Name: Izolacja i charakterystyka egzosomów zawierających RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj metody izolacji i charakteryzacji egzosomów zawierających RNA z mediów hodowlanych i płynów biologicznych. Techniki ultrawirówki, mikroskopii elektronowej i cytometrii przepływowej umożliwiają analizę morfologii i składu białkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało sfinansowane przez Szwedzką Radę Badawczą (K2008-57X-20 676-01-3).

1. Izolacja egzosomów
<ol>
	<li>Hodować komórki w pożywce z surowicą pozbawioną egzosomów. W związku z tym każda surowica dodawana do pożywki hodowlanej powinna zostać uprzednio oczyszczona z egzosomów poprzez ultrecentryfugację przy 120 000 x g przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórkową do probówek stożkowych.</li>
	<li>Centryfugować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.</li>
	<li>Przenieść supernatant do probówek do ultrecentryfugowania i w razie potrzeby uzupełnić objętość za pomocą PBS.</li>
	<li>Centryfugować próbkę przy 16 500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, aby dodatkowo usunąć komórki i szczątki komórkowe.</li>
	<li>Przefiltrować supernatant przez filtr 0,2 μm w celu usunięcia cząsteczek większych niż 200 nm.</li>
	<li>Przenieść przefiltrowany supernatant do nowych probówek do ultrecentryfugowania i szczelnie zamknąć probówki przed ultrecentryfugacją przy 120 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia egzosomów.</li>
	<li>Odlać supernatant.</li>
	<li>Aby uzyskać maksymalną odzyskowalność egzosomów, wielokrotnie resuspender osad wzbogacony w egzosomy w małej objętości (~3 x 50 μl) odpowiedniego buforu. Wybór buforu zależy od planowanych dalszych eksperymentów po izolacji egzosomów. Na przykład bufor do lizy jest stosowany do izolacji białek i RNA, PBS jest używany do mikroskopii elektronowej i cytometrii przepływowej, a do badań funkcjonalnych preferowana może być pożywka.</li>
</ol>
Uwaga; egzosomy można również izolować z różnych płynów ustrojowych, takich jak osocze, stosując tę samą procedurę co w przypadku pożywek hodowlanych. W przypadku płynów o dużej lepkości konieczne może być rozcieńczenie próbki w PBS przed etapem wirowania i filtracji. Odnośnie do prędkości wirowania w punkcie 5 powyżej, można ją zwiększyć do 29 500 x g, a ultrawirowanie w punkcie 7 można wydłużyć do 90 minut18.
Jeśli próbka wymaga dalszego oczyszczenia, osad egzosomów można poddać flotacji w gradiencie sacharozy; egzosomy będą występować głównie w frakcji odpowiadającej gęstości 1,13-1,19 g/ml2.
2. Identyfikacja egzosomów za pomocą mikroskopii elektronowej
<ol>
	<li>Aby dodatkowo usunąć zanieczyszczające białka, ponownie zawiesić pellet wzbogacony w egzosomy w PBS i poddać ultracentryfugowaniu przy 120 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C, aby ponownie wytrącić egzosomy w formie pelletu.</li>
	<li>Pobrać małą alikwot próbki do izolacji białek i pomiaru całkowitej zawartości białka. Należy upewnić się, że tylko niewielka część próbki zostanie poddana lizie i wykorzystana do pomiaru białka, natomiast nienaruszone egzosomy zawieszone w PBS należy przechowywać oddzielnie na lodzie lub w temperaturze -80 °C do dalszych eksperymentów.</li>
	<li>Nanieść na Parafilm kroplę zawierającą około 10 μg białka egzosomalnego z nienaruszonych egzosomów zawieszonych w PBS. Następnie, za pomocą pęsety, delikatnie ułożyć na każdej kropli siatkę niklową powleczoną węglem i formvarem na 30-60 minut. Należy upewnić się, że siatka jest ułożona stroną z powłoką skierowaną w stronę kropli zawierającej egzosomy.</li>
	<li>Nanieść na Parafilm trzy krople PBS, każda po 30 μl, i przemyć siatkę, kolejno przenosząc ją na krople PBS, używając pomiędzy nimi papieru absorbującego. Papier absorbujący należy stosować delikatnie, przytrzymując go blisko krawędzi siatki, bez kontaktu z obszarem powleczonym.</li>
	<li>Utrwalić próbkę, nanosząc na Parafilm kroplę 2% paraformaldehydu i kładąc siatkę na kropli na 10 minut.</li>
	<li>Powtórzyć etap płukania opisany w punkcie 4 przed immunostainingiem z zastosowaniem odpowiedniego przeciwciała. Powszechnie stosowane przeciwciała to anty-CD63 oraz anty-MHC klasy II. Mikroskopia elektronowa może być również przeprowadzona bez immunostainingu, ponieważ egzosomy można zidentyfikować wyłącznie na podstawie wielkości i morfologii. Zaleca się jednak ocenę wielkości, morfologii oraz obecności białka błonowego w celu uzyskania bardziej rozstrzygającej walidacji.</li>
