Chromatografia kationowymienna: technika izolowania docelowego białka rekombinowanego z lizatu komórek owadów na podstawie ładunku powierzchniowego netto
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:33 min. • July 8th, 2025
Chromatografia kationowymienna ułatwia separację białek z mieszanin na podstawie ich ładunku powierzchniowego netto.
W celu izolacji białka przetwornika sygnału docelowego z lizatu białka komórek owadów należy otrzymać dializowany lizat białka docelowego zawierający inne białka zanieczyszczające. Dodaj bufor zawierający chlorek sodu, aby zmniejszyć lepkość lizatu i poprawić rozpuszczalność białek, co pomaga zapobiegać zatykaniu się kolumny chromatograficznej podczas pracy.
Dodatkowo, pH buforu poniżej punktu izoelektrycznego białka docelowego, pI, w którym białko ma zerowy ładunek netto, ułatwia wiązanie nadmiaru jonów wodorowych z ujemnymi grupami karboksylowymi, dzięki czemu białko docelowe jest naładowane dodatnio.
Zmontować kolumnę chromatograficzną zawierającą usieciowane kulki agarozy sprzężone z ujemnie naładowanymi grupami. Dodaj bufor wiążący, aby zrównoważyć kolumnę i zmaksymalizować interakcje kolumna-białko. Załadować rozcieńczony lizat na wyrównaną kolumnę.
Bardziej dodatnio naładowane białka docelowe oddziałują i ściśle wiążą się z ujemnie naładowanymi grupami kolumny niż mniej dodatnio naładowane białka zanieczyszczające.
Przemyć kolumnę buforem w celu usunięcia niez
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych