Name: Test nakładania błony białkowej: protokół do badania interakcji między rozpuszczalnymi i nierozpuszczalnymi białkami in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-14T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Poznaj metodę nakładania błony białkowej do badania interakcji między białkami nierozpuszczalnymi immobilizowanymi na membranie a białkami rozpuszczalnymi. Technika ta umożliwia niezawodne testowanie wiązań białkowych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace w naszym laboratorium są wspierane grantami z NIH, USDA National Institute of Food and Agriculture, NSF, BARD, DOE oraz BSF przyznanymi V.C.

1. Ekspresja i ekstrakcja białek
<ol>
	<li>Zastosuj zróżnicowane znaczniki dla białek przeznaczonych do testów w celu ich detekcji. Białko, które ma zostać unieruchomione na błonie (ProIM), oznakuj znacznikiem o większym rozmiarze (np. GST); niepołączony znacznik może służyć jako unieruchomiona kontrola negatywna (ProIMnc). Białko wykorzystywane jako sonda rozpuszczalna (ProSOL) oznakuj znacznikiem dużym lub małym. Ten sam znacznik połącz z odpowiednim rozpuszczalnym białkiem kontrolnym (ProSOLnc) i uwzględnij w badaniu oddziaływań, aby potwierdzić specyficzność wykrytego wiązania.</li>
	<li>Wybierz system ekspresji białek do otrzymania białek znaczników, np. E. coli, bakulowirusy itp., w zależności od wymagań dotyczących potencjalnych modyfikacji potranslacyjnych oraz oczekiwanej wydajności białek.</li>
	<li>Wyizoluj ProIM i ProIMnc z wybranego organizmu (krok 1.2), używając buforu do aplikacji na SDS-PAGE (20% glicerol, 4% SDS, 20 mM Tris-HCl, pH6.8) zawierającego koktajl inhibitorów proteinaz. Pozostaw zawiesinę komórkową w temperaturze pokojowej przez 15 min, dodaj 0,5% 2-merkaptoetanolu i gotuj przez 5 min.</li> 
	<li>Wyizoluj ProSOL i ProSOLnc z wybranego organizmu (krok 1.2), stosując standardowe protokoły 16. Białka te powinny być łatwo rozpuszczalne w buforze wiążącym (140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 % BSA, 0.1% Tween 20) wykorzystywanym w kroku 4.1.</li>
	<li>Wyznacz stężenie białek rekombinowanych standardową metodą, np. za pomocą zestawu do oznaczania białek Bio-Rad. Jeśli do analizy używany jest ekstrakt surowy zamiast oczyszczonego białka, oszacuj stężenie badanego białka w tym ekstrakcie za pomocą densytometrii skanującej odpowiadającego mu prążka na żelu SDS-poliakrylamidowym barwionym Coomassie Brilliant Blue R-250, przyjmując znane stężenia BSA jako referencyjne.</li>
</ol>
2. Immobilizacja ProIM i ProIMnc na membranie
<ol>
	<li>Rozdziel dwa zestawy ekstraktów, z których każdy zawiera 1 μg ProIM i ProIMnc, na żelu poliakrylamidowym SDS zgodnie ze standardowym protokołem 16.</li> 
	<li>Po elektroforezie umieść żel w 10 ml buforu do transferu (60 mM glicyny, 10 mM Tris, 0,006% SDS, 20% MeOH) i inkubuj przy łagodnym mieszaniu przez 20 min w temperaturze pokojowej.</li> 
	<li>Przenieś białka zawarte w żelu na membranę nitrocelulozową metodą elektrotransferu zgodnie ze standardowym protokołem 16.</li>
</ol>
3. Refolding białek błonowych
<ol>
	<li>Po elektrotransferze inkubować membranę przez 15 min w 15 ml buforu A (30 mM Tris-HCl pH7.4, 0.05% Tween 20) przy łagodnym mieszaniu w celu usunięcia pozostałości SDS.</li> 
	<li>Po ostrożnym odlaniu cieczy przenieść membranę do 25 ml buforu denaturującego (7 M guanidyny chlorowodorku, 2 mM EDTA, 50 mM DTT, 50 mM Tris-HCl pH 8.3) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu. (Uwaga: membrana nitrocelulozowa staje się nieprzezroczysta podczas inkubacji w buforze denaturującym). i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.</li>
	<li>Przenieść membranę do 25 ml TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) i inkubować przy łagodnym mieszaniu przez 5 min (Uwaga: podczas tego kroku membrana odzyskuje swój pierwotny biały kolor).</li>
	<li>Przenieść membranę do 25 ml buforu wiążącego (patrz krok 1.2) i inkubować w temperaturze 4°C przy łagodnym mieszaniu przez noc.</li>
</ol>
4. Badanie ProIM za pomocą ProSOL
<ol>
	<li>Przetnij błonę na dwa paski, z których każdy zawiera ProIM i ProIMnc.</li>
	<li>Przygotuj roztwory hybrydyzacyjne ProSOL i ProSOLnc poprzez rozcieńczenie 1-10 μg ProSOL lub ProSOLnc w 10 ml świeżego buforu wiążącego. Przenieś każdą błonę do odpowiedniego roztworu hybrydyzacyjnego ProSOL lub ProSOLnc i inkubuj przez 1,5 h w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.</li>
	<li>Wyjmij błony z roztworów hybrydyzacyjnych i przemyj trzykrotnie w TBS, po 15 min każdy raz.</li>
</ol>
5. Wizualizacja oddziaływań białko-białko za pomocą immunoblotingu
<ol>