	<li>Przenieść siatkę do 30 μl kropli wybranego przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować przez 40 minut. Przemyć, powtarzając czynność z punktu 4, ale zamiast samego PBS użyć 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS.</li>
	<li>Powtórzyć czynność z punktu 7, ale z zastosowaniem przeciwciała drugorzędowego znakowanego złotem 10 nm i przemyć samym PBS.</li>
	<li>Dofiksować próbkę, dodając na Parafilm kroplę 2,5% glutaraldehydu i inkubując siatkę na kropli przez 10 minut. Powtórzyć płukanie z punktu 4, ale zamiast trzech kropli PBS użyć pięciu kropli wody dejonizowanej.</li>
	<li>Poddać próbkę kontrastowaniu, dodając na Parafilm kroplę 2% octanu uranylu i inkubując siatkę na kropli przez 15 minut.</li>
	<li>Zatopić próbkę, dodając na Parafilm kroplę 0,13% metylocelulozy i 0,4% octanu uranylu, a następnie inkubować siatkę na kropli przez 10 minut.</li>
	<li>Usunąć nadmiar cieczy, delikatnie używając papieru absorbującego, a następnie położyć siatkę na papierze stroną z powłoką do góry i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut.</li>
	<li>Zbadać preparaty pod mikroskopem elektronowym lub przechowywać siatki w pudełku na siatki do przyszłych prac.</li>
</ol>
3. Charakterystyka egzosomów metodą cytometrii przepływowej
Ponieważ egzosomy są zbyt małe, aby mogły zostać wykryte przez obecny sprzęt do cytometrii przepływowej, konieczne jest uprzednie związanie egzosomów z kuleczkami pokrytymi przeciwciałami (Rysunek 1). Kuleczki te można nabyć jako gotowy produkt lub przygotować w laboratorium, stosując odpowiednie przeciwciało. W zależności od pochodzenia komórkowego egzosomów, do kuleczek – które mogą być magnetyczne lub lateksowe – można przyłączyć różne przeciwciała. W niniejszej analizie obecnie stosujemy kuleczki pokryte przeciwciałami anty-MHC klasy II lub anty-CD63.
<ol>
	<li>W przypadku stosowania „samodzielnie przygotowanych” kulek pokrytych przeciwciałami, używamy 4 μm lateksowe koraliki pokryte przeciwciałem anty-CD63. Przemyć 25 μl 4 μm kuleczki lateksowe (30 x 106 kuleczki) dwukrotnie w 100 μl bufor MES, 3 000 x g przez 15–20 minut, a następnie ponownie rozpuścić osad w 100 μl bufor MES. Przygotować mieszaninę przeciwciał zawierającą objętość równą 12.5 μg przeciwciała taką samą objętością buforu MES. Dodać kulki do mieszaniny przeciwciał i inkubować w warunkach mieszania przez noc w temperaturze pokojowej. Przemyć kulki pokryte przeciwciałami trzykrotnie za pomocą PBS (3 000 x g przez 20 minut) i rozpuścić osad w 100 μl buforu do przechowywania (z końcowym stężeniem 300 000 kulek/μl).</li>
	<li>Dla każdej próbki (każdego przeciwciała) kontynuować, stosując objętość równą co najmniej 30 μg białka egzosomalnego (z nienaruszonych egzosomów rozpuszczonych w PBS) na ok. 100 000 kuleczek powlekanych przeciwciałami.</li>
	<li>Inkubować egzosomy i kuleczki w całkowitej objętości 300 μl PBS, przez noc w temperaturze 4 °C przy łagodnym mieszaniu.</li>
	<li>Blokowanie poprzez dodanie 300 μl z 200 mM glicyną i inkubować przez 30 minut.</li>
	<li>Kompleksy egzosom-bead przemyć dwukrotnie w buforze do przemywania (1–3% surowicy w PBS), wirując przy 600 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Inkubować kompleksy egzosom-beads z 50 μl przeciwciało IgG w stężeniu 4 °CKompleksy egzosom-perełka przemyć dwukrotnie w buforze do przemywania zgodnie z opisem w kroku 5.</li>
	<li>Dodaj 90 μl bufor płuczący i 10 μl odpowiednie przeciwciało (najlepiej anty-CD9, anty-CD63 lub anty-CD81) do kompleksów egzosom-perełka i inkubować przez 40 minut przy łagodnym mieszaniu. Przemyć kompleksy egzosom-perełka dwukrotnie w buforze do przemywania, zgodnie z opisem w kroku 5.</li>
	<li>Dodaj 300 μl przemyć buforem do płukania i zebrać dane za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
Jak omówiono powyżej, można zastosować różne rodzaje kulek, takie jak kulki lateksowe opisane w protokole lub kulki magnetyczne. W przypadku zastosowania kulek magnetycznych należy pamiętać, że protokół jest nieco inny. Krok blokowania (punkt 4) nie jest wymagany, a płukanie przeprowadza się poprzez umieszczenie probówki w statywie magnetycznym zamiast wirowania w wirówce.
Bufor do przechowywania wykorzystywany dla „domowych” kulek powlekanych przeciwciałami zawiera 0,1% glicyny i 0,1% azotku sodu w PBS o pH 7,2.
Ważne jest, aby do buforu płuczącego w cytometrii przepływowej (1-3% surowicy w PBS) użyć surowicy pozbawionej egzosomów, aby uniknąć zanieczyszczenia analizy egzosomami z surowicy.
Uwaga: podczas przeprowadzania charakterystyki egzosomów z wykorzystaniem kulek sprzężonych z przeciwciałami należy pamiętać, że izolowana i charakteryzowana jest jedynie specyficzna subpopulacja, właściwa dla użytego przeciwciała.
