Manipulacja genetyczna za pośrednictwem lentiwirusa i wizualizacja węchowych neuronów czuciowych in vivo

Jednym z wyzwań związanych z badaniem rozwoju w neurobiologii jest uchwycenie morfologii dendrytycznych i aksonalnych na poziomie pojedynczej komórki in vivo. W układzie węchowym węchowe neurony czuciowe rozciągają swoje aksony od nabłonka węchowego w nosie do opuszki węchowej w mózgu. Gdy wiele węchowych neuronów czuciowych wystaje w kierunku opuszki węchowej, fascynują się w wiązki.

Komplikuje to badanie trajektorii poszczególnych aksonów i ich końcowych morfologii. Opracowaliśmy metodę wizualizacji pojedynczych węchowych neuronów czuciowych in vivo poprzez mikroiniekcję konstruktu A GFP. Nosiciel lentiwirusa.

Udana transdukcja lentiwirusem oświetla całą długość węchu aksonu czuciowego, w tym trzpień końcowy. Oprócz wizualizacji pojedynczych węchowych neuronów czuciowych, metoda ta pozwala nam manipulować ekspresją określonego genu w celu zbadania jego funkcji w kontekście in vivo. Ta procedura lentiwirusowa ma drugi poziom bezpieczeństwa biologicznego i musi być wykonywana w okapie z przepływem laminarnym.

Aby utrzymać sterylne środowisko, spryskaj wszystko, co wkładasz do okapu, 70% etanolem w okapie, przygotuj i podgrzej łóżko wodne o temperaturze 37 stopni przez co najmniej 20 minut. Przed wstrzyknięciem. Zamknij plastikową torbę do przechowywania wypełnioną do połowy wodą i umieść ją na pustym inkubatorze z blokiem grzewczym.

Umożliwi to myszom powrót do zdrowia po wstrzyknięciu. Napełnij pojemnik na odpady biologiczne 10% wybielaczem, aby odkazić cały materiał narażony na działanie wirusa. Z tej procedury przygotuj małe otwarte naczynie z 70% etanolem i drugie naczynie ze sterylną wodą destylowaną.

W okapie z przepływem laminarnym będziemy używać strzykawki Hamiltona o pojemności pięciu mikrolitrów z igłą o rozmiarze 33. Ten konkretny model pozwala na regulację oporu tłoka poprzez przekręcenie pokrętła napinającego znajdującego się w górnej części komory tłoka. Ta funkcja zapewnia kontrolę objętości mikroiniekcji w celu sterylizacji komory igły i strzykawki.

Kilkakrotnie zasysaj i wyrzucaj etanol z naczynia. Wypłukać wkład strzykawki, kilkakrotnie zasysając i wyrzucając sterylną wodę. Umieścić strzykawkę bezpiecznie na boku w pokrywie przepływowej.

Chusteczki nasączone alkoholem należy rozmieścić w pobliżu stacji iniekcyjnej. Przygotuj etap iniekcji, który zapewnia podniesioną powierzchnię, która ułatwi ustawienie myszy. Można użyć odwróconego 10-centymetrowego naczynia hodowlanego pokrytego chusteczkami Kim.

Młode myszy mogą być znieczulone przez hipotermię aż do wieku odsadzenia. Wytnij palec gumowej rękawicy i umieść szczeniaka myszy w nacięciu palca. Następnie umieść na lodzie na pięć minut.

Rękawica zapobiegnie oparzeniom skóry, które mogłyby wystąpić w wyniku bezpośredniego kontaktu skóry z lodem w celu dokładnego znieczulenia, szczypiąc tyłek i cztery stopy szczeniaka, aby upewnić się, że zwierzę nie zareaguje. Jesteśmy teraz gotowi do mikroiniekcji lentiwirusa. Będziemy demonstrować na nowonarodzonym szczeniaku.

Jeśli używana jest mysz w starszym wieku, należy zastąpić igłę o rozmiarze 33 grubszą igłą w celu penetracji powierzchni czaszki. Wysterylizuj powierzchnię nosa myszy, przecierając ją wacikiem nasączonym alkoholem. Wyjmij zapasy lentiwirusa z zamrażarki i rozmroź na lodzie.