<li>Zablokować membranę, używając 2,5% mleka odtłuszczonego w TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (poliklonalne królicze przeciwciało anty-strepII) w 0,5% mleku odtłuszczonym w TBST zgodnie z koncentracją zalecaną przez producenta.</li>
<li>Umieścić zablokowane membrany w roztworze przeciwciał i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C przy delikatnym mieszaniu.</li>
<li>Płukać membrany w 20 ml TBST przez 15 min, a następnie dwukrotnie po 5 min w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu.</li>
<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (przeciwciało anty-rabbit IgG) sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) w 0,5% mleku odtłuszczonym w TBST zgodnie z koncentracją zalecaną przez producenta. Umieścić membrany w roztworze przeciwciała drugorzędowego i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu.</li>
<li>Płukać membrany w 20 ml TBST przez 15 min, a następnie dwukrotnie po 5 min w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu. Po końcowym płukaniu w TBS zwizualizować oddziaływanie białko-białko, stosując substrat chemiluminescencyjny HRP (na przykład Millipore Immobilon western chemiluminescent HRP substrate).</li>
<li>Przebrać te same membrany przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko znacznikowi połączonemu z ProIM, a następnie odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym, zgodnie z opisem w krokach od 5.1 do 5.4. Zwizualizować ProIM oraz ProIMnc zgodnie z opisem w kroku 5.5, aby potwierdzić tożsamość prążków uzyskanych w teście overlay białkowo-białkowym (krok 5.5). W większości przypadków stripping nie jest konieczny, ponieważ sygnał uzyskany w tym kroku jest znacznie silniejszy niż sygnał resztkowy z kroku 5.5.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki: 
Interakcję ANK-MP zaobserwowano za pomocą metody BiFC w komórkach epidermy tytoniu (Rycina 1A). Ponieważ MP jest białkiem wysoce nierozpuszczalnym podczas ekspresji w bakteriach lub roślinach, w celu walidacji tej interakcji in vitro zastosowano test nakładania białek na błonę (protein membrane overlay assay) (Rycina 1B). Ekstrakty białkowe zawierające 1 μg GST-MP (ProIM) lub niepołączonego GST (ProIMnc) rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu SDS-poliakrylamidowym, a następnie przeprowadzono elektrotransfer na błonę nitrocelulozową. Gdy te ProIM poddano inkubacji z rozpuszczalnym ANK-strepII (ProSOL), wiązanie wykazano dla GST-MP, ale nie dla niepołączonego GST (Rycina 1B, ścieżki 1, 2, porównać ze ścieżkami 5, 6). Co więcej, gdy ten sam zestaw ProIM poddano inkubacji z niepowiązanym ProSOLnc, tj. cytokalizatorową NADH kinazą z Arabidopsis z tagiem strepII (NADH3-strepII), nie zaobserwowano wiązania, co dodatkowo potwierdziło specyficzność interakcji ANK-MP (Rycina 1B, ścieżki 3, 4).
<img src="/files/ftp_upload/2961/2961fig1.jpg" alt="Analiza ekspresji białek z wykorzystaniem mikroskopii i immunoblotingu; mikroskopia fluorescencyjna i elektroforeza żelowa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Specyficzne wiązanie białka ANK tytoniu z białkiem MP TMV in vivo i in vitro(A) Interakcja ANK-MP w żywych komórkach epidermy tytoniu wykryta metodą BiFC. Silny sygnał YFP został odtworzony, gdy MP i ANK, połączone odpowiednio z częściami C-końcową i N-końcową YFP, były koekspresowane w epidermie tytoniu po mikrobombardowaniu genami kodującymi te białka. Sygnał BiFC gromadził się w postaci punktów na obwodzie komórki, co jest charakterystyczne dla plazmodesmat. 15(B) Interakcja ANK-MP in vitro wykryte za pomocą testu nakładania białek na błonę (protein membrane overlay assay). Ekstrakty białkowe zawierające 1 μg białek GST-MP (ProIM) lub niepołączonego GST (ProIMnc) rozdzielono na 15% żelu poliakrylamidowym z SDS, a następnie przeniesiono drogą elektrotransferu na membranę nitrocelulozową. Białka GST-MPProIM oraz GSTProIMnc inkubowano z 0.5 μg/ml białka ANK-strepII (ProSOL), a wiązanie ANK wykryto poprzez inkubację membrany z króliczym poliklonalnym przeciwciałem anty-strepII, a następnie z wtórnym przeciwciałem anty-króliczym IgG+M sprzężonym z HRP (ścieżki 1 i 2). Żaden z białek, GST-MPProIM ani GSTProIMnc, nie wchodził w interakcję z białkiem niepowiązanym, Arabidopsis cytoplazmatyczna kinaza NADH, połączona z tagiem strepII (ProSOLnc, ścieżki 3 i 4). Tożsamość prążka zaobserwowanego w tym badaniu potwierdzono za pomocą przeciwciała anty-GST w analizie western blot (ścieżki 5 i 6). Gdy membranę potraktowano buforem denaturującym bez uprzedniego przemycia buforem A, wiązanie GST-MP z ANK uległo zanikowi, natomiast niezidentyfikowane białka zawarte w ekstraktach GST-MP oraz ekstraktach białek zawierających GST zareagowały z ANK-strepII, co dowodzi znaczenia kroku 3.1 przed procesem denaturacji (ścieżki 7 i 8).

