Name: Manipulacja genetyczna za pośrednictwem lentiwirusa i wizualizacja węchowych neuronów czuciowych in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Poznaj metodę mikroiniekcji lentiwirusa do wizualizacji pojedynczych neuronów węchowych in vivo. Technika ta umożliwia badanie trajektorii aksonów i morfologii terminalnych w układzie węchowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badanie jest finansowane z grantów NIH DC052256 i DC006015 oraz NSF 0324769 przyznanego QG oraz T32-DC008072 przyznanego BS.

1. Przygotowanie
Procedura ta jest przeprowadzana w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2, dlatego wszystkie poniższe przygotowania są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza do pracy z materiałem biologicznym, w której odbywa się procedura mikroiniekcji.
<ol>
	<li>Przygotować i rozgrzać łaźnię wodną o temperaturze 37°C: wypełnić plastikowy worek do przechowywania wodą – zamknąć go i umieścić na pustym inkubatorze blokowym. Umożliwi to myszom rekonwalescencję po iniekcji.</li>
	<li>Wypełnić pojemnik na odpady biologiczne 10% roztworem wybielacza w objętości odpowiedniej do zanurzenia wszystkich odpadów powstałych podczas tej procedury.</li>
	<li>Przygotować małe otwarte naczynie z 70% etanolem oraz drugie naczynie ze sterylną wodą ddH2O i umieścić je w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Zsterylizować strzykawkę Hamiltona o pojemności 5μL z igłą o rozmiarze 33G, spryskując korpus i igłę 70% etanolem przy całkowicie wysuniętym tłoku. Wielokrotnie aspirując etanol z naczynia i całkowicie go wypychając, powtórzyć czynność co najmniej 5 razy.</li>
	<li>Przepłukać wkład strzykawki, aspirując i wypychając sterylną wodę co najmniej 5 razy. Odłożyć strzykawkę w bezpieczne miejsce w dygestorium i pozostawić do wyschnięcia.</li>
	<li>Wyjąć zapasy wirusa z zamrażarki -80°C i umieścić na lodzie w celu rozmrożenia. Do mikroiniekcji wymagane są 2μL zapasu wirusa na mysz przy mianie 109 jednostek zakaźnych/mL. Lentiwirusy można pozyskać z komercyjnych źródeł lub wyprodukować w laboratorium zgodnie z ustalonym protokołem (Lois et al., 2002).</li>
	<li>Przygotować platformę do iniekcji, która zapewni obszar podniesiony ponad powierzchnię dygestorium – można wykorzystać 10cm szalkę hodowlaną przykrytą arkuszem chusteczki Kimwipe.</li>
	<li>Umieścić chusteczki nasączone alkoholem w pobliżu stanowiska do iniekcji.</li>
</ol>
2. Mikroiniekcja cząsteczek lentiwirusowych do nabłonka węchowego
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt przeprowadzone w tej metodzie zostały wykonane zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez IACUC. Modelem zwierzęcym wykorzystanym we wszystkich zaprezentowanych tutaj eksperymentach jest szczep C57BL/6J myszy Mus musculus.
<ol>
	<li>Znieczul młode myszy poprzez hipotermię, wyjmując szczenię (P0-P3) z klatki i kładąc je na rozciętej rękawiczce na lodzie na 5 minut.</li>
	<li>Oczekując na pełne znieczulenie szczenięcia, pobierz 2μL zapasu wirusa do wysterylizowanej strzykawki Hamiltona.</li>
	<li>Umieść młodą mysz na platformie do iniekcji. Delikatnie odciągnij skórę od czubka głowy w okolicy ucha w stronę karku. Powinno to napiąć skórę nad jamą nosową, co ułatwi iniekcję.</li>
	<li>Wprowadź igłę przez górną część jamy nosowej około 3mm poniżej powierzchni skóry, aby dotrzeć do nabłonka węchowego. Wykonaj mikroiniekcję 0,5μL roztworu wirusa na jeden wstrzyk, wybierając dwa miejsca na każdą stronę, lewą i prawą (łącznie cztery iniekcje na mysz = wymagane 2μL wirusa). Miejsca iniekcji powinny być rozmieszczone w odstępach od siebie. Aby precyzyjnie wyznaczyć miejsca wstrzykiwania, zlokalizuj na grzbietowej powierzchni czaszki obrys opuszki węchowej. Linia ta jest ledwo widoczna po urodzeniu przez półprzezroczystą skórę i czaszkę. Aby wykonać dwie iniekcje na stronę, skieruj pierwszą iniekcję tuż rostralnie od obrysu opuszki na osi przyśrodkowej. Drugie wkłucie wykonaj bocznie względem obrysu opuszki, jednak skieruj igłę przyśrodkowo, aby dotrzeć do nabłonka węchowego znajdującego się brzusznie pod opuszką. Unikaj przebicia opuszki węchowej!</li>
