Name: Przygotowanie oczu dorosłych Drosophila do cienkiego przekroju i analizy mikroskopowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj metodę przygotowania oczu dorosłych Drosophila do cienkiego przekroju i analizy mikroskopowej. Technika umożliwia ocenę fenotypów mutacyjnych oraz badanie interakcji genetycznych w rozwoju oka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chciałbym podziękować dr Jennifer Curtiss za zdjęcia na rys. 1 oraz Jeremy’emu Faganowi i dr Florence Marlow za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Nasza praca jest finansowana z grantu NIH 1R01GM088202.

1. Disekcja głowy muchy
 <ol>
 <li>Upewnij się, że wszystkie materiały są pod ręką (w tym szkiełka pokryte żelatyną). Przygotuj utrwalacze z glutaraldehydem i osmem (patrz poniżej). Dla każdego genotypu przeznaczonego do zatopienia, odmierz 200μl roztworu utrwalającego z glutaraldehydem do probówek 1,5 ml i umieść je w lodzie.</li>
 <li>Znieczul muchy na podkładce z CO2 (zazwyczaj preparujemy siedem głów much, aby zatopić sześć na genotyp, na wypadek gdyby jedna głowa została zniszczona podczas procedury).</li>
 <li>Przytrzymaj i lekko dociśnij tułów muchy, stroną grzbietową do góry, pęsetą i za pomocą ostrego skalpela odetnij głowę.</li>
 <li>Ustabilizuj głowę muchy, dotykając karku pęsetą, i ostrożnie odetnij niewielką część jednego oka. Ułatwia to penetrację utrwalacza (jeśli planujesz wykorzystać przekroje oka do analizy klonalnej, odetnij część oka bez klonów lub z mniejszymi klonami). Unikaj dotykania i uszkadzania nienaruszonego oka, które zostanie później poddane sekcjonowaniu.</li>
 <li>Dotknij głowy pęsetą lub skalpelem w miejscu odciętego oka i przenieś głowę do utrwalacza glutaraldehyd/fosforan w lodzie (głowy często pływają na powierzchni utrwalacza). Wypreparowane głowy nie powinny pozostawać w utrwalaczu z glutaraldehydem dłużej niż 15 minut przed dodaniem osmu. Powtórz kroki 1.2- 1.5 dla pozostałych much tego samego genotypu.</li>
 </ol>
2. Fixacja i zatapianie (na wszystkich etapach należy używać rękawiczek!)
 <ol>
 <li>Wirować głowy much w wirówce Eppendorf przez 1 minutę przy 10 000 rpm. Kontynuować procedurę nawet jeśli głowy nie opadną na dno.</li>
 <li>Dodać 200μl roztworu OsO4 i utrwalać przez co najmniej 30 minut, maksymalnie do 1 godziny w lodzie.</li>
 <li>Za pomocą pipety Pasteura usunąć roztwór glutaraldehydu/osmu (należy przestrzegać odpowiednich procedur utylizacji odpadów!) i zastąpić go 200μl roztworu osmu. Inkubować w lodzie przez 1-6 h. Należy zawsze upewnić się, że głowy są całkowicie przykryte cieczą; nigdy nie należy usuwać całego roztworu, ponieważ głowy lub oczy mogą ulec zapadnięciu!</li>
 <li>Za pomocą pipety Pasteura usunąć utrwalacz, dodać 0,5-1ml 30% etanolu i inkubować przez co najmniej 5 minut w lodzie (należy przestrzegać odpowiednich procedur utylizacji odpadów, ponieważ etanol zawiera teraz osm!).</li>
 <li>Powtórzyć powyższy krok, stosując kolejno etanol 50%, 70%, (80%), 90% oraz dwukrotnie 100%. Uwzględnić krok z 80% etanolem, jeśli oczy będą przeznaczone do analizy mikroskopowej w mikroskopie elektronowym. Po etapie płukania w 70% etanolu próbki można wyjąć z lodu.</li>
 <li>Zastąpić etanol równą objętością tlenku propylenu (substancja lotna, kontynuować pracę pod wyciągiem). Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Powtórzyć płukanie tlenkiem propylenu. W przypadku przetwarzania wielu genotypów równolegle, pracować w partiach, aby uniknąć zapadnięcia się oczu na skutek odparowania tlenku propylenu.</li>
 <li>Usunąć większość tlenku propylenu i za pomocą plastikowej pipety transferowej dodać około 500μl roztworu żywicy i tlenku propylenu w stosunku 1:1. Pozostawić do wyrównania na noc w temperaturze pokojowej.</li>
 </ol>
3. Zatapianie i rozmieszczanie w formach
 <ol>
 <li>Upewnij się, że wszystkie formy są oznakowane, aby móc śledzić poszczególne genotypy, a następnie wypełnij formy w 100% żywicą. Nie przepełniaj ich (powierzchnia form nie powinna tworzyć „kopców” przy patrzeniu poziomo wzdłuż formy). Do analizy EM stosuj żywicę twardą.</li>
 <li>Za pomocą pipety transferowej usuń 50% żywicę z głów, zastąp ją żywicą 100% i inkubuj przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej. W miarę infiltrowania głów żywicą, będą one opadać na dno probówki.</li>
 <li>Używając wykałaczki, którą uderzono raz o twardą powierzchnię, aby stworzyć mały haczyk, przenoś po jednej głowie do formy.</li>
 <li>Umieść folię aluminiową na obszarze roboczym stereomikroskopu, aby chronić go przed rozlaniem żywicy.</li>
 <li>Używając igły sekcyjnej i patrząc przez mikroskop, lekko zakręć głową w żywicy i ostrożnie przesuń ją na dno formy, blisko jej zaostrzonego końca.</li>
 <li>Ostrożnie ustaw powierzchnię nienaruszonego (!) oka (lub przyszłą płaszczyznę cięcia, jeśli chcesz uzyskać przekroje poprzeczne) szyją w dół, równolegle do przedniej ścianki formy, dbając o to, aby styczna powierzchnia oka znajdowała się w odległości około połowy średnicy głowy od ścianki formy. W rzadkich przypadkach oko może ulec zapadnięciu, co objawia się pustą przestrzenią między powierzchnią oka a kutykulą głowy. Jeśli oko jest zapadnięte, zastąp je 7tym zapasowym okiem.</li>
 <li>Powtórz czynność dla wszystkich głów. Po zakończeniu ustawiania wszystkich próbek, ponownie sprawdź wszystkie oczy, aby upewnić się, że nie przesunęły się podczas wyjmowania igły z żywicy.</li>
 <li>Jeśli masz problem z przemieszczaniem się oczu podczas wyjmowania igły sekcyjnej, ustaw oko w pożądanej pozycji, szybko cofnij igłę nieco od głowy, a następnie powoli wyjmij ją całkowicie.</li>
 <li>Utwardzaj formy w piecu przez noc w temperaturze 70°C.</li>
 </ol>
4. Przycinanie i krojenie
 <ol>
 <li>Wyjąć utwardzone bloki z form poprzez ich wygięcie, monitorując, który blok odpowiada któremu genotypowi (np. przechowując je w małych fiolkach scyntylacyjnych).</li>
 <li>Do przycinania należy użyć uchwytu odpowiedniego dla posiadanego mikrotomu, zamontowanego stroną górną do góry na bloku z pleksiglasu lub aluminium. Zamontować w uchwycie blok do przycięcia, stroną oka do góry.</li>
 <li>Pod mikroskopem stereoskopowym, używając żyletek z powłoką teflonową, ostrożnie odciąć tylko górną warstwę bloku. Pozostawi to przejrzystą powierzchnię, przez którą powinno być widoczne oko, co pozwoli przewidzieć przyszłą płaszczyznę cięcia. Należy uważać, aby nie skaleczyć palców!</li>
 <li>Odciąć nadmiar plastiku po obu stronach głowy oraz z przodu (tj. z miejsca, które było górą formy podczas ustawiania oczu), aż większość plastiku wokół głowy zostanie usunięta. Najlepiej jest powoli zbliżać się do głowy, odcinając wiele cienkich warstw plastiku.</li>
 <li>Używając czystej żyletki, ostrożnie usuwać cienkie warstwy z górnej części oka dokładnie w płaszczyźnie, w której planowane jest późniejsze cięcie (zazwyczaj stycznie do oka, pod niewielkim kątem w stosunku do pierwotnej powierzchni formy).</li>