<ol><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li>
<li>Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+Caenorhabditis+elegans+using+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis.</a> Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).</li>
<li>Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> Methods. 45, 196-206 (2008).</li>
<li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li>
<li>Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li>
<li>Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P30+movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+is+a+single-strand+nucleic+acid+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein.</a> Cell. 60, 637-647 (1990).</li>
<li>Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+tobamovirus+movement+proteins+with+the+plant+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton.</a> Science. 270, 1983-1985 (1995).</li>
<li>Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+by+immunogold+cytochemistry+of+the+virus+coded+30+K+protein+in+plasmodesmata+of+leaves+infected+with+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus.</a> Virology. 160, 363-371 (1987).</li>
<li>Ding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+plasmodesmata+are+specific+sites+of+localization+of+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants.</a> Plant Cell. 4, 915-928 (1992).</li>
<li>Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+30+kd+protein+of+tobacco+mosaic+virus%3A+involvement+in+cell-to-cell+movement+and+dispensability+for+replication%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication.</a> EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).</li>
<li>Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+modifies+plasmodesmatal+size+exclusion+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit.</a> Science. 246, 377-379 (1989).</li>
<li>Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+functional+assay+for+tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein+and+identification+of+a+domain+involved+in+increasing+plasmodesmal+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).</li>
<li>Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANK%2C+a+host+cytoplasmic+receptor+for+the+Tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein%2C+facilitates+intercellular+transport+through+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata.</a> PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).</li>
<li>Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Taylor, G. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIP1%2C+an+Arabidopsis+protein+that+interacts+with+Agrobacterium+VirE2%2C+is+involved+in+VirE2+nuclear+import+and+Agrobacterium+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity.</a> EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).</li>
<li>Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+and+host+cell+pectin+methylesterases+is+required+for+viral+cell-to-cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement.</a> EMBO J. 19, 913-920 (2000).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podejście to jest odpowiednie do badania oddziaływań białko-białko pomiędzy kombinacjami białek, w których przynajmniej jedno z białek jest łatwo rozpuszczalne w buforze wiążącym, i zostało z powodzeniem zastosowane w odniesieniu do innych kombinacji białek 17,18. Oddziaływań pomiędzy białkami, które w tych warunkach są oba nierozpuszczalne, nie można badać za pomocą niniejszego protokołu.
Ponadto, pomyślne refoldowanie ProIM jest krytyczne dla przeprowadzenia testu. Płukanie membra...