	<li>Osusz za pomocą chusteczki Kimwipe wszelkie pozostałości roztworu wirusa lub krwi, które mogą wypłynąć z miejsca iniekcji lub otworów nozdrzy. Zużyte chusteczki Kimwipe natychmiast wyrzuć do pojemnika na odpady biologiczne z rozcieńczonym wybielaczem.</li>
	<li>Umieść zainfekowaną mysz w inkubatorze z wodnym podłożem.</li>
	<li>Powtórz kroki 1-4 dla wszystkich myszy przeznaczonych do iniekcji, pamiętając, że na każdą mysz będziesz potrzebować około 2μL zapasu wirusa.</li>
	<li>Pozostaw myszy w inkubatorze z wodnym podłożem na 30 minut w celu rekonwalescencji przed powrotem do oryginalnej klatki gniazdowej.</li>
	<li>Platformę do mikroiniekcji, chusteczki dezynfekujące oraz wszelkie dodatkowe papierowe produkty do czyszczenia wyrzuć do utylizacji odpadów biologicznych z wybielaczem.</li>
	<li>Oczyść strzykawkę Hamiltona poprzez wielokrotne zasysanie i wyrzucanie etanolu, a następnie wody, zgodnie z procedurą przygotowania. Pozostaw strzykawkę do wyschnięcia.</li>
	<li>Aby uzyskać maksymalną wydajność transdukcji, powtórz tę procedurę za 4 godziny. Zainfekowane OSN można wizualizować na całej długości komórki już po trzech dniach.</li>
</ol>
3. Immunohistochemia w wolnopływających przekrojach opuszki węchowej
<ol>
	<li>Uśmierć wstrzykniętą mysz w wybranym punkcie czasowym i utrwal tkankę poprzez perfuzję 4% paraformaldehydem. Wypreparuj opuszki węchowe (OB). Inkubuj w paraformaldehydzie przez noc, a następnie w 30% sacharozie w PBS przez noc. Osadź w medium do zatapiania O.C.T. na suchym lodzie.</li>
	<li>Przekroje czołowe OB o grubości 60μm wykonaj przy użyciu kriotomu. Przenieś przekroje do 10cm szalki hodowlanej zawierającej 5mL 1x PBS (pH 7.4). Przekroje powinny swobodnie pływać w PBS, aby umożliwić rozpuszczenie O.C.T. Przenieś pływające przekroje wraz z PBS do 50mL probówki stożkowej.</li>
	<li>Pozostaw przekroje do opadnięcia na dno probówki. Odsącz PBS za pomocą odessania (vacuum), uważając, aby nie wciągnąć przekrojów. Przepłucz przekroje tkankowe 20mL PBS. Powtórz kroki osadzania i odsysania. Resuspenduj tkankę w 10mL PBS i przenieś pływające przekroje do 15mL probówki stożkowej w celu przeprowadzenia immunobarwienia. Po opadnięciu przekrojów tkankowych odessij nadsącz PBS, nie naruszając tkanki. Resuspenduj przekroje w 0,3% Triton X-100 w 1x PBS, pH 7.4 (PBS-Tx), aby detergent mógł perforować błony komórkowe. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessij nadsącz i powtórz inkubację z PBS-Tx dwukrotnie.</li>
	<li>Inkubuj przekroje tkankowe w 10mL roztworu blokującego (5% surowicy konia w PBS-Tx) przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepłucz roztwór blokujący co najmniej dwukrotnie w PBS-Tx po 15 minut każdy w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj 2mL roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w PBS-Tx. Listę przeciwciał użytych w tym eksperymencie znajduje się w sekcji Odczynniki i sprzęt.</li>
	<li>Zastąp drugie płukanie blokujące w PBS-Tx roztworem przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubuj na powolnej platformie kołyszącej (~30rpm) w temperaturze 4°C przez 24-48 godzin, aby zapewnić całkowitą penetrację do 60μm pływających przekrojów.</li>
	<li>Po inkubacji roztwór przeciwciała pierwszorzędowego można ostrożnie odzyskać za pomocą pipety i przechowywać w temperaturze 4°C w celu ponownego użycia do dwóch kolejnych razy w ciągu dwóch tygodni, bez znaczącej utraty intensywności barwienia.</li>
	<li>Przemyj przekroje trzykrotnie w PBS-Tx po 20 minut każdy w temperaturze pokojowej przy łagodnej rotacji (~30rpm).</li>