 <li>Kontynuować proces do momentu, gdy zacznie być odcinana zewnętrzna powierzchnia oka. Należy upewnić się, że używa się czystych fragmentów ostrza, aby uzyskać błyszczącą, przezroczystą powierzchnię, co ułatwia ustawienie w mikrotomie.</li>
 <li>Aby oszczędzać żyletki, należy używać starszych ostrzy do wstępnego przycinania boków bloku i świeżej żyletki do precyzyjnego przycinania (krok 3 i 5). W rezultacie powstanie trójboczna piramida z lekko pochyloną, ściętą górą, która odpowiada przyszłej płaszczyźnie cięcia.</li>
 <li>Zamontować blok w mikrotomie. Sam proces krojenia będzie się różnić w zależności od typu mikrotomu i nie zostanie tutaj opisany szczegółowo. My używamy Sorvall MT5000 z diamentowym nożem klasy histologicznej do uzyskania przekrojów o grubości od 0,5 do 1μm. W przypadku analizy pod mikroskopem świetlnym niewielkie różnice w grubości przekrojów nie mają znaczenia. Przy krojeniu klonów znakowanych transgenem White+, należy wykonywać przekroje o grubości 1μm, aby zapewnić wystarczającą liczbę ziarn pigmentu przylegających do rabdomerów na każdy przekrój (Ryc. 2).</li>
 <li>Przekroje będą pływać na wodzie. Pierwsze 20-30 przekrojów należy podnieść spłaszczonym końcem drewnianego patyczka kosmetycznego z poziomu pod powierzchnią wody ruchem obrotowym i przenieść do kropli wody na szkiełku przedmiotowym pokrytym żelatyną (utrzymywanym na płycie grzewczej w temperaturze około 100°C).</li>
 <li>Powtórzyć czynność z kolejnymi 20-30 przekrojami. Odczekać, aż woda wyparuje, a przekroje przywrą do szkiełka. Zazwyczaj na jednym szkiełku dobrze mieszczą się przekroje z 3 oczu ułożone w trzech kolumnach (trzy oczy) i dwóch rzędach (przekroje górne/dolne).</li>
 </ol>
5. Barwienie i analiza mikroskopowa
 <ol>
 <li>Jeśli nie wykonuje się klonowania sekcji, należy barwić preparaty. Slajd z sekcjami należy umieścić na bloku grzejnym ustawionym na 90°C. Za pomocą strzykawki 30 ml z dołączonym filtrem 0,22μm nanieść na slajd roztwór barwiący błękitem toluidynowym i barwić przez 10 sekund. Natychmiast obficie wypłukać wodą destylowaną. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.</li>
 <li>Za pomocą plastikowej pipety transferowej nanieść 3 krople medium montażowego DPX na slajd i przykryć szkiełkiem podstawowym. Położyć na wierzchu 3 monety i pozostawić medium montażowe do stwardnienia (np. przez noc w temperaturze pokojowej).</li>
 <li>Wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu świetlnego. Użyj obiektywu 5x lub 10x, aby znaleźć odpowiednią sekcję, a następnie przełącz na obiektyw imersyjny 63x w celu szczegółowej analizy i fotografowania. Zazwyczaj stosujemy ustawienia kontrastu fazowego, ale optyka ciemnego pola również się sprawdza.</li>
 </ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Najczęściej oczy są zatapiane w plastiku w celu szczegółowej analizy zewnętrznych fenotypów szorstkiego oka wykrytych w ramach screeningu genetycznego lub w procesie testowania interakcji genetycznych z genami znanymi z wpływu na ogólną strukturę oka lub jego polarność. Typowe wyniki przekrojów oka przedstawiono na rysunku 3. Ommatidia typu dzikiego (rys. 3A) wykazują pełny zestaw fotoreceptorów otoczony siecią komórek pigmentowych. W przeciwieństwie do nich, u mutanta strabismus (stbm, znanego również jako van-gogh7) polarność ommatidialna jest utracona i, mimo obecności pełnego zestawu fotoreceptorów, rotacja i chiralność są zrandomizowane (rys. 3B). Ponadto, ponieważ analizowany przekrój allelu stbm był w tle w-, na rys. 3B brakuje ziarn pigmentu. Rysunek 3C przedstawia przykład analizy klonalnej. Kinaza Rho Drosophila (drok) jest niezbędna do rotacji ommatidialnej, a także do integralności strukturalnej oka8. Klony homozygotyczne drok2 można zidentyfikować po braku pigmentu w komórkach pigmentowych i rhabdomerach (zazwyczaj klony są indukowane przy użyciu eyeless-FLP oraz P-elementu z silnie eksprymowanym markerowym genem white, uzupełniającym mutację tła w- w tkance typu dzikiego i heterozygotycznej). Możliwa jest zatem identyfikacja obszarów mutantowych na podstawie braku pigmentu. Ze względu na wspomnianą wcześniej autonomię komórkową pigmentacji w komórkach R, można określić genotypy poszczególnych komórek R (patrz groty strzałek na rys. 3C).
<img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig1.jpg" alt="Porównanie oczu Drosophila, obraz mikroskopowy, badanie mutacji genetycznych, zmienność wzorca soczewek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Oko Drosophila stanowi doskonały system modelowy dla biologów, ponieważ w przeciwieństwie do gładkiej powierzchni oka typu dzikiego (A), powierzchnia oka mutantów jest często zewnętrznie chropowata (B), co wskazuje na leżące u podstaw fenotypy oka. Na wszystkich rysunkach strona przednia znajduje się po lewej, a grzbietowa u góry. Zdjęcia dzięki uprzejmości dr Jennifer Curtiss, NMSU, Las Cruces, NM, USA. 
<img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig2.jpg" alt="Analiza struktury komórkowej, opisowy schemat podkreślający układ komórkowy z identyfikatorami 1-8, mikroskopia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Obrazy z mikroskopii świetlnej pojedynczych ommatidiów przekrojonych zgodnie z opisaną metodą. W każdym ommatidium jednocześnie widocznych jest tylko siedem komórek R, ponieważ R7 znajduje się nad R8. (A, A') Na poziomie R7 ciało komórki R7 jest widoczne pomiędzy R1 a R6 (żółta strzałka w A'). W przeciwieństwie do tego, na poziomie R8 (B), ciało komórki R8 jest widoczne pomiędzy R1 a R2 (żółta strzałka w B'). Niebieskie groty strzałek wskazują ziarna pigmentu, które mogą służyć jako komórkowy marker pigmentu.
<img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig3.jpg" alt="Wzory nanostruktur z polami wektorowymi; obrazy mikroskopowe, schemat; analiza przepływu elektronów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Przekroje styczne przez dorosłe oczy Drosophila typu dzikiego (A), mutantów stbm (B) oraz drok (C). Schematy poniżej przekrojów wskazują polarność ommatidiów (patrz strzałki na (A)). Okręgi reprezentują ommatidia z defektami w obrębie komplementu fotoreceptorów. Żółte linie reprezentują grzbietową/brzuszną linię symetrii (równik). W przeciwieństwie do prawidłowo zorientowanych ommatidiów typu dzikiego (A), organizacja planarna jest utracona u mutanta stbm (B). Należy zauważyć, że pokazany przekrój mutanta stbm nie posiada pigmentu ze względu na tło mutacyjne w genie w-. (C) Ponieważ mutacje drok są letalne, muszą być one analizowane w klonach. W związku z tym komórki pigmentowane są typu dzikiego lub heterozygotyczne (wypełnione niebieskie groty strzałek), natomiast komórki R pozbawione pigmentu (otwarte niebieskie groty strzałek) są mutantami homozygotycznymi. Oprócz defektów rotacji, mutanty drok wykazują również defekty strukturalne, w tym brak lub nadmiar komórek R. Należy zauważyć, że w celu analizy klonalnej przekroje nie zostały zabarwione, aby uniknąć przysłonięcia granulek pigmentu.