4. Wykrywanie egzosomów metodą Western blot
Western blot jest dobrze ugruntowaną metodą, dlatego nie będziemy szczegółowo omawiać samej procedury, lecz skupimy się na znaczeniu odpowiedniej izolacji białek przed analizą Western blot oraz na zastosowaniu różnych przeciwciał.
<ol>
	<li>Osad egzosomów rozpuścić w wybranym buforze do lizy białek, dokładnie pipetując, a następnie mieszając w wstrząsarze typu vortex. Aby dokończyć lizę egzosomów, próbkę sonykować w łaźni wodnej 3 x 5 minut, mieszając w międzyczasie w wstrząsarzu typu vortex. Na koniec odwirować próbkę z prędkością 13 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przenieść nadsącz do nowej probówki typu Eppendorf.</li>
	<li>Oznaczyć całkowitą zawartość białka wybraną metodą i nanieść 20-50 μg białka na każdą studzienkę.</li>
	<li>Rozdzielić i przenieść białka za pomocą elektroforezy żelowej oraz transferu białek (electroblotting).</li>
	<li>Zablokować i przemyć membranę przed przeprowadzeniem immunobarwienia przeciwko białkom wzbogaconym w egzosomach.</li>
	<li>Wykryć specyficzne białko za pomocą chemiluminescencji, cyfrowego systemu obrazowania oraz oprogramowania analitycznego.</li>
</ol>
Ponieważ nie istnieją specyficzne markery egzosomów, do ich wykrywania powszechnie stosuje się białka wzbogacone w egzosomach pochodzące z różnych typów komórek. Są to białka takie jak tetraspaniny (np. CD9, CD63 i CD81), białka związane z cytoszkieletem (np. ezryna) oraz białka zaangażowane w biogenezę ciałek wielopęcherzykowych (np. Tsg101 i alix). Innymi białkami często wykrywanymi w egzosomach są flotyllina, Hsc70 oraz różne białka rab itp. W egzosomach znajdują się jednak również białka specyficzne dla danych komórek, takie jak A33 (komórki nabłonkowe jelit), CD3 (limfocyty T) i MHC klasy II (komórki prezentujące antygen). Zatem w zależności od tego, z jakiego typu komórek uwalniane są egzosomy, markery służące do ich wykrywania mogą się różnić.
Ponieważ inne kompartmenty komórki również mogą wytwarzać pęcherzyki, zaleca się dodatkowo określić obecność białek z tych kompartmentów, takich jak siateczka śródplamkowa (np. kalneksyna i Grp78) oraz aparat Golgiego (np. GM130). W związku z tym brak tych białek wskazuje na brak lub niewielkie zanieczyszczenie pęcherzykami z innych kompartmentów w badanej próbce.
5. Izolacja RNA egzosomalnego i analiza RNA
<ol>
	<li>Rozpuścić osad egzosomów w wybranym buforze do lizy RNA i przeprowadzić ekstrakcję RNA. W zależności od planowanych dalszych eksperymentów można zastosować różne zestawy do izolacji RNA, jednak metody kolumnowe pozwalają uzyskać próbki o szerszym spektrum RNA. Obecnie stosujemy zestaw miRCURY RNA Isolation Kit firmy Exiqon, ale w zależności od stawianego pytania badawczego odpowiednie mogą być inne zestawy.</li>
	<li>Podczas izolacji RNA istotne jest praca w środowisku wolnym od RNaz. Należy zatem używać końcówek do pipet wolnych od nukleaz i kwasów nukleinowych oraz przetrzeć blat i sprzęt, aby usunąć z nich zanieczyszczenia i RNazy.</li>
	<li>W przypadku izolacji RNA przy użyciu zestawu miRCURY RNA Isolation Kit, rozpuścić osad egzosomów w 350 μl roztworu do lizy i mieszać w wstrząsarze wirowym (vortex) przez 15 sekund.</li>
	<li>Dodać 200 μl 95% etanolu i mieszać w wstrząsarzu wirowym przez 10 sekund.</li>
	<li>Umieścić kolumnę w probówce zbiorczej, przenieść zlizowane egzosomy do kolumny i wirować przez 1 minutę przy 14 000 x g.</li>
	<li>Przepłukać trzy razy, dodając do kolumny zawierającej RNA egzosomalne 400 μl roztworu do płukania (Wash Solution), a następnie wirować przez 1 minutę przy 14 000 x g.</li>
	<li>Wirować kolumnę przez 2 minuty przy 14 000 x g, aby upewnić się, że kolumna jest sucha, a następnie umieścić suchą kolumnę w probówce typu Eppendorf wolnej od RNaz.</li>
	<li>Dodać do kolumny 50 μl buforu do elucji i wirować przez 2 minuty przy 200 x g, a następnie przez 1 minutę przy 14 000 x g.</li>
	<li>Kontynuować pracę z wyizolowanym RNA lub przechowywać je w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
Do detekcji i analizy wyekstrahowanego całkowitego RNA egzosomalnego należy użyć analizatora Agilent 2100 Bioanalyzer z zestawem RNA 6000 Nano lub RNA 6000 Pico Kit. Analiza pozwala określić wydajność i rozkład wielkości RNA egzosomalnego.