	<li>Przygotuj 2mL rozcieńczenia przeciwciała wtórnego w PBS-Tx. Odessij ostatni roztwór płuczący i dodaj roztwór przeciwciała wtórnego do przekrojów tkankowych. Owiń zewnętrzną stronę probówki do barwienia folią aluminiową, aby zablokować światło, które może powodować fotobielenie fluoroforów. Umieść owiniętą probówkę na powolnej platformie kołyszącej i inkubuj w temperaturze 4°C przez noc.</li>
	<li>Usuń roztwór przeciwciała wtórnego poprzez odsysanie. Przemyj przekroje raz w PBS-Tx przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przepłucz dodatkowo dwa razy w PBS (pH 7.4) po 20 minut każdy w temperaturze pokojowej. Zamocuj zabarwione przekroje tkankowe na szkiełkach przedmiotowych, używając Fluoromount G.</li>
	<li>Przeskanuj zabarwione przekroje w poszukiwaniu zainfekowanych dodatnio aksonów OSN i zakończeń aksonalnych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	<li>Aby stworzyć trójwymiarowy widok oznakowanego aksonu OSN i drzewa terminalnego, wykonaj serię przekrojów optycznych przez 60μm głębokości docelowego plasterka tkanki OB (wzdłuż osi z) przy użyciu mikroskopii konfokalnej.</li>
	<li>Ten stos obrazów z przekrojów Z może zostać następnie wspólnie rzutowany w celu zrekonstruowania perspektywy obrotowej 360° pojedynczego oznakowanego aksonu OSN, w tym pełnych szczegółów drzewa terminalnego. Dowolny pojedynczy kąt obrotu może zostać przechwycony i wyeksportowany jako plik obrazu (np. JPG, TIFF) do prezentacji w formacie 2D.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Stosując opisane tutaj metody, możemy transdukować neurony sensoryczne węchu za pomocą lentiwirusa in vivo. Do tej pory wizualizowaliśmy zainfekowane OSN za pomocą reporterów fluorescencyjnych GFP i mCherry, a także białka fuzyjnego z tagiem myc poprzez immunocytochemię. Technika ta zapewnia dużą liczbę zainfekowanych OSN. Jednocześnie transdukcja zachodzi na tyle sporadycznie, że pozwala na uzyskanie pojedynczo znakowanych OSN, co umożliwia analizę morfologii pojedynczych komórek. Aksony i zakończenia aksonalne są obrazowane w przekrojach tkanki OB w ich naturalnym środowisku za pomocą mikroskopii konfokalnej (Rycina 1). Całe drzewo zakończeń aksonalnych OSN można zazwyczaj uchwycić w obrębie przekroju optycznego o grubości 40-50μm. Duże powiększenie zakończeń aksonalnych zainfekowanych OSN pozwala na szczegółową analizę morfologii drzewa aksonalnego w warstwie kłębkowej.
<img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna tkanki nerwowej wykazująca markery OMP, VGluT2 i GFP w różnych kolorach." data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rysunek 1. Trajektoria aksonu pojedynczego neuronu sensorycznego węchu i jego rozgałęzienie końcowe. A) Przekrój czołowy opuszki węchowej myszy P7 wykazujący warstwę nerwu węchowego (ONL) immunobarwioną na OMP (czerwony) oraz warstwę kłębową (GL) immunobarwioną zarówno na OMP, jak i Vglut2 (szary). Pojedynczy akson neuronu sensorycznego węchu wykazujący ekspresję GFP (zielony) przebiega w obrębie ONL i wnika do struktury kłębka. B) Morfologia rozgałęzienia końcowego aksonu w obrębie kłębka wyraźnie zaznaczona ekspresją GFP. Współbarwienie Vglut2 w kolorze szarym oświetla całkowity obszar kłębka, w którym akson GFP-dodatni tworzy rozgałęzienie końcowe. C) Zainfekowane lentiwirusem neurony sensoryczne węchu (OSN) wykazujące ekspresję GFP (zielony) w nabłonku węchowym (OE). Cytostruktura nabłonka węchowego jest pokazana za pomocą barwienia DAPI (niebieski). Ekspresja GFP umożliwia wizualizację ciał komórkowych OSN oraz ich wypustek komórkowych w OE. D) Akson OSN i jego morfologia końcowa przy wyciszeniu ekspresji Rap1GAP2 za pomocą shRNA. Do OE podano lentiwirusy niosące podwójną kasetę ekspresyjną z shRNA Rap1GAP2 pod promotorem mysim U6 oraz GFP pod promotorem CMV. Zainfekowane zakończenia aksonów węchowych wykazywały bardziej uproszczone rozgałęzienie końcowe w porównaniu do kontroli z samym GFP. Pasek skali = 20μm.