<table><tbody><tr><td>Zestaw do oznaczania białka</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0001</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteinaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>System Mini-PROTEAN</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>Półsuchy system elektrotransferu SD do western blottingu</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-rabbit IgG sprzężone z peroksydazą chrzanową</td><td>GenScript</td><td>A00098</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalne przeciwciało królicze anty-GST</td><td>GenScript</td><td>A00097</td><td></td></tr><tr><td>Anti-strepII</td><td>GenScript</td><td>A00626</td><td></td></tr><tr><td>BioTrace, membrana nitrocelulozowa do transferu NT</td><td>Pall Corporation</td><td>27377-000</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon western chemiluminescent HRP substrate</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Walidacja oddziaływań między różnymi białkami jest kluczowa dla badania ich funkcji biologicznych na poziomie molekularnym. Istnieje kilka metod, zarówno in vitro, jak i in vivo, służących do oceny wiązania białek; aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy zastosować co najmniej dwie metody, które wzajemnie uzupełniają swoje niedoskonałości.
W przypadku analiz in vivo, test bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) stanowi najpopularniejszą i najmniej inwazyjną metodę umożliwiającą wykrywanie oddziaływań białko-białko w żywych komórkach, a także identyfikację wewnątrzkomórkowej lokalizacji oddziałujących białek 1,2. W tym teście niefluorescencyjne połowy N- i C-terminalne GFP lub jego wariantów są łączone z badanymi białkami; gdy dwa białka fuzyjne zostaną zbliżone do siebie w wyniku oddziaływań białek badanych, sygnał fluorescencyjny zostaje zrekonstruowany3-6. Ponieważ jego sygnał jest łatwo wykrywalny za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej, BiFC stało się potężnym i preferowanym narzędziem biologów komórkowych do badania oddziaływań białko-białko w żywych komórkach 3. Test ten może jednak czasami dawać wyniki fałszywie dodatnie. Na przykład sygnał fluorescencyjny może zostać zrekonstruowany przez dwa fragmenty GFP rozmieszczone w odległości do 7 nm od siebie z powodu gęstego upakowania w małym przedziale subkomórkowym, a nie w wyniku specyficznych oddziaływań7.
Ze względu na te ograniczenia, wyniki uzyskane za pomocą technologii obrazowania żywych komórek powinny zostać potwierdzone niezależną metodą opartą na innej zasadzie wykrywania oddziaływań białkowych. Koimmunoprecypitacja (Co-IP) lub testy pull-down z wykorzystaniem S-transferazy glutationowej (GST) stanowią takie alternatywne metody, powszechnie stosowane do analizy oddziaływań białko-białko in vitro. Jednak w tych testach badane białka muszą być łatwo rozpuszczalne w buforze stosowanym do reakcji wiązania. W związku z tym specyficznych oddziaływań z udziałem białka nierozpuszczalnego nie można ocenić za pomocą tych technik.
W niniejszym materiale przedstawiamy protokół testu wiązania metodą nakładania białek na membranę (protein membrane overlay binding assay), który pozwala uniknąć tych trudności. W tej technice można wiarygodnie badać oddziaływania między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi, ponieważ jedno z białek zostaje unieruchomione na macierzy membranowej. Metoda ta, w połączeniu z eksperymentami in vivo, takimi jak BiFC, stanowi niezawodne podejście do badania i wiernego charakteryzowania oddziaływań między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi. W niniejszym artykule, przy użyciu tej techniki, zademonstrowano wiązanie między białkiem ruchu (MP) wirusa mozaiki tytoniu (TMV), które pełni wiele funkcji podczas transportu wirusa z komórki do komórki8-14, a niedawno zidentyfikowanym roślinnym interaktorem komórkowym – białkiem tytoniu zawierającym powtórzenia ankyryny (ANK) 15.

Badanie oddziaływań białko-białko jest niezbędne do analizy funkcjonalności białek. W niniejszym materiale przedstawiamy test wiązania białko-białko in vitro, służący do badania interakcji między białkiem unieruchomionym w błonie a białkiem rozpuszczalnym. Test ten stanowi niezawodną metodę sprawdzania oddziaływań pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem w roztworze.

Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

Walidacja oddziaływań między różnymi białkami jest kluczowa dla badania ich funkcji biologicznych na poziomie molekularnym. Istnieje kilka ...

Testowanie białek. Oddziaływania białkowe są niezbędne do analizy funkcjonalności białek. Niniejszy film prezentuje test wiązania białko-białko in vitro, służący do badania oddziaływań między białkiem błonowym lub unieruchomionym a białkiem rozpuszczalnym.W pierwszej kolejności białka fuzyjne są klonowane, ekspresowane i ekstrahowane. Znaczone białko nierozpuszczalne jest unieruchamiane na membranie nitrocelulozowej, a następnie poddawane procesowi refoldingowi w celu przywrócenia jego natywnej konformacji. Membrana jest następnie inkubowana ze znakowanymi białkami rozpuszczalnymi, po czym przeprowadza się immunoblotting w celu wykrycia białek.Jeśli oznakowane białka oddziałują ze sobą, zostają one wychwycone przez białko unieruchomione na membranie, co pozwoli na zaobserwowanie sygnału w immunoblottingu. W ten sposób badanie to stanowi niezawodną metodę testowania oddziaływań pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem w roztworze. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak GST pull down, jest możliwość wiarygodnej oceny wiązania pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem rozpuszczalnym in vitro.Pierwszym krokiem tej procedury jest wytworzenie białek z markerami genetycznymi w celu ich detekcji. Należy rozpocząć od klonowania białka, które zostanie unieruchomione na membranie. Oznacza się je jako pro Im (białko unieruchomione) w wektorze ekspresyjnym kodującym duży marker, taki jak GST; pusty wektor ekspresyjny, kodujący jedynie marker, będzie służył jako kontrola negatywna białka unieruchomionego i jest oznaczany jako pro IM nc.Następnie należy sklonować białko, które będzie służyć jako sonda rozpuszczalna, do wektora ekspresyjnego kodującego inny znacznik, taki jak strep two. Będzie ono określane jako prosol. W celu uzyskania kontroli negatywnej, sklonować rozpuszczalne białko kontrolne do tego samego wektora ekspresyjnego. Będzie ono określane jako Prosol NC (od ang. soluble protein negative control).Następnie należy wykorzystać system ekspresji białek, taki jak E. coli lub wirus baculowirus, aby wyekspresować białka z przyłączonymi znacznikami. System ekspresyjny powinien zostać starannie wybrany w zależności od wymagań dotyczących modyfikacji potranslacyjnych. Wyekstrahować wyekspresowane białka z wybranego organizmu. Dla pro IM i pro I mnc Resus.Resuspensuj komórki w buforze do ładowania żelu SDS-PAGE zawierającym koktajl inhibitorów proteaz. Następnie gotuj komórki przez pięć minut, a potem odwiruj je w celu usunięcia osadu, aby wyekstrahować Prosol i prosol NC. Zastosuj standardowe procedury. Pro IMS można ekstrahować w warunkach denaturujących, ponieważ białka ulegną ponownemu sfałdowaniu po unieruchomieniu na błonie nitrocelulozowej.Należy jednak wyekstrahować prosol, aby uzyskać potwierdzenie natywności, ponieważ zostaną one dodane do buforu wiążącego po wyekstrahowaniu białek z etykietą. Należy określić stężenie białek rekombinowanych za pomocą standardowej metody, takiej jak zestaw do oznaczania białek BioRad. W przypadku, gdy do analizy zostanie użyty ekstrakt surowy zamiast oczyszczonego białka.Oszacuj stężenie badanego białka za pomocą densytometrii skanującej odpowiadającego mu prążka na żelu SDS-PAGE barwionym kumasą. Jako referencję wykorzystaj znane stężenia BSA. Następnie wykreśl krzywą wzorcową na podstawie intensywności sygnału zmierzonej densytometrią skanującą BSA i oblicz ilość białka zawartą w ekstrakcie surowym.Kolejnym krokiem procedury jest immobilizacja pro Iam oraz pro IAM NC na membranie. Należy rozpocząć od nałożenia 1 µg ekstraktów pro Iam oraz pro IAM NC, każdy w dwóch powtórzeniach, na żel poliakrylamidowy SDS. Po elektroforezie żel należy wyjąć z szklanych płytek i umieścić w 100 mL buforu do transferu, a następnie inkubować przy łagodnym mieszaniu przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Po inkubacji przeprowadź analizę western blot, aby przenieść białka na membranę nitrocelulozową, a następnie pozostaw membranę, aby związane z nią białka uległy ponownemu sfałdowaniu. Umieść membranę w 15 ml