6. Reprezentatywne wyniki
Egzosomy są zbyt małe, aby można było je wykryć za pomocą dostępnych metod cytometrii przepływowej, dlatego przed analizą są one przyłączane do kuleczek pokrytych przeciwciałami (Rycina 1). Ponieważ kompleksy egzosom-kuleczka mogą ulegać agregacji, wykres rozproszenia w cytometrii przepływowej może zawierać różne populacje pojedynczych, podwójnych i potrójnych kuleczek (Rycina 2A). Strzałka wskazuje pojedyncze kuleczki, które są analizowane w dalszych etapach. Populację pojedynczych kuleczek z egzosomami dodatnią pod kątem CD63 w porównaniu z kontrolą izotypową przedstawiono na Rycynie 2B.
Ze względu na niewielki rozmiar egzosomów, można je bezpośrednio wizualizować jedynie za pomocą mikroskopii elektronowej, a nie mikroskopii świetlnej. Typowe cechy morfologiczne egzosomów to pęcherzyki błonowe o okrągłym kształcie i rozmiarach 30-100 nm. Na Ryc. 3 fotografie z mikroskopii elektronowej przedstawiają egzosomy poddane immunostynowaniu (A) z użyciem przeciwciała przeciwko CD63 znakowanego złotem (wskazanego strzałką) oraz egzosomy niepoddane immunostynowaniu (B).
Aby potwierdzić, że wyizolowane pęcherzyki są rzeczywiście egzosomami, oraz w celu dalszej charakterystyki białek egzosomalnych, powszechnie stosuje się metodę Western blot. Rysunek 4 pokazuje brak kalneksyny, która jest markerem retikulum endoplazmatycznego. Wskazuje to na niewielkie zanieczyszczenie pęcherzyków materiałem z retikulum endoplazmatycznego. Ponadto Rysunek 4 wykazuje obecność CD81 w egzosomach, co jest tetraspanyną często wzbogaconą w egzosomach.
Komórkowe RNA składa się głównie z rybosomalnego RNA (rRNA), co objawia się jako dwa wyraźne piki dla podjednostek 18S i 28S rRNA w analizie Bioanalyzer (Rycyna 5A). Jednak RNA egzosomalne różni się pod względem profilu, ponieważ w egzosomach brakuje dwóch pików rRNA (18S i 28S), a są one wzbogacone w krótkie RNA, takie jak mRNA i miRNA (Rycina 5B).
<img alt="Schemat kulek CD63 lub MHC II do detekcji egzosomów metodą cytometrii przepływowej, pokazujący interakcję tetraspanyn." src="/files/ftp_upload/3037/3037fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ze względu na niewielki rozmiar egzosomów (30-100 nm), nie można ich odróżnić od szumu i tła podczas analizy metodą cytometrii przepływowej. Dlatego konieczne jest przywiązanie ich do kulek pokrytych przeciwciałami przed analizą egzosomów, co umożliwia ich późniejszą wizualizację za pomocą lasera.
<img alt="Analiza cytometryczna, schemat przedstawiający wykres kropkowy (A) i histogram (B) dla pomiaru zdarzeń komórkowych." src="/files/ftp_upload/3037/3037fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Kompleksy egzosom-perełka mogą agregować ze sobą, tworząc podwójne i potrójne perełki (A). Strzałka wskazuje populację pojedynczych perełek-egzosomów, która została wyselekcjonowana (gating) i wykorzystana do dalszych analiz. Populacja ta zostanie bezpośrednio porównana z kontrolą izotypową (wypełniony szary pik) w celu ustalenia obecności cząsteczek błonowych egzosomów. Egzosomy dodatnie pod kątem CD63 (czarny pusty pik) przedstawiono na rysunku B.
<img alt="Obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej nanocząsteczek, przedstawiające morfologię i skalę rozmiaru cząsteczek." src="/files/ftp_upload/3037/3037fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Mikrofotografie elektronowe egzosomów o typowej morfologii i rozmiarze (40-80 nm) (A i B). Strzałka na rysunku A wskazuje cząsteczkę złota przeciwciała wtórnego, potwierdzając, że ten egzosom posiada CD63 na powierzchni błony.
<img alt="Western blot, analiza białek, kalneksyna, CD81, komórki vs egzosomy, markery masy cząsteczkowej." src="/files/ftp_upload/3037/3037fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Wyniki Western blot wykazujące brak białka siateczki śródplazmatycznej – kalneksyny, przy jednoczesnej obecności białka często wzbogaconego w egzosomach, tetraspaniny CD81.
<img alt="Wyniki chromatografii; wykres z dwoma pikami (A) i analiza szerokiego spektrum (B) dla analizy białek." src="/files/ftp_upload/3037/3037fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Wyniki Bioanalyzatora wykazujące obecność RNA w komórkach (A) i egzosomach (B). Strzałki wskazują podjednostki 18S i 28S rRNA obecne w komórkach. Ponieważ RNA egzosomalne zawiera głównie małe RNA, w egzosomach nie zidentyfikowano lub zidentyfikowano niewielką ilość rRNA.

<ol><li>Pan, B. -T., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+the+transferrin+receptor+during+maturation+of+sheep+reticulocytes+in+vitro%3A+Selective+externalization+of+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: Selective externalization of the receptor.</a> Cell. 33, 967-978 (1983).</li>
<li>Chaput, N., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+immune+properties+and+potential+clinical+implementations%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: immune properties and potential clinical implementations.</a> Semin. Immunopathol. , 10-1007 (2010).</li>
<li>Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-containing+exosomes+in+human+nasal+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Rhinol.+Allergy%22%5BJournal%5D)">RNA-containing exosomes in human nasal secretions.</a> Am. J. Rhinol. Allergy. 25, 89-93 (2011).</li>
<li>Caby, M. -P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).</li>
<li>Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5, e8577-e8577 (2010).</li>
<li>Admyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).</li>
<li>Almqvist, N., Lönnqvist, A., Hultkrantz, S., Rask, C., Telemo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-derived+exosomes+from+antigen-fed+mice+prevent+allergic+sensitization+in+a+model+of+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Serum-derived exosomes from antigen-fed mice prevent allergic sensitization in a model of allergic asthma.</a> Immunology. 125, 21-27 (2008).</li>
<li>Prado, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+Bronchoalveolar+Fluid+of+Tolerized+Mice+Prevent+Allergic+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes from Bronchoalveolar Fluid of Tolerized Mice Prevent Allergic Reaction.</a> J. Immunol. 181, 1519-1525 (2008).</li>
<li>Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+established+murine+tumors+using+a+novel+cell-free+vaccine%3A+dendritic+cell-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Medicine%22%5BJournal%5D)">Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes.</a> Nature. Medicine. 4, 594-600 (1998).</li>
<li>Ashiru, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Is+Suppressed+by+Exposure+to+the+Human+NKG2D+Ligand+MICA%2A008+That+Is+Shed+by+Tumor+Cells+in+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Research%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cell Cytotoxicity Is Suppressed by Exposure to the Human NKG2D Ligand MICA*008 That Is Shed by Tumor Cells in Exosomes.</a> Cancer. Research. 70, 481-489 (2010).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Mammary+Carcinoma+Exosomes+Promote+Tumor+Growth+by+Suppression+of+NK+Cell+Function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Murine Mammary Carcinoma Exosomes Promote Tumor Growth by Suppression of NK Cell Function.</a> The Journal of Immunology. 176, 1375-1385 (2006).</li>
<li>Viaud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cell-Derived+Exosomes+Promote+Natural+Killer+Cell+Activation+and+Proliferation%3A+A+Role+for+NKG2D+Ligands+and+IL-15R%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cell-Derived Exosomes Promote Natural Killer Cell Activation and Proliferation: A Role for NKG2D Ligands and IL-15Rα.</a> PLoS ONE. 4, e4942-e4942 (2009).</li>
<li>Szajnik, M., Czystowska, M., Szczepanski, M. J., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Derived+Microvesicles+Induce%2C+Expand+and+Up-Regulate+Biological+Activities+of+Human+Regulatory+T+Cells+%28Treg%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tumor-Derived Microvesicles Induce, Expand and Up-Regulate Biological Activities of Human Regulatory T Cells (Treg).</a> PLoS ONE. 5, e11469-e11469 (2010).</li>
<li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> J. Exp. Med. 183, 1161-1172 (1996).</li>
<li>Abusamra, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+exosomes+expressing+Fas+ligand+mediate+CD8%2B+T-cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Molecules%2C+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Tumor exosomes expressing Fas ligand mediate CD8+ T-cell apoptosis.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 35, 169-173 (2005).</li>
<li>Valadi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li>
<li>Eldh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+communicate+protective+messages+during+oxidative+stress%3B+possible+role+of+exosomal+shuttle+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA.</a> PLoS One. 5, e15353-e15353 (2010).</li>
<li>Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva%2C+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA%3A+uptake+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> J. Transl. Med. 9, 9-9 (2011).</li>
</ol>

JL jest współwłaścicielem patentu dotyczącego wykorzystania egzosomów jako wektorów do transferu RNA do komórek.

Podczas badania zawartości molekularnej i/lub funkcji egzosomów kluczowe jest zastosowanie wysokiej jakości metody izolacji, która zapewni odpowiednią wydajność i możliwie najniższy stopień zanieczyszczeń. Metodologia opisana w niniejszej pracy stanowi uznane podejście do izolacji egzosomów oraz badania ich zawartości RNA i funkcji biologicznych. Ponadto podkreślono znaczenie charakterystyki wyizolowanych egzosomów za pomocą kombinacji różnych metod, w tym mikroskopii elektronowej, cytometrii przepływowej i analizy Western blot.
Podczas izolacji egzosomów pierwszy etap wirowania (300 x g) służy do osadzenia komórek, które mogą znajdować się w zawiesinie komórkowej lub badanym płynie biologicznym. Drugie wirowanie przy 16 500 x g musi być wystarczająco silne, aby osadzić martwe komórki, większe fragmenty debris, ciała apoptotyczne oraz inne organelle. Po tym wirowaniu niektóre protokoły obejmują etap nanofiltracji, jednak część badaczy pomija ten krok. Podkreślamy jednak znaczenie eliminacji fragmentów i pęcherzyków o rozmiarach większych niż 200 nm, dlatego zdecydowanie zalecamy zastosowanie etapu filtracji. Jeśli wymagana jest bardziej rygorystyczna izolacja, można użyć filtrów 100 nm, należy jednak pamiętać, że w przypadku stosowania płynów lepkich filtry te mogą zostać łatwo zablokowane, co prowadzi do utraty materiału egzosomalnego. Ponadto filtracja 100 nm może wpływać na morfologię egzosomów, a w przypadku egzosomów o większych rozmiarach mogą one zostać utracone. Zatem filtry 200 nm wydają się odpowiednie do izolacji egzosomów. Po filtracji stosuje się obowiązkową ultrawirowkę przy 120,000 x g w celu osadzenia egzosomów. Egzosomy można następnie przemyć PBS, związać z kuleczkami powleczonymi przeciwciałami i przemyć lub poddać gradientowi sacharozy w celu usunięcia zanieczyszczających białek. Może to być jednak proces bardzo zasobożerny, który naszym zdaniem nie jest konieczny, szczególnie gdy objętość próbki wyjściowej jest mała i/lub zawartość RNA w egzosomach jest niska, ponieważ dodatkowe etapy znacząco zmniejszą ilość materiału. Niemniej jednak, charakter wyizolowanych pęcherzyków powinien zostać potwierdzony poprzez obecność lub brak określonych białek.
Do tej pory nie zidentyfikowano absolutnie unikalnego markera białkowego dla egzosomów, który pozwalałby potwierdzić, że próbka zawiera wyłącznie egzosomy. W związku z tym do charakterystyki egzosomów wymagane jest zastosowanie kombinacji metod, w tym określenie ich wielkości i morfologii za pomocą mikroskopii elektronowej. Mikroskopia elektronowa pozwala również na ocenę czystości próbki, ponieważ metoda ta umożliwia uzyskanie ogólnego obrazu poziomu zanieczyszczeń, na przykład większymi pęcherzykami, takimi jak mikrocząstki, ciałka apoptotyczne czy szczątki komórkowe. Ponadto zawartość białek w egzosomach można określić za pomocą cytometrii przepływowej i Western blot, a połączenie tych dwóch metod pozwala na analizę zarówno białek związanych z błoną (np. CD63 i CD81), jak i białek wewnętrznych (np. Tsg101 i alix) egzosomów. Wykrycie białek wzbogaconych w egzosomach, takich jak CD63, Tsg101 i alix, przy jednoczesnym braku białek takich jak białko retikulum endoplazmatycznego kalneksyna, jest wskazaniem, że osad wzbogacony w egzosomy rzeczywiście składa się z egzosomów, a nie z zanieczyszczających pęcherzyków pochodzących z innych przedziałów komórki.
Profil RNA wykrywanego w egzosomach różni się zasadniczo od profilu RNA występującego w nienaruszonych komórkach. W związku z tym w analizie RNA egzosomalnego za pomocą Bioanalyzera lub metod opartych na żelach brakuje dwóch pików odpowiadających podjednostkom rRNA 18S i 28S, które są wyraźnie widoczne w analizie RNA komórkowego. Twierdzimy zatem, że wykrycie jakichkolwiek istotnych ilości rRNA w próbce wskazuje, że wyekstrahowane RNA całkowite nie pochodzi wyłącznie z egzosomów, a co za tym idzie, metoda izolacji wymaga udoskonalenia i zapewnienia kontroli jakości.

<table><tbody><tr><td>Ultrawirówka Optima L-90K</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>65670</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówek Quick-seal</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td>W zależności od użytego rotora wymagane są różne probówki. Ti70 (342414), Ti45 (345776)</td></tr><tr><td>Zestaw do zamykania probówek Quick-Seal Cordless Tube Topper</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>358312</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Filtropur, 0,20&amp;mu;m </td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1826.001</td><td>W przypadku cieczy lepkich i/lub dużych objętości można zamiast tego zastosować system filtracji próżniowej, 0,2 &amp;#x03BC;m, firmy VWR International (514-0600).</td></tr><tr><td>Siatki niklowe pokryte formwarem/węglem</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>1GN200</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie przeciwludzkie CD63</td><td>BD Biosciences</td><td>556019</td><td>Stężenie końcowe: 0,05&amp;#x03BC;g/&amp;#x03BC;l</td></tr><tr><td>Kontrola izotypowa; IgG1&amp;#954; (MOPC 21)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9269</td><td>Stężenie końcowe: 0,05&amp;#x03BC;g/&amp;#x03BC;l</td></tr><tr><td>Koniugat złota przeciw mysiej IgG, 10 nm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7777</td><td>Stężenie końcowe: 1%</td></tr><tr><td>Mikroskop elektronowy LEO 912AB Omega</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Lub urządzenie równoważne.</td></tr><tr><td>Lateksowe kuleczki aldehydowe/siarczanowe 4&amp;mu;m</td><td>Interfacial Dynamics</td><td>12-4000</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało do powlekania kuleczek lateksowych</td><td></td><td></td><td>Na przykład anti-CD63 z BD Bioscience (556019)</td></tr><tr><td>Mieszalnik Intelli-Mixer RM-2L</td><td>ELMI</td><td></td><td>Lub urządzenie równoważne.</td></tr><tr><td>IgG z surowicy ludzkiej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4506</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała do detekcji</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Na przykład: PE anti-CD63 (556020) PE anti-CD9 (555372) PE anti-CD81 (555676) kontrola izotypowa (555749)</td></tr><tr><td>BD FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa Transsonic T 490 DH</td><td>ELMA</td><td></td><td>Lub urządzenie równoważne.</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA miRCURY RNA Isolation Kit </td><td>Exiqon A/S</td><td>300110</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939A</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka egzosomów zawierających rna