<ol><li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li>
<li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb%3A+a+long-term+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otol+Rhinol+Laryngol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li>
<li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li>
</ol>

Niniejszy protokół jest zgodny z 2. poziomem bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2). W związku z tym wprowadzono odpowiednie środki dotyczące organizacji miejsca pracy, ochrony osobistej oraz utylizacji odpadów wirusowych. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi IACUC.

Mikroiniekcja lentiwirusa skutkuje trwałą integracją konstruktów genowych z DNA genomicznym OSN. Podejście to pozwala na krótko- lub długoterminowe manipulacje genami kandydackimi poprzez nadekspresję lub wyciszenie za pomocą shRNA. Ponadto możemy fluorescencyjnie znakować pojedyncze OSN w istniejącej linii myszy transgenicznych, aby obserwować kolokalizację populacji receptorów zapachowych. Mikroiniekcja jest niezbędna do transdukcji lentiwirusowej OSN. Podejmowaliśmy próby wprowadzania zawiesiny lentiwirusa do jamy nos...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;&lt;em&gt;Mikroiniekcja:&lt;/em&gt; Noworodki myszy poddano mikroiniekcji przy użyciu 5&amp;#x03BC;Strzykawka Hamilton L (Hamilton #7647-01) wyposażona w igłę o rozmiarze 33 G (Hamilton #7762-06).&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;&lt;em&gt;Odczynniki do immunocytochemii:&lt;/em&gt; Przeciwciała pierwszorzędowe: królicze przeciwciało poliklonalne przeciw GFP (Molecular Probes# A-6455), kurze przeciwciało poliklonalne przeciw OMP (zamówienie specjalne) (Chen et al., 2005), świni morskiej przeciwciało poliklonalne przeciw VGlut2 (Millipore# AB2251). Przeciwciała drugorzędowe: osiołkowe przeciwciało antykrólicze sprzężone z Cy2 (Jackson Immunolab# 711-225-152), osiołkowe przeciwciało antykurze sprzężone z Cy3 (Jackson Immunolab# 703-165-155) oraz kozie przeciwciało przeciw świni morskiej sprzężone z Cy5 (Jackson Immunolab# 106-175-008). Przetwory osadziono na szkiełkach przedmiotowych przy użyciu Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) z roztworem barwiącym chromatynę DAPI w stężeniu 50 ng/mL.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;&lt;em&gt;Obrazowanie konfokalne:&lt;/em&gt; Obrazy serii Z (Z-stack) wykonano przy użyciu konfokalnego mikroskopu Olympus Flouview FV1000, a zgromadzone obrazy przetworzono w projekcje 3D z wykorzystaniem oprogramowania do akwizycji i analizy konfokalnej Olympus FV10-ASW 2.01.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

lentiwirusowa manipulacja genetyczna i wizualizacja neuronów sensorycznych węchu in vivo

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Rozwój precyzyjnego obwodu węchowego opiera się na dokładnej projekcji aksonów neuronów sensorycznych węchu (OSN) do ich celów synaptycznych w opuszce węchowej (OB). Molekularne mechanizmy wzrostu i ukierunkowania aksonów OSN nie są dobrze poznane. Manipulowanie ekspresją genów i późniejsza wizualizacja pojedynczych aksonów OSN oraz morfologii ich drzewa terminalnego stanowiły dotychczas wyzwanie. Aby badać funkcję genów na poziomie pojedynczej komórki w określonym przedziale czasowym, opracowaliśmy technikę opartą na lentiwirusach do manipulowania ekspresją genów w OSN in vivo. Cząstki lentiwirusowe są dostarczane do OSN poprzez mikroiniekcję do nabłonka węchowego (OE). Kasety ekspresyjne są następnie trwale integrowane z genomem transdukowanych OSN. Ekspresja zielonego białka fluorescencyjnego pozwala na identyfikację zainfekowanych OSN i zarysowanie ich pełnej morfologii, w tym drzewa terminalnego aksonu. Dzięki krótkiemu czasowi oczekiwania między mikroiniekcją a detekcją reportera, badania nad funkcją genów mogą być skoncentrowane na bardzo wąskim okresie rozwoju. Przy użyciu tej metody wykryliśmy ekspresję GFP już po trzech dniach, a także po trzech miesiącach od iniekcji. Za pomocą lentiwirusowej mikroiniekcji osiągnęliśmy zarówno nadekspresję, jak i wyciszenie za pomocą shRNA. Metoda ta umożliwia uzyskanie szczegółowej morfologii ciał komórkowych i aksonów OSN na poziomie pojedynczej komórki in vivo, a tym samym pozwala na charakterystykę funkcji genów kandydackich podczas rozwoju węchu.

Przedstawiamy technikę lentiwirusową służącą do manipulacji genetycznej i wizualizacji pojedynczego aksonu neuronu sensorycznego węchu oraz jego arboryzacji terminalnej in vivo.

Lentiwirusowa manipulacja genetyczna i wizualizacja neuronów sensorycznych węchu in vivo

Rozwój precyzyjnego obwodu węchowego opiera się na dokładnej projekcji aksonów neuronów sensorycznych węchu (OSN) do ich celów synaptycznych w...

Jednym z wyzwań w badaniu rozwoju w neuronauce jest obrazowanie morfologii dendrytów i aksonów na poziomie pojedynczej komórki in vivo. W układzie węchowym neurony sensoryczne węchu wysyłają swoje aksony z nabłonka węchowego w nosie do cebulki węchowej w mózgu. Ponieważ wiele neuronów sensorycznych węchu rzutuje w stronę cebulki węchowej, łączą się one w pęczki.Utrudnia to badanie trajektorii poszczególnych aksonów oraz morfologii ich zakończeń. Opracowaliśmy metodę wizualizacji pojedynczych neuronów sensorycznych węchowych in vivo poprzez mikrowstrzyknięcie konstruktu GFP przenoszonego przez lentiwirusa.Skuteczna transdukcja za pomocą lentiwirusa pozwala na doświetlenie całej długości aksonu neuronu sensorycznego węchu, w tym jego drzewka końcowego. Oprócz wizualizacji pojedynczych neuronów sensorycznych węchu, metoda ta umożliwia manipulację ekspresją konkretnego genu zainteresowania w celu zbadania jego funkcji w kontekście in vivo. Procedura z użyciem lentiwirusa odpowiada drugiemu poziomowi bezpieczeństwa biologicznego i musi być przeprowadzana w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Aby zachować sterylność środowiska, spryskaj 70% etanolem wszystkie przedmioty wprowadzane do komory dygestorium. Przed wstrzyknięciem przygotuj i podgrzej kąpiel wodną do 37°C przez co najmniej 20 minut. Szczelnie zamknij plastikowy worek do przechowywania wypełniony w połowie wodą i ustaw go na pustym inkubatorze blokowym.Pozwoli to myszom na rekonwalescencję po iniekcji. Napełnij pojemnik na odpady biologiczne 10% bleach, aby zdekontaminować wszystkie materiały narażone na kontakt z wirusem. W ramach tej procedury przygotuj małą otwartą szalkę z 70% ethanol oraz drugą szalkę z jałową wodą destylowaną.W komorze z laminarnym przepływem powietrza będziemy używać strzykawki Hamiltona o pojemności 5 µL z igłą o rozmiarze 33 G. Ten konkretny model pozwala na regulację oporu tłoka poprzez obracanie pokrętła naciągu znajdującego się u góry komory tłoka. Funkcja ta zapewnia kontrolę objętości mikroiniekcji w celu sterylizacji igły i komory strzykawki.Kilkakrotnie odessaj i wypuść etanol z naczynia. Przepłucz wkład strzykawki, odsysając i wypuszczając wodę sterylną kilka razy. Odłóż strzykawkę w bezpieczne miejsce wewnątrz dygestorium z laminarnym przepływem powietrza.Przygotuj gaziki nasączone alkoholem w pobliżu stanowiska do iniekcji. Przygotuj platformę do iniekcji, zapewniającą podwyższoną powierzchnię, co ułatwi pozycjonowanie myszy. Można w tym celu wykorzystać odwróconą szalkę Petriego o średnicy 10 cm, przykrytą chusteczkami Kim wipes.Szczyki myszy można znieczulać poprzez hipotermię aż do wieku odsadzenia. Odetnij palec z gumowej rękawiczki i umieść w nim szczyka myszy. Następnie pozostaw go na lodzie przez pięć minut.Rękawiczka zapobiegnie oparzeniom skóry, które mogłyby wystąpić w wyniku bezpośredniego kontaktu z lodem. W celu sprawdzenia dokładności znieczulenia należy ucisnąć tylne łapy szczeniaka, aby upewnić się, że zwierzę nie reaguje. Jesteśmy teraz gotowi do mikroiniekcji lentiwirusa. Procedurę zademonstrujemy na nowonarodzonym szczeniaku.W przypadku użycia myszy w starszym wieku należy zastąpić igłę o rozmiarze 33 G igłą o większej średnicy, aby móc przebić powierzchnię czaszki. Zdezynfekuj powierzchnię nosa myszy, przecierając ją wacikiem