Przygotowanie oczu dorosłych Drosophila do cienkiego przekroju i analizy mikroskopowej

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie dorosłych oczu Drosophila do cienkiego przekroju, co pozwoli na szczegółową ocenę zmutowanych fenotypów oka, takich jak defekty polaryzacji komórek płaskich. Osiąga się to poprzez uprzednie odcięcie głów znieczulonych much. Tkanka oka jest następnie utrwalana i zatapiana w żywicy epoksydowej.

Po zestaleniu się żywicy osadzone oczka są przycinane. W przypadku cięcia ostatnim krokiem jest cienkie cięcie oczu za pomocą mikrotomu wyposażonego w nóż diamentowy. Ostatecznie analiza przekroju oka pozwoli na scharakteryzowanie fenotypów oka nowych mutantów lub ilościowe określenie interakcji genetycznych między genami szlaku sygnałowego, takiego jak szlak PCP.

Oba pomogą scharakteryzować fizjologiczną rolę nowo zidentyfikowanych genów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie drosophila, takie jak to, w jaki sposób nowe mutacje wpływają na rozwój oka lub jak geny współdziałają w testach interakcji genetycznych. Kilka etapów procedury osadzania oczu, takich jak wyrównanie oczu w formach do sekcji, jest o wiele łatwiejszych do zrozumienia, które tak naprawdę nie są w formie tekstowej Na początek załóż parę rękawiczek w ramach przygotowań do mocowania głów much, aldehydu glutarowego i osmu, które są toksycznymi chemikaliami.

Następnie znieczulij muchy za pomocą CO2 i spuść je na podkładkę przeciw muchom zabezpieczoną papierem watmana pod mikroskopem preparacyjnym, zazwyczaj sortuj sześć much plus dodatkową muchę, aby zapewnić sześć osadzonych główek muchowych na genotyp przytrzymaj i delikatnie dociśnij klatkę piersiową muchy pęsetą, a następnie usuń głowę muchy za pomocą skalpela, Ustabilizuj głowę muchy, dotykając szyi pęsetą i ostrożnie odetnij niewielką część jednego oka, aby zwiększyć penetrację utrwalacza. Dotknij głowy pęsetą lub skalpelem o powierzchnię odciętego oka, aby przenieść głowę do utrwalacza fosforanu aldehydu glutarowego na lodzie. Pamiętaj, aby nosić rękawiczki przez cały proces mocowania.

Najpierw oznacz wszystkie pleśnie, aby śledzić różne genotypy. Następnie wypełnij każdą foremkę 100% żywicą, uważając, aby ich nie przepełnić. Wierzch powinien być płaski na całej powierzchni.

Za pomocą pipety transferowej usuń 50% żywicy z głowic. Zastąp 100% żywicą i inkubuj przez trzy do czterech godzin w temperaturze pokojowej. Gdy głowice zrównoważą się w żywicy w trakcie inkubacji, opadną na dno probówki.

Uderz wykałaczką w twardą powierzchnię, aby utworzyć mały haczyk. Za pomocą tego narzędzia przenieś pojedynczą głowicę muchy do każdej formy. Umieść folię aluminiową na obszarze roboczym mikroskopu preparacyjnego, aby zabezpieczyć go przed rozlaną żywicą.

Za pomocą lunety sekcyjnej użyj igły preparcyjnej, aby lekko i ostrożnie zakręcić głową. Przesuń go na dno formy, blisko spiczastego końca. Ostrożnie wyrównaj powierzchnię nienaruszonego oka z przednią ścianą formy z szyjką skierowaną w dół.

Upewnij się, że styczna powierzchnia oka jest oddalona od ścianki formy o około pół średnicy główki. Jeśli oczy poruszają się podczas wyjmowania igły preparcyjnej, zmień żądane położenie oczu, szybko cofnij igłę lekko od głowy, a następnie powoli całkowicie wyjmij igłę. Gdy wszystkie głowice zostaną wyrównane, ponownie sprawdź wszystkie oczy, aby upewnić się, że się nie poruszają.