buforu A i inkubuj przy delikatnym mieszaniu. W celu usunięcia pozostałości SDS inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu.Po inkubacji ostrożnie wyjmij membranę z buforu. Następnie umieść membranę w 25 mililitrach buforu do denaturacji. Inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu.Podczas inkubacji membrana nitrocelulozowa stanie się nieprzezroczysta. Następnie, za pomocą pęsety, przenieś membranę do 25 ml TBS i inkubuj przy delikatnym mieszaniu przez pięć minut. Na tym etapie membrana powraca do swojego pierwotnego białego koloru.Następnie przenieść membranę do 25 ml buforu wiążącego. Inkubować w temperaturze 4 °C przy łagodnym mieszaniu przez noc. W kolejnym kroku białko rozpuszczalne zostanie wykorzystane do sondowania membrany w celu wykrycia białka unieruchomionego.W pierwszej kolejności należy przygotować bufory do hybrydyzacji, rozcieńczając od 1 do 10 µg prosol oraz prosol NC w osobnych probówkach zawierających 10 ml świeżego buforu wiążącego. Następnie należy przenieść bufor do worka do hybrydyzacji. W kolejnym kroku membranę należy przeciąć na dwa paski, z których każdy zawiera pro IM oraz pro IAM nc.Membrany te należy umieścić w buforze do hybrydyzacji. Przenieś każdą membranę do roztworu do hybrydyzacji prosol lub prosol NC i inkubuj przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu. Wyjmij membrany z roztworów do hybrydyzacji i wypłucz trzykrotnie przez 15 minut w TBS.Aby zwizualizować oddziaływania białko-białko, należy zablokować membranę 2,5% mlekiem odtłuszczonym w TBST przez jedną godzinę. Po inkubacji zablokowane membrany należy umieścić w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego. W tym przypadku zastosowano poliklonalne przeciwciało królicze anty-strep two.Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu po inkubacji. Płukać membrany w 20 ml TBST przez 15 minut oraz dwukrotnie przez pięć minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu. Następnie umieścić membrany w roztworze przeciwciał wtórnych sprzężonych z HRP; w tym przypadku stosuje się przeciwciało anty-rabbit IgG sprzężone z HRP.Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu. Przemyć membrany w 20 ml TBST przez 15 minut oraz dwukrotnie przez pięć minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu, analogicznie jak poprzednio; po końcowym przemyciu w TBS, zwizualizować oddziaływanie białko-białko przy użyciu chemiluminescencyjnego substratu HRP firmy Millipore (Molan Western Chemiluminescent).Substrat HRP jest stosowany po immunoblottingu prosolu. Płucz membranę w TBST przez 15 minut, a następnie dwukrotnie przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie inkubuj membrany z przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko znacznikowi pro.Następnie zastosowano odpowiednie przeciwciało wtórne. Aby zweryfikować tożsamość prążków uzyskanych w teście overlay białek na błonie, zwizualizowano PRO I oraz pro Im NNC poprzez detekcję chemiluminescencji. Interakcję pomiędzy białkami A i K oraz YFP i MP CYFP oceniono w komórkach epidermy tytoniu, stosując metodę opisaną w tym filmie, zgodnie z prezentacją w tym miejscu.Podczas oceny biomolekularnej komplementacji fluorescencji odtworzono silny sygnał YFP. Sygnał BFC ten gromadził się w punktach (Punta) na obwodzie komórki, co jest charakterystyczne dla błony plazmatycznej, ponieważ MP jest białkiem wysoce nierozpuszczalnym. W przypadku ekspresji w bakteriach lub roślinach, w celu walidacji tej interakcji zastosowano test nakładania białek błonowych (protein membrane overlay assay).Ekstrakty białkowe in vitro zawierające 1 µg GST MP lub niepołączonego GST rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z SDS, a następnie przeniesiono elektroforetycznie na membranę nitrocelulozową. Po inkubacji tych membran z rozpuszczalnym a nnk strep two, wiązanie wykazywało GST mp, ale nie niepołączone GST. Co więcej, gdy ten sam zestaw membran poddano analizie z użyciem niepowiązanego białka saw nc IE Arabidopsis Cytoplasmic, NADH kinase tagged strep two, nie zaobserwowano wiązania, co dodatkowo potwierdziło specyficzność interakcji A NK MP. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o prawidłowym uzupełnieniu unieruchomionych białek zgodnie z przedstawionym protokołem.

