzez wstrzyknięcie klonów zakaźnych wirusa mozaiki lisogona oraz wirusa mozaiki trzciny cukrowej. J. Vis. Exp. (2021)Ten film demonstruje dostarczanie rekombinowanych klonów wirusowych za pośrednictwem Agrobacterium do siewek kukurydzy w celu wyciszenia genów. Opisuje proces zakażenia Agrobacterium , systemowe rozprzestrzenianie się wirusa oraz zmiany fenotypowe wywołane interferencją RNA.

Dostarczanie rekombinowanych klonów wirusowych za pośrednictwem agrobakterii do siewek kukurydzy w celu wyciszenia genów

Wyciszanie genów wywołane przez wirusa jest użytecznym narzędziem do identyfikacji genów zaangażowanych w odporność roślin na brak gospodarza. Pokazujemy zastosowanie patogenów bakteryjnych eksprymujących GFPuv w identyfikacji roślin wyciszonych genowo podatnych na patogeny niebędące gospodarzem. Takie podejście jest łatwe, szybkie i ułatwia badania przesiewowe na dużą skalę, a podobny protokół można zastosować do badania różnych innych interakcji roślina-mikroorganizm.

Badania przesiewowe genetyki za pośrednictwem VIGS w celu identyfikacji genów zaangażowanych w oporność na zwierzęta inne niż gospodarz

Produkcja białka przejściowego w roślinach Nicotiana oparta na infiltracji próżniowej za pomocą agrobakterii przenoszących wektory startowe (oparte na wirusie mozaiki tytoniu) jest szybkim i ekonomicznym podejściem do produkcji antygenów szczepionkowych i białek terapeutycznych. Uprościliśmy procedurę i poprawiliśmy akumulację celu, optymalizując warunki hodowli bakterii, dobierając gatunki gospodarzy i współwprowadzając supresory wyciszające RNA.

Optymalizacja i wykorzystanie produkcji białek przejściowych za pośrednictwem Agrobacterium w Nicotiana

Opracowaliśmy prosty i efektywny protokół do przygotowania dużych ilości protoplastów soi do badania złożonych mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach.

Prosta metoda izolacji protoplastów soi i zastosowanie do analiz przejściowej ekspresji genów

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę przesiewową, która może być szeroko stosowana do szybkiego badania przesiewowego supresorów wyciszających RNA u patogenów roślinnych.

Badania przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych

Przedstawiono protokół iniekcji (agroiniekcji) oparty na Agrobacterium do inokulacji wirusa mozaiki czyńca i klonów wirusa mozaiki trzciny cukrowej do siewek kukurydzy. Inokulacja w ten sposób prowadzi do infekcji wirusowej, wywołanego przez wirusa wyciszenia genów markerowych i nadekspresji wirusa GFP.

Bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy przez wstrzyknięcie rekombinowanym wirusem mozaiki wyczyńca i zakaźnymi klonami wirusa mozaiki wyczyńca cukrowego

Tutaj prezentujemy protokół do wysokowydajnej produkcji transgenicznych korzeni owłosionych soi.

Transformacja owłosionych korzeni soi w celu analizy funkcji genów

Tutaj prezentujemy pierwszy protokół miejscowej infiltracji próżniowej do badań in vivo genetycznej transformacji dużych roślin. Korzystając z tej metodologii, po raz pierwszy uzyskaliśmy przejściową transformację kakao za pośrednictwem Agrobacterium.

Agroinfiltracja wymuszona próżnią w celu transformacji in planta roślin opornych: kakao jako studium przypadku

Poznaj technikę VIGS w bawełnie do analizy funkcji genu GrCLA1 przy użyciu wektorów TRV i Agrobacterium. Obserwuj albinotyczny fenotyp w siewkach w ciągu dwóch tygodni.

Analiza wyciszania genów indukowanego wirusem za pośrednictwem Agrobacterium w bawełnie

Przeglądaj więcej filmów