Po wyjęciu igły z żywicy, jeśli taka występuje lub przekrzywiona, wyrównaj głowę, przenieś foremki do piekarnika i piecz je w 70 stopniach przez noc. Po upieczeniu przez noc wyjmij stwardniałe bloki z foremek, zginając formy. Śledź, który blok odpowiada któremu genotypowi, przechowując je w oznaczonych pojemnikach.

Aby przyciąć bloki, zamontuj blok na uchwycie mikrotomowym, tak aby oko było skierowane do góry pod lunetą sekcyjną. Za pomocą żyletki pokrytej teflonem ostrożnie odetnij tylko górną warstwę bloku. Pozostawia to wyraźną powierzchnię, przez którą można zobaczyć oko i ustalić płaszczyznę przekroju.

Następnie odetnij nadmiar plastiku po obu stronach głowy i z przodu, aż większość plastiku wokół głowy zostanie odcięta. Najlepiej powoli zbliżać się do głowy, odcinając wiele cienkich warstw plastiku za pomocą czystej żyletki. Ostrożnie usuń cienkie warstwy z górnej części oka dokładnie w pożądanej płaszczyźnie przekroju.

Pamiętaj, aby używać świeżych obszarów żyletki do każdego cięcia i kontynuuj tylko do momentu dotarcia do zewnętrznej powierzchni oka. Powstały przycięty blok będzie trójboczną piramidą z lekko nachylonym odciętym wierzchołkiem, który odpowiada płaszczyźnie przekroju. Zamontuj blok w mikrotomie i rozpocznij cięcie.

Dopóki nie zostanie wygenerowanych od 20 do 30 sekcji, powstałe sekcje będą unosić się na powierzchni wody w zbiorniku. Umieść szkiełko na płycie grzewczej ustawionej na 100 stopni Celsjusza. Następnie za pomocą ruchu obrotowego podnieś spod powierzchni wody pierwszą partię odcinków ze spłaszczonym końcem drewnianej końcówki higienicznej, a następnie przenieś je do kropli wody.

Na szkiełku poczekaj, aż woda wyparuje, a sekcje przykleją się do szkiełka, a następnie powtórz z kolejnymi 20 do 30 sekcjami. Zazwyczaj sekcje trzech oczu umieszczone w sześciu kroplach wody dobrze mieszczą się na jednym szkiełku. Po zebraniu wszystkich skrawków na szkiełku można je wybarwić i zamontować do mikroskopii w przekroju stycznym przez oko dzikiej muchy.

TIA mają normalną polaryzację i są dobrze zorientowane w stosunku do grzbietowej brzusznej linii symetrii, co ilustruje żółta linia na poniższym schemacie. W przeciwieństwie do dobrze zorientowanej tia oka typu dzikiego w oku zmutowanego zeza, polaryzacja tialna jest tracona i nawet jeśli obecny jest pełny dopełniacz fotoreceptorów, rotacja i alityczność są losowe. Należy również zwrócić uwagę na brak pigmentu w sieci komórek pigmentowych i poszczególnych komórkach fotoreceptorów.

Ponieważ mutant zeza znajdował się w białym minusowym tle genetycznym, kinaza lub kropla drosophila ro jest homozygotyczną mutacją letalną, która dlatego wymaga analizy klonalnej. W tym przypadku zmutowane klony Dr.Homozygous charakteryzują się brakiem pigmentu i wykazują defekty rotacji, a także defekty strukturalne, w tym brakującą lub nadmierną liczbę komórek fotoreceptorowych na poziomie pojedynczej komórki. Przykłady fotoreceptorów typu zmutowanego i dzikiego są oznaczone odpowiednio otwartymi lub wypełnionymi niebieskimi grotami strzałek.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak osadzić i podzielić oczy muchy. W ciągu około trzech dni. Rutynowo powinieneś być w stanie szczegółowo analizować fenotypy oka, co pozwoli Ci zająć się funkcją nowych genów podczas rozwoju oka.