protein-membrane-overlay-assay-protocol-to-test-interaction-between

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test nakładania błon białkowych: Protokół testowania interakcji między białkami rozpuszczalnymi i nierozpuszczalnymi in vitro

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Ten film demonstruje koimmunoprecypitowane kompleksy białkowe na membranie PVDF do analizy interakcji białko-białko. Zredukowane białka z kompleksów potraktowano trypsyną w celu rozszczepienia poszczególnych białek na mniejsze peptydy, a następnie pozostałe peptydy wyekstrahowano z błony PVDF. Wyciągnięty peptyd pochodzący z obu białek w kompleksie został następnie wysuszony i ponownie zawieszony w niskim stężeniu kwasu mrówkowego w celu dalszej analizy.

Trawienie białek na błonie w celu przygotowania białek współimmunoprecypitowanych do badań interakcji

W tym filmie pokazaliśmy oczyszczanie powinowactwa do komplementacji bimolekularnej, BiCAP, do wykrywania i izolowania specyficznych dimerów białkowych za pomocą specyficznych dla konformacji przeciwciał jednodomenowych.

Oczyszczanie powinowactwa do komplementacji bimolekularnej w celu wyizolowania dwóch oddziałujących białek

Opisano podejście biochemiczne do identyfikacji in vivo interakcji białko-białko (PPI) białek błonowych. Metoda łączy w sobie sieciowanie białek, oczyszczanie powinowactwa i spektrometrię mas i można ją dostosować do prawie każdego typu komórki lub organizmu. Dzięki takiemu podejściu możliwa staje się nawet identyfikacja przejściowych IPP.

Membrane-SPINE: narzędzie biochemiczne do identyfikacji interakcji białko-białko białek błonowych in vivo

Oligomeryzacja receptora ryanodyny, homo-tetramerycznego kanału jonowego pośredniczącego w uwalnianiu Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów, jest krytyczna dla skurczu mięśnia szkieletowego i sercowego. W tym artykule przedstawiono komplementarne metody in vivo i in vitro do wykrywania samoasocjacji białek i wyznaczania stechiometrii homo-oligomerów.

Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Tutaj prezentujemy protokół koimmunoprecypitacji i test aktywności enzymatycznej na koraliku, aby jednocześnie badać udział specyficznych domen białkowych receptorów błony komórkowej zarówno w rekrutacji enzymów, jak i ich aktywności.

Test koimmunoprecypitacji do badania funkcjonalnych interakcji między receptorami i enzymami

Tutaj prezentujemy protokół techniki trawienia na błonie do przygotowania próbek do spektrometrii mas. Technika ta ułatwia wygodną analizę oddziaływań białko-białko.

Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

Przedstawione tutaj są protokoły do testów biochemicznych in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny, które mogą być szeroko stosowane do badania interakcji białko-kwas nukleinowy.

Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy

Ten protokół skupia się na identyfikacji białek, które wiążą się z fosforanami inozytolu lub fosfonozytydami. Wykorzystuje chromatografię powinowactwa z biotynylowanymi fosforanami inozytolu lub fosfoinozytydami, które są unieruchamiane przez streptawidynę do agarozy lub kulek magnetycznych. Fosforan inozytolu lub białka wiążące fosfoinozytol są identyfikowane za pomocą Western blot lub spektrometrii mas.

Identyfikacja białek oddziałujących z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytylem za pomocą chromatografii powinowactwa sprzężonej ze spektrometrią Western Blot lub spektrometrią mas

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do szybkiego i półilościowego pomiaru interakcji ligand-receptor w trans w heterologicznym systemie komórkowym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Pomiar interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w heterologicznym systemie komórkowym

Poznaj metodę nakładania błony białkowej do badania interakcji między białkami nierozpuszczalnymi immobilizowanymi na membranie a białkami rozpuszczalnymi. Technika ta umożliwia niezawodne testowanie wiązań białkowych in vitro.

Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

Przeglądaj więcej filmów