nasączonym alkoholem. Wyjmij zapasy lentiwirusów z zamrażarki i rozmroź je na lodzie.Wytworzyliśmy lentiwirusy w laboratorium we własnym zakresie, stosując uznane metody. Opracowując tę metodę, stwierdziliśmy, że do uzyskania dobrego poziomu transdukcji wymagany jest minimalny miano wirusa rzędu 10⁹ jednostek zakaźnych na ml. Pobierz 2 µL roztworu zapasowego lentiwirusa do wysterylizowanej strzykawki Hamiltona.Umieść młode myszy na platformie do iniekcji. Chwyć skórę na szczycie głowy w okolicy uszu i delikatnie odciągnij ją do tyłu. Nasz dygestorium wyposażyliśmy w stereomikroskop.Aby precyzyjnie przeprowadzić mikrowstrzyknięcia, należy odnaleźć na grzbietnej powierzchni czaszki w obrębie przedmózgowia zarys opuszki węchowej. Cele naszych mikrowstrzyknięć znajdują się w bezpośrednim sąsiedztwie opuszki węchowej, jednak nie powinny obejmować samej opuszki. Wykonujemy cztery wstrzyknięcia do nabłonka węchowego u każdego szczenięcia.Pozycje te, oznaczone niebieskimi kropkami, wymagają wprowadzenia igły pod kątem skierowanym przyśrodkowo. Dodatkowe dwa wstrzyknięcia, oznaczone zielonymi kropkami, są rozmieszczone naprzemiennie, bardziej przyśrodkowo i przednio w stosunku do opuszki węchowej. Wstrzyknięcia te można wykonać pod kątem w obu kierunkach.Sugerowane kąty wprowadzenia igły wynikają z brzusznego położenia nabłonka węchowego, który znajduje się głównie pod opuszką węchową. Dostęp prostopadły jest zatem ograniczony. Wprowadź igłę przez górną część jamy nosowej około trzech milimetrów poniżej powierzchni skóry.Aby dotrzeć do nabłonka węchowego. Doświadczony operator powinien wyczuć spadek oporu w momencie dotarcia do przestrzeni światła jamy nosowej. Należy unikać tego obszaru.Wstrzyknij mikrostrzykawką 0,5 µL roztworu zapasu wirusa w każdą pozycję. Ponownie, wybierając dwa miejsca na każdą stronę, lewą i prawą, wykonaj łącznie cztery wstrzyknięcia po 0,5 µL. Oznacza to, że na jedną mysz przypada 2 µL wirusa potrzebnego podczas jednej sesji wstrzyknięć.Ponownie, należy uważać, aby podczas wstrzykiwania do opłaty węchowej osuszyć wszelkie pozostałości roztworu wirusa lub krwi, które mogą wyciekać z miejsca wstrzyknięcia lub otworów nozdrzy. Używając chusteczki nasączonej etanolem, wyrzucić ją do pojemnika z rozcieńczonym roztworem wybielacza, a następnie niezwłocznie umieścić wstrzykniętą mysz w inkubatorze wodnym w celu rekonwalescencji. Zdezynfekować igłę i strzykawkę, powtarzając procedurę sterylizacji wykonaną podczas przygotowania. Wstrzyknięte myszy mogą wrócić do klatki 30 minut po rekonwalescencji w inkubatorze wodnym.Całą procedurę mikroiniekcji można powtórzyć po upływie czterech godzin. Aby zwiększyć liczbę zainfekowanych neuronów sensorycznych węchu, można je wizualizować na całej długości komórki już po trzech dniach. Zwierzęta są uśpione i poddane perfuzji w celu obserwacji w wybranym punkcie czasowym.Stosując standardowe metody w celu wizualizacji trajektorii i zakończeń aksonów pojedynczych, transdukowanych neuronów receptorowych węchu, przeprowadzamy koronalną sekcję opuszki węchowej z grubością przekroju 60 µm. Przekrój ten będzie zatem zawierał wszystkie warstwy komórkowe opuszki węchowej, w tym pęczki aksonów neuronów receptorowych węchu oraz zakończenia aksonalne tworzące synapsy w strukturach kłębkowych zlokalizowanych na powierzchni opuszki, w ramach przygotowania do immunohistochemii metodą pływającą. Wykonuje się seryjne przekroje opuszki węchowej, które następnie wspólnie przenosi się do 10 cm naczynia hodowlanego zawierającego pięć mililitrów soli fizjologicznej w buforze fosforanowym.Przenieś pływające przekroje do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów. Gdy przekroje opadną na dno probówki, odessaw próżniowo