$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Chromatografia kationowymienna ułatwia separację białek z mieszanin na podstawie ich ładunku powierzchniowego netto.
W celu izolacji białka przetwornika sygnału docelowego z lizatu białka komórek owadów należy otrzymać dializowany lizat białka docelowego zawierający inne białka zanieczyszczające. Dodaj bufor zawierający chlorek sodu, aby zmniejszyć lepkość lizatu i poprawić rozpuszczalność białek, co pomaga zapobiegać zatykaniu się kolumny chromatograficznej podczas pracy.
Dodatkowo, pH buforu poniżej punktu izoelektrycznego białka docelowego, pI, w którym białko ma zerowy ładunek netto, ułatwia wiązanie nadmiaru jonów wodorowych z ujemnymi grupami karboksylowymi, dzięki czemu białko docelowe jest naładowane dodatnio.
Zmontować kolumnę chromatograficzną zawierającą usieciowane kulki agarozy sprzężone z ujemnie naładowanymi grupami. Dodaj bufor wiążący, aby zrównoważyć kolumnę i zmaksymalizować interakcje kolumna-białko. Załadować rozcieńczony lizat na wyrównaną kolumnę.
Bardziej dodatnio naładowane białka docelowe oddziałują i ściśle wiążą się z ujemnie naładowanymi grupami kolumny niż mniej dodatnio naładowane białka zanieczyszczające.
Przemyć kolumnę buforem w celu usunięcia niezwiązanych, ujemnie naładowanych białek zanieczyszczających. Następnie przepuścić bufor elucyjny, stopniowo zwiększając jego siłę jonową.
Przy niskiej sile jonowej występuje minimalna konkurencja między jonami dodatnimi a białkami o grupy ujemne w kolumnie, eluując słabo związane, mniej dodatnio naładowane białka zanieczyszczające. Jednak wraz ze wzrostem siły jonowej jony soli konkurują ze ściśle związanymi białkami przetwornika sygnału docelowego i redukują interakcje między białkami a kolumną, eluując je jako oczyszczoną frakcję.
Przygotować 20-mililitrową kolumnę kationowymienną, przemłukując ją trzema objętościami buforu G, a następnie trzema objętościami buforu F. Następnie rozcieńczyć 20 mililitrów dializowanej próbki do końcowego stężenia chlorku sodu wynoszącego 100 milimolów, dodając 20 mililitrów buforu E i nałożyć próbkę do kolumny wymiennej.
Bardzo ważne jest, aby rozcieńczyć niewielką ilość próbki, a nie wszystkie na raz, a rozcieńczone próbki należy nałożyć na kolumnę natychmiast po rozcieńczeniu, aby ograniczyć wytrącanie się białka.
Kontynuować ładowanie kolumny świeżo rozcieńczoną próbką, ponieważ poprzednie rozcieńczenie zbliża się do końca wsadu. Następnie przepłukać kolumnę do absorbancji wyjściowej 280 za pomocą buforu F, co zwykle wymagało trzech objętości kolumny.
Eluować białko z kolumny o 400-mililitrowym gradicie od buforu F do 65% buforu G, zbierając eluat we frakcjach 6-mililitrowych. Po zakończeniu gradientu kontynuuj mycie kolumny przez dodatkowe 1,5 objętości kolumny 65% buforu G.