<ol><li>Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Mst+ortholog%2C+hippo%2C+restricts+growth+and+cell+proliferation+and+promotes+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis.</a> Cell. 114, 457-457 (2003).</li>
<li>Secombe, J., Li, L., Carlos, L., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Trithorax+group+protein+Lid+is+a+trimethyl+histone+H3K4+demethylase+required+for+dMyc-induced+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Trithorax group protein Lid is a trimethyl histone H3K4 demethylase required for dMyc-induced cell growth.</a> Genes Dev. 21, 537-537 (2007).</li>
<li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+Drosophila+eye+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of Drosophila eye differentiation.</a> Curr Top Dev Biol. 89, 115-115 (2009).</li>
<li>Jenny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 189-189 (2010).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+in+the+Drosophila+Ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fate in the Drosophila Ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-264 (1987).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+differentiation+in+the+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 120, 366-366 (1987).</li>
<li>Jenny, A., Darken, R. S., Wilson, P. A., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle+and+Strabismus+form+a+functional+complex+to+generate+a+correct+axis+during+planar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Prickle and Strabismus form a functional complex to generate a correct axis during planar cell polarity signaling.</a> Embo J. 22, 4409-4409 (2003).</li>
<li>Zheng, L., Zhang, J., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((frizzled+regulates+mirror-symmetric+pattern+formation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">frizzled regulates mirror-symmetric pattern formation in the Drosophila eye.</a> Development. 121, 3045-3045 (1995).</li>
<li>Reinke, R., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interaction+in+the+Drosophila+Retina%3A+The+bride+of+sevenless+Gene+is+required+in+photoreceptor+cell+R8+for+R7+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interaction in the Drosophila Retina: The bride of sevenless Gene is required in photoreceptor cell R8 for R7 cell development.</a> Cell. 55, 321-321 (1988).</li>
<li>Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((strabismus%2C+a+novel+gene+that+regulates+tissue+polarity+and+cell+fate+decisions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">strabismus, a novel gene that regulates tissue polarity and cell fate decisions in Drosophila.</a> Development. 125, 1149-1149 (1998).</li>
<li>Winter, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Rho-associated+kinase+%28Drok%29+links+Frizzled-mediated+planar+cell+polarity+signaling+to+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Rho-associated kinase (Drok) links Frizzled-mediated planar cell polarity signaling to the actin cytoskeleton.</a> Cell. 105, 81-81 (2001).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1223 (1993).</li>
<li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStocker%2C+H+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. Dahmann, C. 420, Springer. 27-27 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Wykorzystanie Drosophila jako organizmu modelowego w badaniach genetycznych doprowadziło do identyfikacji wielu kluczowych członków rodzin genów niezbędnych dla większości wysokokonserwowanych szlaków sygnalizacyjnych u eukariotów wyższych, w tym u ludzi. Ponieważ w warunkach laboratoryjnych funkcjonalne oko nie jest niezbędne do przeżycia, jest ono tkanką szczególnie odpowiednią do odkrywania nowych funkcji genów i oceny sieci genetycznych. Analiza ultrastrukturalna oka muchy z zastosowaniem opisanej metody doprowadziła zatem do fundamentalnych odkryć istotnych dla rozwoju i chorób. Początkowo analiza klonalna pojedynczych komórek była przeprowadzana z wykorzystaniem klonów indukowanych promieniami rentgenowskimi w połączeniu ze znanymi, ściśle powiązanymi komórkowymi markerami recesywnymi. W ostatnim czasie dostępność systemu FLP/FRT do generowania klonów znacznie ułatwiła analizę fenotypową mutacji letalnych w przekrojach oka6,9.
Analiza przekrojów oka nie ogranicza się do opisanych tutaj przekrojów stycznych. W razie potrzeby głowy można ustawić w formach w dowolnej orientacji, aby uzyskać przekroje poprzeczne do badania głębszych warstw głowy, takich jak lamina i medulla. Opisany tutaj protokół jest zatem wszechstronną metodą analizy struktur oka i głowy u dorosłych osobników Drosophila.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Ogólne wyposażenie:&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Ogólne zasady hodowli muszek opisano w &lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Standardowy mikroskop stereoskopowy (np. Nikon SMZ-645 Stereo Zoom Microscope), najlepiej z pierścieniowym źródłem światła, aby zapobiec rzucaniu cienia przez dłonie. &lt;/li&gt;&lt;li&gt;CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Podkładka do much, pokryta papierem Whatmana 3MM w celu zapewnienia ochrony przed zanieczyszczeniami podczas sekcji. &lt;/li&gt;&lt;li&gt;Szkiełka pokryte żelatyną: rozpuścić 10 g żelatyny i 1 g CrKSO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;x 12 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O w 1 litrze wody na płycie grzejnej (doprowadzić prawie do wrzenia, proces trwa około 2 godzin). Zanurzyć dobrze umyte (detergentem) i wypłukane (dH2O)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O) slajdy w uchwytach umieścić w roztworze żelatyny i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu pod przykryciem z folii przez noc.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Suszarka laboratoryjna (70&amp;#x00B0;C; do tego celu dobrze nadają się stare piecyki próżniowe, które były wykorzystywane do suszenia filtrów nitrocelulozowych).&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Mikrotom umożliwiający wykonywanie ultracienkich przekrojów (0,5-1 &amp;#x03BC;przekroje o grubości m), np. takie, jakie są stosowane w pracowniach mikroskopii elektronowej. Używamy ultramikrotomu Sorvall MT5000 z nożem diamentowym klasy Histo. Można również stosować noże szklane.&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Roztwory do fiksacji:&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Przygotować roztwór stokowy 0,2 M buforu fosforanowego sodu o pH 7,2.