fosforan buforowany roztwór soli. Zachowaj ostrożność, aby nie odessać preparatów.Przerzuć sekcje do 10 mililitrów świeżego buforu, aby wypłukać pozostałości utrwalacza lub materiału zatopiającego. Natychmiast przenieś tę resuspensję pipetą do 15-mililitrowej probówki stożkowej, upewniając się, że wszystkie pływające sekcje zostały pobrane; odessij roztwór płuczący za pomocą próżni, a następnie poddaj sekcje perforacji w roztworze 0,3% Triton X 100 w buforze fosoranowym (PBS), umieszczając probówkę na platformie kołyszącej na 10 minut. W temperaturze pokojowej można następnie przejść do standardowego protokołu immunobarwienia w tej samej probówce stożkowej, powtarzając etapy odsysania próżniowego i kołysania zgodnie z potrzebami dla naczynia tej wielkości, zachowując objętość 10 mililitrów do etapów barwienia i płukania.Poniżej znajduje się lista przeciwciał, których używamy do wspólnego barwienia pozytywnie przetransdukowanych neuronów sensorycznych węchu oraz ogólnej populacji neuronów sensorycznych węchu. Aby zapewnić dokładną penetrację przeciwciał w 60 mikronowych przekrojach cebulki węchowej, zaleca się inkubację przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Każdy etap płukania powinien trwać nie krócej niż 20 minut.Każdą sekcję delikatnie rozprzestrzeniaj na szkiełku przedmiotowym za pomocą pędzelka, a następnie zamontuj każde szkiełko, stosując flora Mount G z dodatkiem roztworu barwiącego chromatynę. Dołóż starań, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza z medium montażowego. Umieść sekcje w rzędach, aby ułatwić późniejszy etap przesiewania.Przeskanuj te warstwy na swoich sekcjach cebulki immunobarwionych w poszukiwaniu włókien aksonalnych i zakończeń pozytywnych pod kątem GFP. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego można następnie obrazować pozytywnie zainfekowane zakończenia nerwowe przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Pomocne jest skalibrowanie płaszczyzny ogniskowania w obszarze zainteresowania, wykorzystując kanały DPI oraz białka markerowego węchowego.Wyniki te przedstawiają pojedyncze włókno aksonalne neuronu sensorycznego węchowego oraz zakończenie aksonalne w obrębie kłębka; zaznaczono białko markerowe węchu w kolorze czerwonym oraz vlu two w kolorze szarym. Ciała komórek zainfekowanych neuronów sensorycznych węchowych oraz ich kolbki dendrytyczne można również zwizualizować w obrębie nabłonka węchowego, jeśli tkanka ta została uwzględniona w etapach sekcji i immunobarwienia. Ta projekcja konfokalna dostarcza bardzo szczegółowego obrazu morfologii ścieżki rozgałęzienia aksonalnego i drzewa końcowego pojedynczego neuronu sensorycznego węchowego. Można zauważyć zawijanie się włókna aksonalnego z powrotem w kierunku docelowego kłębka, a także szczegóły wzoru jego rozgałęzień w neuropilu kłębka.Metoda mikroiniekcji lentiwirusowej umożliwia wizualizację aksonów pojedynczych komórek oraz morfologii neuronów sensorycznych węchowych i pozwala na prowadzenie badań manipulujących ekspresją genów; transdukcja lentiwirusowa prowadzi do stabilnej integracji konstruktów z genomem. Lentiwirus nie infekuje transsynaptycznie sąsiednich komórek. Wizualizację można osiągnąć w czasie zaledwie trzech dni, a potwierdzono, że efekt ten utrzymuje się co najmniej przez trzy miesiące i prawdopodobnie trwa przez dłuższy czas.Neurony sensoryczne węchowe nie są łatwo infekowane poprzez podanie roztworu lentiwirusa do jamy nosowej. W związku z tym w tej procedurze wymagane jest mikro wstrzyknięcie przez powierzchnię. To była nasza procedura mikro wstrzykiwania lentiwirusa.Mam nadzieję, że wszystkie te informacje okażą się pomocne w uzyskaniu własnych morfologii pojedynczych komórek. Powodzenia w badaniach.

