Hydrodynamiczne dostarczanie genów: technika transfekcji in vivo egzogennego DNA w mysich hepatocytach poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej

Aby przeprowadzić hydrodynamiczny transfer genów, zacznij od pobrania strzykawki wypełnionej roztworem soli fizjologicznej zawierającym rekombinowane plazmidy przenoszące interesujący nas gen. Następnie weź model mysi i szybko wstrzyknij dużą objętość roztworu plazmidu u podstawy ogona, upewniając się, że roztwór plazmidu jest wstrzykiwany dożylnie do żyły ogonowej.

Wstrzyknięcie pod ciśnieniem dużej ilości plazmidów generuje siłę mechaniczną zwaną siłą hydrodynamiczną, która zwiększa ciśnienie wewnątrznaczyniowe w żyle głównej dolnej - żyle, która przenosi odtlenioną krew do serca.

Duża objętość płynu wywołuje przekrwienie w prawej komorze serca, wymuszając odwrócenie w kierunku krwi. Ten krok zmusza roztwór plazmidu do wejścia do żyły wątrobowej, która przenosi go do wątroby.

Plazmidy poruszają się wewnątrz sinusoid wątrobowych - przestrzeni w wątrobie wyściełanych komórkami śródbłonka. Zwiększona objętość krwi pomaga plazmidom przenikać przez warstwę śródbłonka, pomagając im dotrzeć w pobliże otaczających hepatocytów - komórek wątroby.

Szybki napływ roztworu plazmidu indukuje nacisk na błonę komórkową hepatocytów, generując przejściowe pory. Pory te ułatwiają komórkom wychwyt plazmidowego DNA. Później pory błony zamykają się, zatrzymując plazmidy w hepatocytach.

Udana ekspresja interesującego genu w hepatocytach potwierdza transfekcję.

Zacznij od zważenia myszy, a następnie przygotuj sterylny roztwór soli fizjologicznej zawierający 15 mikrogramów na mililitr soli fizjologicznej bez endotoksyn konstruktu wektorowego śpiącej królewny i 1 mikrogram na mililitr bez endotoksyn pc-HSB5. Przygotuj wystarczającą ilość roztworu, aby wstrzyknąć każdej myszy objętość równą 10% masy ciała. Napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 3 mililitrów wymaganą objętością dla jednej myszy i przymocuj igłę o rozmiarze 27.

Po dodaniu odpowiedniej ilości bibuły, aby pozostawić minimalną przestrzeń do ruchu, ale wystarczająco dużo miejsca na oddychanie, włóż mysz do odpowiedniego ogranicznika z otworami oddechowymi. Ogrzej ogon za pomocą lampy na podczerwień przez 30 do 60 sekund, uważnie obserwując oznaki przegrzania, takie jak szybki ruch ogona lub inne oznaki pobudzenia, a następnie wyczyść ogon wacikiem nasączonym alkoholem.

Wbić igłę prawie poziomo do jednej z dwóch bocznych żył ogonowych w pobliżu podstawy ogona. W przypadku pomyślnego umieszczenia, niewielka ilość krwi może spłynąć z powrotem do stożka igły. Wstrzyknąć całkowitą objętość do żyły ogonowej w ciągu 8 do 10 sekund. Po wstrzyknięciu należy natychmiast wyjąć mysz z ogranicznika. Uciskać ranę po wstrzyknięciu sterylną gazą przez co najmniej 30 sekund lub do momentu ustąpienia krwawienia.

Udane hydrodynamiczne wstrzyknięcie żyły ogonowej ma kluczowe znaczenie dla transfekcji, a zwłaszcza zależy od prędkości, objętości i czasu iniekcji. Aby ułatwić wstrzyknięcie dożylne, należy upewnić się, że myszy nie są zestresowane ani odwodnione w dniu wstrzyknięcia.

Po 30 do 60 minutach samodzielnego trzymania w klatce odzyskiwania przenieś mysz z powrotem do pierwotnej klatki.