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Przygotować 2% glutaraldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym sodu, pH 7,2 (można przechowywać w 4&amp;#x00B0;C przez 4 tygodnie). Przygotować ilość wystarczającą do uzyskania co najmniej 200&amp;#x03BC;na każdy genotyp przeznaczony do zatapiania. Przechowywać w lodzie.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Roztwór osmu: 2% OsO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; w 0,1 M buforze fosforanowym sodu o pH 7,2. Przygotować tylko taką ilość, aby uzyskać 200&amp;#x03BC;na każdy genotyp przeznaczony do zatopienia, ponieważ roztwór nie nadaje się do przechowywania. Przechowywać w lodzie.&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;Glutaraldehyd i OsO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; są silnie toksyczne i należy z nimi obchodzić się z najwyższą ostrożnością w dobrze wentylowanym dygestorium. Podczas pracy z OsO4 należy stosować końcówki z filtrem&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; aby zapobiec poczernieniu pipety.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;Odwadnianie: Przygotować roztwory etanolu o stężeniach 30%, 50%, 70%, (80%), 90% i 100%. Zaleca się schłodzenie etanolu 30%, 50% i 70% w lodzie przed użyciem.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Roztwór barwiący:&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;1% błękit toluidynowy w 1% boraksie.&lt;/p&gt;&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt;&lt;tbody&gt;&lt;tr&gt;&lt;th&gt;&lt;/th&gt;&lt;th&gt;Miękki&lt;/th&gt;&lt;th&gt;Twardy&lt;/th&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Żywica A&lt;/td&gt;&lt;td&gt;54 g&lt;/td&gt;&lt;td&gt;50 g&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Utwardzacz B&lt;/td&gt;&lt;td&gt;44,5 g&lt;/td&gt;&lt;td&gt;50 g&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Akcelerator C&lt;/td&gt;&lt;td&gt;2,5 g&lt;/td&gt;&lt;td&gt;1,75 g&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Plastyfikator D&lt;/td&gt;&lt;td&gt;10 g&lt;/td&gt;&lt;td&gt;0,75 g&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 1. Przygotowanie żywicy&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;Aby przygotować żywicę, należy ostrożnie, lecz dokładnie wymieszać wszystkie składniki w plastikowym zlewce, używając mieszadła magnetycznego z dużym pestkiem. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Po wymieszaniu odmierzyć odpowiednie porcje do standardowych fiolek scyntylacyjnych lub podobnych pojemników i zamrozić w temperaturze -20°C.&amp;#x00B0;C. Do wszystkich zastosowań należy używać żywicy miękkiej, chyba że pracownia EM wymaga sformułowania twardszego. Podczas pracy z żywicą należy używać rękawiczek (w formie niepolimeryzowanej jest rakotwórcza). Aby spolimeryzować żywicę na sprzęcie i odpadach, należy ją wygrzać w temperaturze 70°C.&amp;#x00B0;pozostawić w C przez noc. Odpady można następnie bezpiecznie zutylizować, a sprzęt wyczyścić i wykorzystać ponownie. Rozlaną niepolimeryzowaną żywicę można usunąć za pomocą izopropanolu.&lt;/p&gt;&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt;&lt;tbody&gt;&lt;tr&gt;&lt;th&gt;Odczynniki&lt;/th&gt;&lt;th&gt;Dostawca&lt;/th&gt;&lt;th&gt;Numer katalogowy&lt;/th&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Podkładka do much&lt;/td&gt;&lt;td&gt;np. Genesee&lt;/td&gt;&lt;td&gt;59-119&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Glutaraldehyd&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Sigma&lt;/td&gt;&lt;td&gt;G7526-10 X 10 ML&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;OsO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Polysciences, Inc.&lt;/td&gt;&lt;td&gt;0972A-20&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Tlenek propylenu&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Fisher&lt;/td&gt;&lt;td&gt;04332-1&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Rękojeści do skalpeli, do ostrzy nr 3&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Fisher&lt;/td&gt;&lt;td&gt;22080046&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Ostrza skalpela nr 11&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Fisher&lt;/td&gt;&lt;td&gt;08-916-5B&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Pipety transferowe&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Fisher&lt;/td&gt;&lt;td&gt;13-711-7M&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Żywica ACM Durcupan (R)&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Sigma (Fluka)&lt;/td&gt;&lt;td&gt;44610-1EA&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Stalowa igła sekcyjna&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Fisher&lt;/td&gt;&lt;td&gt;S17346&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;formułka do płaskiego zatapiania BEEM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Mikroskopia elektronowa nauk&lt;/td&gt;&lt;td&gt;70904-12&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Żyletki z powłoką teflonową&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Mikroskopia elektronowa w naukach przyrodniczych&lt;/td&gt;&lt;td&gt;71970&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Patyczki higieniczne (jałowe tampony)&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Fisher&lt;/td&gt;&lt;td&gt;14-959-81&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Lamelki szklane&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Fisher&lt;/td&gt;&lt;td&gt;12-550-143&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Kryszalki nr 1, 22x60 mm&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Fisher&lt;/td&gt;&lt;td&gt;12-531K&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Żelatyna&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Fisher&lt;/td&gt;&lt;td&gt;ICN96010280&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;$\text{K}_2\text{Cr}_2\text{O}_7$&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; dwunastowodny&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Sigma&lt;/td&gt;&lt;td&gt;243361&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Nóż diamentowy do histologii, 6 mm&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Diatome US&lt;/td&gt;&lt;td&gt;60-His&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Błękit toluidyny O&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Fisher&lt;/td&gt;&lt;td&gt;BP107-10&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Boraks (tetraboran sodu)&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Fisher&lt;/td&gt;&lt;td&gt;AC20629-1000&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;medium montażowe DPX&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Sigma&lt;/td&gt;&lt;td&gt;44581-100ML&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 2. Materiały&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