Sami wyprodukowaliśmy lentiwirusa w laboratorium przy użyciu sprawdzonych metod. Opracowując tę metodę, stwierdziliśmy, że do uzyskania dobrego współczynnika transdukcji wymagane jest minimalne miano wirusa od 10 do 9 jednostek zakaźnych na promil. Odessać dwa mikrolitry roztworu podstawowego lentiwirusa do wysterylizowanej strzykawki Hamiltona.

Umieść szczeniak myszy na etapie wstrzyknięcia. Chwyć skórę na czubku głowy przy uszach i delikatnie pociągnij do tyłu. Wyposażyliśmy nasz okap przepływowy w lunetę sekcyjną.

W celu dokładnego skierowania mikroiniekcji należy przeszukać grzbietową powierzchnię czaszki w przodomózgowiu w poszukiwaniu zarysu opuszki węchowej. Nasze cele mikroiniekcji ściśle otaczają opuszkę węchową, ale nie powinny obejmować samej opuszki. Wykonujemy cztery zastrzyki w nabłonek węchowy każdego szczeniaka.

Te pozycje reprezentowane przez niebieskie kropki wymagają wkłucia igły pod kątem skierowanym przyśrodkowo. Dodatkowe dwa wstrzyknięcia reprezentowane przez zielone kropki są rozłożone w czasie, bardziej przyśrodkowo i przed opuszką węchową. Te zastrzyki mogą być ustawione pod kątem.

Sugestie dotyczące kątów igły są uwzględniane z uwzględnieniem brzusznego położenia nabłonka węchowego, który znajduje się głównie poniżej opuszki węchowej. W ten sposób dostęp prostopadły jest ograniczony. Wbić igłę przez górną część jamy nosowej około trzech milimetrów pod powierzchnią skóry.

Aby dotrzeć do nabłonka węchowego. Wprawna ręka powinna wyczuć spadek oporu po osiągnięciu przestrzeni świetlnej jamy nosowej. Tego obszaru należy unikać.

Mikro wstrzyknąć 0,5 mikrolitra roztworu podstawowego wirusa na pozycję. Ponownie, wybierając dwa miejsca na stronę, zarówno po lewej, jak i po prawej, cztery zastrzyki w sumie 0,5 mikrolitra. Każdy na mysz oznacza dwa mikrolitry wirusa potrzebne na mysz w jednej sesji iniekcji.

Również w tym przypadku należy uważać, aby nie wstrzykiwać opuszki węchowej do sucha resztek roztworu wirusa lub krwi, które mogą wydostać się z miejsca wstrzyknięcia lub otworów nozdrzy. Używając chusteczki do chusteczek z etanolem, wyrzuć chusteczki do rozcieńczonego, bielonego pojemnika w płynie, natychmiast umieść wstrzykniętą mysz na inkubatorze z łóżkiem wodnym w celu odzyskania. Odkazić strzykawkę z igłą, powtarzając procedurę sterylizacji wykonywaną podczas przygotowywania Myszy, którym wstrzyknięto implant, można wrócić do klatki po 30 minutach od wyzdrowienia w inkubatorze z łóżkiem wodnym.

Całe to mikroiniekcję można powtórzyć ponownie w ciągu czterech godzin. Jeśli chcesz zwiększyć liczbę węchowych neuronów czuciowych, które zostaną zainfekowane, zainfekowane węchowe neurony czuciowe mogą zostać uwidocznione na całej długości komórki w ciągu zaledwie trzech dni. Zwierzęta składano w ofierze i poddano obserwacji w pożądanym punkcie czasowym.

Stosując standardowe metody Aby zobrazować transdukowane trajektorie jednokomórkowych węchowych neuronów czuciowych i zakończenia aksonów, dokonujemy sekcji i sekcji korony opuszki węchowej o grubości 60 mikronów. Sekcja będzie zatem zawierała wszystkie warstwy komórkowe opuszki węchowej, w tym wiązki aksonów węchowych neuronów czuciowych i zakończenia aksonów, które synapsy w strukturach kłębuszkowych są związane na powierzchni bańki w ramach przygotowań do pływającej immunohistochemii. Seryjne odcinki opuszki węchowej są wykonywane i zbiorczo zamiatane do 10-centymetrowego naczynia hodowlanego z pięcioma mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.

Przenieś pływające sekcje do stożkowej fiolki o pojemności 50 mililitrów. Gdy skrawki osiądą na dnie fiolki, odkurzyć sól fizjologiczną buforowaną fosforanem. Uważaj, aby nie odkurzać.

Twoje sekcje uzupełniają się 10 mililitrami świeżego buforu, aby zmyć wszelkie pozostałości materiału utrwalającego lub osadzającego. Natychmiast odpipetować tę resposję do stożkowej fiolki o pojemności 15 mililitrów, upewniając się, że wychwyciła wszystkie pływające sekcje, odkurzyć roztwór płuczący i perforować sekcje roztworem 0,3% Triton X 100 w buforze fosforanowym soli fizjologicznej umieszczonej na platformie kołyskowej na 10 minut. W temperaturze pokojowej można następnie przejść przez standardowy protokół barwienia immunologicznego w tej samej stożkowej fiolce, powtarzając kroki próżni i wahacza w razie potrzeby dla naczynia tej wielkości, zachowując 10 mililitrów objętości na etapy barwienia i płukania.

Oto lista przeciwciał, których używamy do barwienia pozytywnie transdukowanych węchowych neuronów czuciowych oraz ogólnej populacji węchowych neuronów czuciowych. W celu dokładnej penetracji przeciwciał przez sekcje bańki o grubości 60 mikronów zaleca się inkubację przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Głębokość prania nie powinna być również krótsza niż 20 minut każde.

Delikatnie rozprowadź każdą sekcję na szkiełku za pomocą pędzla, zamocuj każdy szkiełko za pomocą flora Mount G uzupełnionego roztworem barwienia chromatynowego. Dołożyć wszelkich starań, aby usunąć wszystkie pęcherzyki z medium montażowego. Zamontuj sekcje w rzędach, aby uprościć kolejny etap przesiewania.

Zeskanuj te warstwy na sekcjach bańki barwienia immunologicznego w poszukiwaniu włókien aksonów i końców GFP dodatnich. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego dodatnio zakażone zakończenia nerwowe można następnie zobrazować za pomocą mikroskopii konfokalnej. Pomocne jest skalibrowanie płaszczyzny ogniskowej w obszarze zainteresowania za pomocą DPI i kanałów białkowych markerów węchowych.

Wyniki te pokazują pojedyncze włókno aksonu neuronu czujnika węchowego i zakończenie aksonu w kłębuszku nerkowym, który jest CO z białkiem markera węchowego w kolorze czerwonym i vlu dwa w szarych zakażonych ciałach komórek neuronów czujnika węchowego, a ich gałka dendrytyczna może być również uwidoczniona w nabłonku węchowym, jeśli ta tkanka została uwzględniona na etapach sekcji i barwienia immunologicznego. Cześć, moja projekcja konfokalna dostarcza nam bardzo szczegółowej morfologii pojedynczej węchowej ścieżki przedłużenia aksonalnego neuronu czuciowego i końcowej altany. Można zobaczyć zaczepienie włókna aksonu z powrotem w kierunku celu kłębuszkowego, a także szczegóły jego rozgałęzienia w kłębuszkowej pigułce neurologicznej.

Metoda mikroiniekcji lentiwirusa umożliwia wizualizację aksonu pojedynczej komórki, morfologii węchowych neuronów czuciowych oraz umożliwia badania, które manipulują ekspresją genów, transdukcja lentiwirusa skutkuje stabilną integracją genomową konstruktów. Lentiwirus nie infekuje transsynaptycznie sąsiednich komórek. Wizualizację można osiągnąć w ciągu zaledwie trzech dni i potwierdzono, że trwa ona co najmniej trzy miesiące i prawdopodobnie utrzymuje się przez dłuższy czas.

Węchowe neurony czuciowe nie są łatwo zakażone przez infuzję donosową roztworu lentiwirusa. Dlatego w tej procedurze wymagana jest mikroiniekcja przez powierzchnię. To jest nasza procedura mikroiniekcji lentiwirusa.

Mam nadzieję, że wszystkie te informacje okazały się przydatne w osiąganiu morfologii pojedynczych komórek na swój własny Szczęśliwego polowania.