Ładowanie kulek w celu wprowadzenia kwasów nukleinowych do przylegających komórek hodowlanych: technika ładowania plazmidów kodujących białka fluorescencyjne do przylegających komórek ssaków

Zacznij od hodowli przylegających komórek ssaków na płytce hodowlanej. Przenieś wysterylizowane szklane kulki poddane działaniu alkaliów o rozmiarach mikronowych do komory dostosowanego urządzenia do ładowania kulek. Zakryj otwór komory siatką z otworami o optymalnym rozmiarze, aby umożliwić przejście kulek podczas załadunku. Zabezpiecz siatkę za pomocą zespołu komory obrazowania.

Wyjmij nośnik z płyty. Odpipetować zawiesinę fluorescencyjnego plazmidowego DNA kodującego białko reporterowe do płytki w celu równomiernego rozprowadzenia na komórkach. Za pomocą urządzenia do ładowania kulek delikatnie rozprowadź monowarstwę szklanych kulek na komórkach. Postukaj krótko w płytkę hodowlaną z odpowiednią siłą.

Szklane kulki na krótko toczą się na wierzchu przylegających komórek, podczas gdy obróbka alkaliczna sprawia, że mniej przylegają do komórek. Wpływ zderzeń między kulkami a komórkami przenosi odpowiednie obciążenie, tworząc miejscowe zakłócenia w błonach komórkowych. Te uformowane przejściowe pory o małych rozmiarach ułatwiają wchłanianie plazmidowego DNA do komórek, jednocześnie zapobiegając przedostawaniu się dużych kulek.

W okresie rekonwalescencji błona komórkowa ponownie się uszczelnia, przywracając integralność błony i zatrzymując plazmidowe DNA. Dodaj podłoże do płytki i ostrożnie odessaj z płytki wszelkie widoczne pływające koraliki. Inkubuj płytkę.

Pomyślnie transfekowane komórki zawierające plazmidowe DNA wykazują ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, które można uwidocznić pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Usuń pożywkę z komórek i delikatnie zassaj całą pożywkę z okolic krawędzi komory. Następnie przechyl komorę pod kątem około 45 stopni i usuń pozostałą kroplę pożywki z centralnej mikrostudzienki. Delikatnie odpipetuj roztwór ładujący kulki do szklanej mikrostudzienki znajdującej się w środku komory.

Użyj aparatu do ładowania kulek, aby delikatnie rozprowadzić monowarstwę szklanych kulek na wierzchu komórek. Upewnij się, że koraliki całkowicie zakrywają komórki. Ściśnij komorę dwoma palcami. Podnieś go o około dwa cale i mocno opuść, używając siły w przybliżeniu równej upuszczeniu naczynia z tej wysokości.

Delikatnie dodaj pożywkę z powrotem do komory, powoli pipetując na plastikową stronę komory. Zasysaj wszelkie pływające koraliki, nie naruszając komórek. Cała procedura ładowania kulek powinna być wykonana stosunkowo szybko, aby komórki nie wysychały, gdy są bez pożywki. Następnie inkubuj komórki przez 0,5 do 2 godzin w inkubatorze.