przygotowanie oczu dorosłych osobników drosophila do cienkiego krojenia i analizy mikroskopowej

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila od dawna służy jako system modelowy do badania rozwoju, głównie ze względu na łatwość manipulacji genetycznych. Na przestrzeni lat opracowano mnóstwo szczepów mutantów i rozwiązań technicznych, które pozwalają na formułowanie i udzielanie odpowiedzi na złożone pytania w rozsądnym czasie. Podstawowa wiedza na temat oddziaływania komponentów wszystkich znanych głównych szlaków sygnalizacyjnych została uzyskana w badaniach genetyki w przód oraz genetyki odwrotnej u Drosophila. Oko muchy okazało się wyjątkowo odpowiednie do analizy mutacyjnej, ponieważ w warunkach laboratoryjnych muchy mogą przeżyć bez funkcjonalnych oczu. Co więcej, powierzchnia oka owada składa się z około 800 pojedynczych oczu jednostkowych (facetek lub ommatidiów), które pod mikroskopem stereoskopowym tworzą regularną, gładką powierzchnię. Dzięki temu łatwo jest stwierdzić, czy mutacja wpływa na rozwój lub wzrost oka, obserwując zewnętrznie utratę gładkiej powierzchni (fenotyp „szorstkiego oka”; Ryc. 1) lub odpowiednio ogólny rozmiar oka (przykłady przesiewów opartych na zewnętrznej morfologii oka patrz np.1). Dalsze szczegółowe analizy fenotypów oka wymagają fiksacji, zatopienia w plastiku i wykonywania cienkich skrawków oczu dorosłych osobników.
Oko Drosophila rozwija się z tak zwanego tarczy imaginalnej oka, czyli zbioru komórek nabłonkowych, które proliferują i różnicują się podczas stadiów larwalnego i poczwarki (przegląd patrz np. 2). Każdy ommatidium składa się z 20 komórek, w tym ośmiu fotoreceptorów (PR lub komórki R; Ryc. 2), czterech wydzielających soczewkę komórek stożkowych, komórek pigmentowych („heksagon” wokół skupiska komórek R) oraz szczecinki. Fotoreceptory każdego ommatidium, najłatwiej identyfikowalne po ich światłoczułych organellach – rhabdomerach – są zorganizowane w trapez składający się z sześciu fotoreceptorów „zewnętrznych” (R1-6) i dwóch „wewnętrznych” (R7/8; R8 [Ryc. 2] znajduje się pod R7 i jest zatem widoczny tylko w przekrojach z głębszych obszarów oka). Trapez każdej facetki jest precyzyjnie wyrównany z trapezami sąsiednich facetek oraz z ogólnymi osiami przednio-tylną i grzbietowo-brzuszną oka (Ryc. 3A). W szczególności ommatidia grzbietowej i brzusznej (odpowiednio czarne i czerwone strzałki) połowy oka są swoimi odbiciami lustrzanymi i odpowiadają dwóm formom chiralnym ustalonym podczas sygnalizacji planarnej polaryzacji komórkowej (przegląd patrz np. 3).
Opisana tutaj metoda przygotowania półcienkich przekrojów oka (takich jak te przedstawione na rys. 3) jest lekko zmodyfikowaną wersją metody pierwotnie opisanej przez Tomlinsona i Ready'ego4. Pozwala ona na analizę morfologiczną wszystkich komórek z wyjątkiem przezroczystych komórek stożkowych. Dodatkowo pigment komórek R (niebieskie groty strzałek na rys. 2 i 3) może służyć jako marker autonomiczny komórkowo dla genotypu komórki R, dzięki czemu można łatwo określić wymagania genetyczne genów w podzbiorze komórek R5,6.