lentivirus-mediated-genetic-manipulation-visualization-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Manipulacja genetyczna za pośrednictwem lentiwirusów i wizualizacja neuronów czuciowych węchowych in vivo

Rozdzielczość czasowa i przestrzenna manipulacji genetycznych determinuje spektrum zjawisk biologicznych, na które mogą one oddziaływać. W niniejszej pracy wykorzystujemy dyskretną czasowo i przestrzennie elektroporację in vivo, w połączeniu z transgenicznymi liniami danio pręgowanego, aby indukować ekspresję transgenu GFP specyficznie w neuronach rozwijającej się opolśnij węchowej.

Targetowanie neuronów opłaty węchowej z wykorzystaniem połączonej elektroporacji in vivo oraz linii ryb danio-ostroskrzelnych typu enhancer trap opartych na Gal4

Neurony powstałe w wieku dorosłym w opalfaktorycznej cebulce mogą być kontrolowane optogenetycznie poprzez wstrzyknięcie lentiwirusa wykazującego ekspresję Channelrhodopsin2 do przedniego strumienia migracyjnego oraz przewlekłą fotostymulację za pomocą wszczepionej miniaturowej diody LED.

Selektywna transdukcja wirusowa neuronów węchowych pochodzenia dorosłego w celu chronicznej optogenetycznej stymulacji in vivo

Źródło: Kozin, E. D., et.al. Bezpośrednia wizualizacja mysiego grzbietowego jądra ślimaka w celu optogenetycznej stymulacji szlaku słuchowego. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje transfer genów za pośrednictwem wirusa do grzbietowego jądra ślimakowego myszy (DCN) w celu umożliwienia stymulacji słuchowej wywołanej światłem. Wektor wirusowy kodujący opsynę, światłoczuły kanał jonowy, jest wstrzykiwany do DCN po kraniotomii i aspiracji móżdżku w celu uzyskania bezpośredniego dostępu. Ekspresja...

Transfer genów za pośrednictwem wirusa do grzbietowego jądra ślimaka myszy w celu stymulacji słuchowej wywołanej światłem

Wektory wirusowe pozwalają na celową manipulację genami. Demonstrujemy metodę warunkowej ekspresji genów lub ablacji w rdzeniu kręgowym myszy, wykorzystując stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do rogu grzbietowego, widocznego miejsca kontaktu synaptycznego między pierwotnymi aferentami somatosensorycznymi a neuronami ośrodkowego układu nerwowego.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego w celu warunkowej manipulacji genami w rdzeniu kręgowym myszy

Opisujemy protokół znakowania in vivo węchowych neuronów czuciowych za pomocą elektroporacji, a następnie konfokalnego skanowania laserowego lub mikroskopii wielofotonowej w celu wizualizacji morfologii neuronów i ich rozwoju w czasie.

Układ węchowy jako model do badania wzorców wzrostu i morfologii aksonów in vivo

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Wstrzyknięcie dordzeniowe rekombinowanego rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) może być użyte do manipulowania dowolnym genetycznie znakowanym typem komórki w rdzeniu kręgowym. Tutaj opisujemy, jak transdukować neurony w rogu grzbietowym lędźwiowego rdzenia kręgowego. Technika ta umożliwia funkcjonalne badanie zmanipulowanego podtypu neuronu.

Ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Obecny protokół demonstruje prostą metodę śledzenia projekcji glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) do hipokampa. Fotostymulację neuronów glutaminianu VTA połączono z zapisem CA1, aby zademonstrować, w jaki sposób zakończenia glutaminianu VTA modulują przypuszczalną szybkość wypalania CA1 w piramidzie in vivo.

Połączone anatomiczne i funkcjonalne śledzenie in vivo zakończeń glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki w hipokampie

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Opisujemy tutaj metody indukowania i analizowania zależnej od doświadczenia węchowego przebudowy synaptycznych kłębuszków nerkowych płata czułkowego w mózgu młodocianych Drosophila.

Zależna od doświadczenia przebudowa połączeń synaptycznych neuronów czuciowych młodzieńczych neuronów czuciowych we wczesnym okresie życia

Poznaj metodę mikroiniekcji lentiwirusa do wizualizacji pojedynczych neuronów węchowych in vivo. Technika ta umożliwia badanie trajektorii aksonów i morfologii terminalnych w układzie węchowym.

Lentiwirusowa manipulacja genetyczna i wizualizacja neuronów sensorycznych węchu in vivo

Przeglądaj więcej filmów