W niniejszym materiale przedstawiono standardowe podejście do przygotowania oczu dorosłych osobników Drosophila do wykonywania półcienkich przekrojów oraz analizy pod mikroskopem świetlnym. Protokół ten może być stosowany do ogólnej analizy morfologicznej wad oka lub, po wprowadzeniu wskazanych modyfikacji, do określania wymagań genetycznych genów w konkretnych typach komórek oka (np. analiza klonalna fotoreceptorów) bądź do analizy pod mikroskopem elektronowym.

Przygotowanie oczu dorosłych osobników Drosophila do cienkiego krojenia i analizy mikroskopowej

Muszka owocówka (*Drosophila*) od dawna służy jako system modelowy do badania rozwoju, głównie ze względu na łatwość manipulacji genetycznych. Na przestrzeni lat opracowano szereg szczepów mutantów i rozwiązań technicznych, które pozwalają na stawianie i rozstrzyganie złożonych pytań badawczych w rozsądnym czasie. Dzięki badaniom genetyki forward i reverse u *Drosophila* uzyskano fundamentalną wiedzę na temat oddziaływań komponentów wszystkich znanych głównych szlaków sygnalizacyjnych. Oko muchy okazało się wyjątkowo odpowiednie do analiz mutacyjnych, ponieważ w warunkach laboratoryjnych muchy mogą przeżyć bez funkcjonalnych oczu. Ponadto powierzchnia oka owada składa się z około 800 pojedynczych oczek (faset lub ommatidiów), które pod mikroskopem stereoskopowym tworzą regularną, gładką powierzchnię. Dzięki temu łatwo jest ocenić, czy dana mutacja wpływa na rozwój lub wzrost oka, obserwując zewnętrznie utratę gładkiej powierzchni (fenotyp „szorstkiego oka”; Ryc. 1) lub całkowitą wielkość oka (przykłady przesiewów opartych na zewnętrznej morfologii oka przedstawiono m.in. w 1). Dalsze szczegółowe analizy fenotypów oka wymagają fiksacji, zatopienia w tworzywie sztucznym i wykonania cienkich przekrojów oczu osobników dorosłych. Oko *Drosophila* rozwija się z tzw. tarczki imaginalnej oka, czyli zbioru komórek nabłonkowych, które proliferują i różnicują się podczas stadiów larwalnego i poczwarki (przegląd literatury m.in. w 2). Każde ommatidium składa się z 20 komórek, w tym ośmiu fotoreceptorów (PR lub komórki R; Ryc. 2), czterech komórek stożkowych wydzielających soczewkę, komórek pigmentowych („heksagon” wokół klastra komórek R) oraz szczecinki. Fotoreceptory każdego ommatidium, najłatwiej identyfikowalne po ich światłoczułych organellach – rabdomerach, są zorganizowane w trapez składający się z sześciu fotoreceptorów „zewnętrznych” (R1-6) i dwóch „wewnętrznych” (R7/8; R8 [Ryc. 2] znajduje się pod R7 i jest zatem widoczna tylko w przekrojach z głębszych obszarów oka). Trapez każdej fasety jest precyzyjnie wyrównany względem trapezów sąsiednich oraz ogólnych osi przednio-tylnej i grzbietowo-brzusznej oka (Ryc. 3A). W szczególności ommatidia w połowach grzbietowej i brzusznej (odpowiednio czarne i czerwone strzałki) oka są swoimi obrazami lustrzanymi i odpowiadają dwóm formom chiralnym ustalonym podczas sygnalizacji planarnej polarności komórkowej (przegląd literatury m.in. w 3). Opisana tutaj metoda przygotowania półcienkich przekrojów oka (takich jak przedstawione na Ryc. 3) jest lekko zmodyfikowaną wersją metody pierwotnie opisanej przez Tomlinsona i Ready'ego4. Umożliwia ona analizę morfologiczną wszystkich komórek z wyjątkiem przezroczystych komórek stożkowych. Ponadto pigment komórek R (niebieskie groty strzałek na Ryc. 2 i 3) może służyć jako marker autonomiczny komórkowo dla genotypu komórki R, co pozwala na łatwe określenie wymagań genetycznych w określonym podzbiorze komórek R5,6.

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie oczu dorosłych osobników Drosophila do cienkiego cięcia, co umożliwia szczegółową ocenę fenotypów mutantów oka, takich jak defekty planarnej polaryzacji komórek. Osiąga się to poprzez odcięcie głów znieczulonych much, a następnie utrwalenie tkanki oka i jej zatopienie w żywicy epoksydowej.Po utwardzeniu żywicy, zatopione oczy zostają przycięte. Ostatnim etapem procesu sekcjonowania jest wykonanie cienkich przekrojów oczu przy użyciu mikrotomu wyposażonego w nóż diamentowy. W końcowej fazie analiza przekrojów oka pozwoli na charakterystykę fenotypów oka nowych mutantów lub kwantyfikację interakcji genetycznych między genami szlaku sygnałowego, takiego jak szlak PCP.Obie metody pomogą w charakterystyce roli fizjologicznej nowo zidentyfikowanych genów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad muszką owocową, takie jak wpływ nowych mutacji na rozwój oka lub sposób oddziaływania genów w testach interakcji genetycznych. Kilka etapów procedury zatapiania oczu, np. ustawianie oczu w formach do sekcjonowania, jest znacznie łatwiejsze do zrozumienia w formie wizualnej niż tekstowej. Na początek załóż rękawiczki, przygotowując się do fiksacji głów much glutaraldehydem i osmem, z których oba są substancjami toksycznymi.Następnie znieczulone CO2 muchy przenieś na podkładkę do much wyłożoną papierem Watmana pod mikroskopem stereoskopowym; zazwyczaj należy odseparować sześć much oraz jedną dodatkową, aby zapewnić uzyskanie sześciu zatopionych głów much na genotyp. Delikatnie przyciśnij tułów muchy pęsetą, a następnie odetnij głowę za pomocą skalpela. Stabilizując głowę muchy poprzez przytrzymanie szyi pęsetą, ostrożnie odetnij niewielki fragment jednego z oczu, aby zwiększyć penetrację utrwalacza. Używając pęsety lub skalpela, dotknij powierzchni odciętego oka, aby przenieść głowę do utrwalacza w postaci fosforanu glutaraldehydu w lodzie. Przez cały proces utrwalania należy używać rękawiczek.Najpierw należy opisać wszystkie formy, aby monitorować różne genotypy. Następnie wypełnić każdą formę żywicą w stężeniu 100%, dbając o to, aby ich nie przepełnić. Górna powierzchnia powinna być płaska.Za pomocą pipety transferowej usuń 50% żywicy z głów. Zastąp ją 100% żywicą i inkubuj przez trzy do czterech godzin w temperaturze pokojowej. W miarę jak głowy będą równoważyć się w żywicy w trakcie inkubacji, opadną one na dno probówki.Uderz wykałaczką o twardą powierzchnię, aby stworzyć mały haczyk. Za pomocą tego narzędzia przenieś pojedynczą głowę muchy do każdej formy. Umieść folię aluminiową na obszarze roboczym mikroskopu stereoskopowego, aby chronić go przed rozlaną żywicą.Za pomocą stereomikroskopu, używając igły sekcyjnej, delikatnie i ostrożnie obróć głowę. Przesuń ją na dno formy, blisko jej zaostrzonego końca. Ostrożnie ustaw powierzchnię nienaruszonego oka równolegle do przedniej ścianki formy, tak aby szyja była skierowana w dół.Należy upewnić się, że powierzchnia styczna oka znajduje się w odległości około połowy średnicy głowy od ścianki formy. Jeśli oczy przesuną się podczas wyciągania igły sekcyjnej, należy je odpowiednio ustawić, szybko i lekko wycofać igłę z głowy, a następnie powoli usunąć ją całkowicie. Po wyrównaniu wszystkich głów należy ponownie sprawdzić wszystkie oczy, aby upewnić się, że nie uległy przesunięciu.Po wyjęciu igły z żywicy, jeśli jest to konieczne lub jeśli główka jest przekrzywiona, należy ją wyrównać, a następnie przenieść formy do pieca i wypiekać w temperaturze 70 stopni przez noc. Po nocnym wypiekaniu należy wyjąć utwardzone bloki z form poprzez ich wygięcie. Należy kontrolować, który blok odpowiada któremu genotypowi, przechowując je w oznakowanych pojemnikach.Aby przyciąć bloczki, zamocuj bloczek w uchwycie mikrotomu w taki sposób, aby oko było skierowane do góry pod mikroskopem stereoskopowym. Używając żyletki z powłoką teflonową, ostrożnie odetnij tylko wierzchnią warstwę bloczka. Pozostawi to przejrzystą powierzchnię, przez którą widać oko, co pozwala na ustalenie płaszczyzny cięcia.Następnie odetnij nadmiar plastiku z obu stron głowy oraz z przodu, aż większość plastiku wokół głowy zostanie usunięta. Najlepiej jest powoli zbliżać się do głowy, odcinając wiele cienkich warstw plastiku za pomocą czystego ostrza do golenia. Ostrożnie usuwaj cienkie warstwy z górnej części oka w dokładnie pożądanej płaszczyźnie cięcia.Należy pamiętać o używaniu świeżych fragmentów ostrza brzytwy do każdego cięcia i kontynuować proces tylko do momentu dotarcia do zewnętrznej powierzchni oka. Powstały przycięty blok będzie miał kształt piramidy trójbocznej z lekko pochyloną, odciętą górą, która odpowiada płaszczyźnie cięcia. Zamocuj blok w mikrotomie i rozpocznij sekcjonowanie.Aż do momentu uzyskania od 20 do 30 przekrojów, powstałe sekcje będą unosić się na powierzchni wody w zbiorniku. Umieść szkiełko na płycie grzejnej ustawionej na 100 stopni Celsjusza. Następnie, wykonując ruch obrotowy, podnieś pierwszą partię przekrojów spod powierzchni wody za pomocą spłaszczonego końca drewnianego patyczka do uszu, a następnie przenieś je do kropli wody.Na szkiełku poczekaj, aż woda odparuje, a skrawki przykleją się do powierzchni, a następnie powtórz czynność z kolejnymi 20 do 30 skrawkami. Zazwyczaj skrawki z trzech oczu rozmieszczone w sześciu kroplach wody dobrze mieszczą się na jednym szkiełku. Po zebraniu wszystkich skrawków na szkiełku można je zabarwić i zamontować do analizy mikroskopowej. Przekrój styczny przez oko muchy typu dzikiego.TIA wykazują prawidłową polaryzację i są dobrze zorientowane względem grzbietowo-brzusznej linii symetrii, która jest przedstawiona jako żółta linia na poniższym schemacie. W przeciwieństwie do dobrze zorientowanych tia w oku typu dzikiego, tutaj, w oku mutanta strabismus, polaryzacja tia jest utracona i mimo obecności pełnego zestawu fotoreceptorów, ich rotacja i polaryzacja są zrandomizowane. Należy również zwrócić uwagę na brak pigmentu w sieci komórek pigmentowych oraz w poszczególnych komórkach fotoreceptorowych.Ponieważ mutant strabismus znajdował się w tle genetycznym white minus, drosophila ro kinase lub drop jest mutacją letalną w homozygotach, co wymaga zatem analizy klonalnej. Tutaj, klony mutantów homozygotycznych są znakowane brakiem pigmentu i wykazują defekty rotacji, a także defekty strukturalne, w tym brak lub nadmiar komórek fotoreceptorowych na poziomie pojedynczych komórek. Przykłady fotoreceptorów mutantów i typu dzikiego są wskazane odpowiednio przez puste lub wypełnione niebieskie groty strzałek.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić zatopienie w żywicy i sekcjonowanie oczu muchy. W ciągu około trzech dni powinni Państwo być w stanie rutynowo analizować szczegółowo fenotypy oczu, co pozwoli na zbadanie funkcji nowych genów podczas rozwoju oka.

preparation-adult-drosophila-eyes-for-thin-sectioning-microscopic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie oczu Drosophila dorosłych do cienkiego cięcia i analizy mikroskopowej

Opisujemy proces utrwalania, zatapiania, krojenia i obrazowania późnych stadiów embrionów Drosophila do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu badania embrionalnej rurki serca. Technika ta umożliwia wizualizację światła rurki serca, a także błony podstawnej wyścielającej światło serca.

Przygotowanie embrionów do mikroskopii elektronowej rurki serca embrionów Drosophila

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Siatkówka Drosophila stanowi krystaliczną sieć złożoną z niewielkiej liczby typów komórek, które są generowane w sposób stereotypowy 1. Jej podatność na zaawansowane analizy genetyczne umożliwia badanie złożonych programów rozwojowych. Niniejszy protokół opisuje preparowanie oraz immunohistochemię siatkówek na trzech odrębnych etapach rozwoju, ze szczególnym uwzględnieniem różnicowania fotoreceptorów.

Disekcja i immunohistochemia siatkówek larwalnych, poczwarkowych i dorosłych Drosophila

Ten film opisuje, jak zanurzyć głowy Drosophila w parafinie za pomocą metody kołnierza, techniki przygotowującej głowy muchy do seryjnego cięcia. Skrawki parafinowe służą do badań histologicznych anatomii mózgu oraz do oceny neurodegeneracji. Prezentowany protokół pokazuje, w jaki sposób można przetworzyć wiele much w jednym preparacie, zwiększając w ten sposób efektywność czasową i minimalizując artefakty eksperymentalne.

Osadzanie dorosłych głów Drosophila w parafinie: przygotowanie tkanki do histologii

Ten film opisuje, jak przeprowadzić sekcję i wyizolować mózg dorosłego Drosophila - procedura niezbędna do wizualizacji narządu, który w przeciwnym razie jest zasłonięty przez naskórek, oko i tkankę tchawicy. Przykładowy protokół przedstawia szczegółową demonstrację dającą wysokiej jakości preparaty, które można stosować do barwienia immunologicznego i metod obrazowania w neurobiologii Drosophila.

Drosophila Sekcja mózgu osoby dorosłej: metoda w neurobiologii much

Ten film opisuje, jak przeprowadzić sekcję i wyizolować kompleks oko-mózg od poczwarek Drosophila. Przedstawiony protokół pokazuje, że procedura pozwala uzyskać wysokiej jakości tkankę, kompatybilną na przykład z barwieniem immunologicznym, a także innymi eksperymentami z ekspresją genów.

Rozwarstwienie kompleksu oko-mózg z poczwarek much: metoda izolacji tkanki siatkówki

Mózg dorosłego Drosophila jest cennym systemem do badania obwodów neuronalnych, wyższych funkcji mózgu i złożonych zaburzeń. Skuteczna metoda wycinania całej tkanki mózgowej z małej głowy muchy ułatwi badania oparte na mózgu. Tutaj opisujemy prosty, jednoetapowy protokół preparacji dorosłych mózgów o dobrze zachowanej morfologii.

Prosty, jednoetapowy protokół preparacyjny do przygotowania mózgów dorosłych osobników Drosophila

Analiza SEM jest skuteczną metodą pomagającą w identyfikacji gatunków lub dyskryminacji fenotypowej. Protokół ten opisuje metody badania określonych szczegółów morfologicznych trzech reprezentatywnych typów organizmów i miałby szerokie zastosowanie do badania cech wielu typów organizmów i tkanek.

Otrzymywanie organizmów prokariotycznych i eukariotycznych z wykorzystaniem suszenia chemicznego do analizy morfologicznej w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)

Ten artykuł przedstawia chirurgiczną metodę preparowania siatkówki poczwarki Drosophila wraz z protokołami przetwarzania tkanek do immunohistochemii, analizy zachodniej i ekstrakcji RNA.

Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA

Ten protokół opisuje trzy kroki przygotowania płatów wzrokowych larw i dorosłych Drosophila do obrazowania: 1) preparacje mózgu, 2) immunohistochemia i 3) montaż. Nacisk położono na krok 3, ponieważ do wizualizacji określonych struktur płatów optycznych wymagane są różne orientacje montażowe.

Rozwarstwienie, immunohistochemia i montaż mózgów larw i dorosłych osobników Drosophila w celu wizualizacji płata wzrokowego

Tutaj prezentujemy szybki, tani proces obrazowania w wysokiej rozdzielczości oczu dorosłego Drosophila w celu ilościowego określenia wzorców i wad wzrostu. Opisujemy nasz protokół przygotowania próbek poprzez montaż punktowy, akwizycję obrazu w wysokiej rozdzielczości i analizę obrazu.

Szybki i prosty proces oznaczania ilościowego zewnętrznych struktur dorosłego osobnika Drosophila

Poznaj metodę przygotowania oczu dorosłych Drosophila do cienkiego przekroju i analizy mikroskopowej. Technika umożliwia ocenę fenotypów mutacyjnych oraz badanie interakcji genetycznych w rozwoju oka.

Przygotowanie oczu dorosłych osobników Drosophila do cienkiego krojenia i analizy mikroskopowej

Przeglądaj więcej filmów