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Dziedzina badań nad egzosomami gwałtownie się rozwija, co przejawia się w drastycznym wzroście liczby publikacji w ostatnich latach. Zaproponowano, że te małe pęcherzyki (30-100 nm) pochodzenia endocytycznego pełnią funkcję mechanizmu usuwania receptora transferyny przez retikulocyty podczas ich dojrzewania do erytrocytów1, a później nazwano je egzosomami. Egzosomy powstają w wyniku pączkowania do wnętrza późnych endosomów, co prowadzi do tworzenia ciał wielopęcherzykowych (MVBs), a następnie są uwalniane do środowiska poprzez fuzję MVBs z błoną plazmatyczną2. Od czasu pierwszego odkrycia egzosomów wykazano, że szeroki zakres komórek uwalnia te pęcherzyki. Egzosomy wykryto również w kilku płynach biologicznych, w tym w osoczu, płycie z płukania nosa, ślinie i mleku matki3-6. Ponadto wykazano, że zawartość i funkcja egzosomów zależą od komórki macierzystej oraz warunków, w których są one wytwarzane. Wykazano szereg funkcji egzosomów, takich jak indukcja tolerancji na alergen7,8, eliminacja utrwalonych guzów u myszy9, hamowanie i aktywacja komórek natural killer10-12, promowanie różnicowania w limfocyty T regulatorowe13, stymulacja proliferacji limfocytów T14 oraz indukcja apoptozy limfocytów T15. W 2007 roku wykazaliśmy, że egzosomy uwalniane z komórek tucznych zawierają matrycowy RNA (mRNA) oraz mikroRNA (miRNA), a RNA może być transportowany z jednej komórki do drugiej za pośrednictwem egzosomów. Wykazano, że w komórkach biorczych mRNA transportowany przez egzosomy jest translacyjny na białko, co sugeruje funkcję regulacyjną przeniesionego RNA16. Ponadto wykazaliśmy, że egzosomy pochodzące z komórek hodowanych w warunkach stresu oksydacyjnego mogą indukować tolerancję na dalszy stres w komórkach biorczych, co sugeruje biologiczną funkcję egzosomalnego transportu RNA17. Pożywki do hodowli komórkowych i płyny biologiczne zawierają mieszaninę pęcherzyków i odszczepionych fragmentów. Wysokiej jakości metoda izolacji egzosomów, a następnie ich charakterystyka i identyfikacja wraz z analizą ich zawartości, jest zatem kluczowa dla odróżnienia egzosomów od innych pęcherzyków i cząsteczek. Przedstawiamy tutaj metodę izolacji egzosomów zarówno z pożywki do hodowli komórkowych, jak i z płynów ustrojowych. Metoda izolacji ta opiera się na powtarzanych etapach wirowania i filtracji, a kończy się etapem ultrawirowania, podczas którego egzosomy są osadzane w postaci pelletu. Omówiono istotne metody identyfikacji egzosomów oraz charakterystyki ich morfologii i zawartości białkowej, w tym mikroskopię elektronową, cytometrię przepływową i Western blot. Oczyszczanie całkowitego RNA egzosomalnego opiera się na chromatografii kolumnowej z wirowaniem, a wydajność i rozkład wielkości RNA egzosomalnego są analizowane przy użyciu Bioanalyzera.

Niniejsza praca przedstawia metody izolacji, oczyszczania i detekcji egzosomów, a także techniki analizy ich zawartości molekularnej. Metody te można dostosować do izolacji egzosomów zarówno z pożywek hodowli komórkowych, jak i z płynów biologicznych; poza analizą zawartości molekularnej mogą one być również przydatne w badaniach funkcjonalnych.

Izolacja i charakterystyka egzosomów zawierających RNA

Dziedzina badań nad egzosomami rozwija się w szybkim tempie, co przejawia się gwałtownym wzrostem liczby publikacji w ostatnich latach. Te małe pęcherzyki (30–100 nm) o...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ustalenie, czy analizowane komórki i płyny biologiczne uwalniają lub zawierają egzosomy zawierające RNA. Pierwszym krokiem w izolacji egzosomów jest usunięcie komórek i debris komórkowych. Następnie supernatant jest filtrowany w celu usunięcia większych cząsteczek.W drugim kroku egzosomy są osadzane za pomocą ultrawirowania. Egzosomy są charakteryzowane za pomocą mikroskopii elektronowej, cytometrii przepływowej oraz analizy Western blot, aby wykazać, że wyizolowane pęcherzyki mają morfologię, rozmiar i skład białkowy typowy dla egzosomów. Następnie z oczyszczonych egzosomów izoluje się RNA.Aby określić, jakie RNA zawierają egzosomy, wyniki uzyskane za pomocą tych uznanych metod oczyszczania, detekcji i charakterystyki egzosomów mogą ułatwić dalsze badania nad egzosomami, takie jak analiza ich funkcji biologicznych. W związku z tym w niniejszej prezentacji zostanie pokazane, w jaki sposób można izolować egzosomy za pomocą różnych metod, a zaprezentują to moi dwaj studenci studiów doktoranckich, Maria, El i Cecelia. Powodzenia.Do demonstracji izolacji egzosomów wykorzystuje się ludzką linię komórek tucznych HC1, aby rozpocząć procedurę izolacji. Najpierw należy hodować komórki w pożywce z surowicą wolną od egzosomów. Następnie zawiesinę komórkową przenosi się do probówek stożkowych i wiruje przy 300 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.Aby odwirować komórki, przenieść nadsącz do probówek do ultrawirówki i wirować próbkę z prędkością 16 500 ×g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu dalszego usunięcia komórek i szczątków komórkowych. Następnie przefiltrować nadsącz przez filtr 0,2 µm, aby usunąć cząsteczki większe niż 200 nm. Na koniec probówki do ultrawirówki zawierające przefiltrowany nadsącz szczelnie zamknąć i wirować w ultrawirówce z prędkością 120 000 ×g przez 70 minut w temperaturze 4 °C, aby odwirować egzosomy.Egzosomy odzyskuje się poprzez rozcięcie probówki do ultrawirówki, usunięcie nadsączu i resuspensję pelletu wzbogaconego w egzosomy. Aby zmaksymalizować odzysk egzosomów, pellet wzbogacony w egzosomy należy wielokrotnie resuspender w małej objętości odpowiedniego buforu w probówce typu eppendorf.Przepłukać dwukrotnie dodatkowym buforem w tej samej objętości co poprzednio. Dobór buforu zależy od rodzaju eksperymentów przeprowadzanych po izolacji egzosomów. Do mikroskopii elektronowej należy użyć około 10 µg białka egzosomalnego z nienaruszonych egzosomów.Przeprowadzono resuspensję w PBS. Mikroskopię elektronową przy użyciu siatek niklowych powlekanych węglem można wykonać bez immunobarwienia, ponieważ egzosomy można zidentyfikować wyłącznie na podstawie ich wielkości i morfologii. Zaleca się jednak zastosowanie przeciwciała pierwszorzędowego, takiego jak anty-CD63 lub anty-MHC klasy II, a następnie przeciwciał wtórnych znakowanych 10 nanometrowym złotem.Ponieważ egzosomy są zbyt małe, aby można było je wykryć za pomocą obecnego sprzętu do cytometrii przepływowej, konieczne jest uprzednie związanie egzosomów z kuleczkami pokrytymi przeciwciałami. W zależności od komórkowego pochodzenia egzosomów, do kuleczek magnetycznych lub lateksowych sprzęga się różne przeciwciała. W niniejszej demonstracji dla każdej próbki zostaną użyte lateksowe kuleczki pokryte przeciwciałem anty-CD63.Należy użyć objętości odpowiadającej 30 do 40 µg białka egzosomalnego z nienaruszonych egzosomów. Egzosomy zawieszone w PBS należy inkubować z kuleczkami przez noc w temperaturze 4 °C przy łagodnym mieszaniu. Następnego dnia należy przeprowadzić blokowanie, dodając 300 µL 200 mM glicyny, i inkubować przez 30 minut.Przemyć kompleksy kulek z egzosomami dwukrotnie buforem do płukania, a następnie inkubować kompleksy kulek z egzosomami z 50 µL przeciwciała IgG w temperaturze 4 °C. Kompleksy kulek z egzosomami przemyć dwukrotnie, dodać 90 µL buforu do płukania oraz 10 µL wybranego przeciwciała do kompleksów kulek z egzosomami i inkubować przez 40 minut w ciemności. Przy delikatnym mieszaniu przemyć kompleksy kulek z egzosomami dwukrotnie, dodać 300 µL buforu do płukania, przenieść próbki do probówek do cytometrii przepływowej i zebrać dane za pomocą cytometrii przepływowej.Niniejsza demonstracja techniki western blot skupi się na znaczeniu odpowiedniej izolacji białek przed przeprowadzeniem analizy oraz na zastosowaniu różnych przeciwciał. Rozpuścić osad egzosomów w wybranym buforze do lizy białek, dokładnie pipetować, a następnie wymieszać w wirówce typu vortex w celu dalszej lizy egzosomów. Próbkę poddać sonikacji w kąpieli wodnej, odwirować z prędkością 13 000 ×g przez pięć minut i przenieść nadfiltr do nowej probówki typu Eppendorf. Oznaczyć całkowite stężenie białka wybraną metodą, a następnie nanieść białko na żel.Następnie należy rozdzielić i przenieść białka za pomocą elektroforezy żelowej oraz transferu elektroforetycznego (blottingu), a następnie zablokować i przemyć membranę przed przeprowadzeniem immunobarwienia przeciwko białkom wzbogaconym w egzosomach, ponieważ nie istnieją markery specyficzne wyłącznie dla egzosomów. Do detekcji egzosomów powszechnie wykorzystuje się białka, które są wzbogacone w egzosomach pochodzących z różnych komórek. Są to białka takie jak tetraspaniny, na przykład CD9, CD63 i CD81.Białka związane z cytoszkieletem, takie jak ezryna, oraz białka zaangażowane w biogenezę pęcherzyków wielopęcherzykowych, takie jak TSG 1 0 1 i LY, a jako kontrolę negatywną w celu wykrycia białek zanieczyszczających, powszechnie występujących w pęcherzykach z innych przedziałów komórkowych, keksyna i GRP 78 z retikulum endoplazmatycznego. W zależności od planowanych eksperymentów można stosować różne zestawy do izolacji RNA. W niniejszej demonstracji do izolacji RNA zostanie zastosowana metoda kolumnowa.Ważne jest stosowanie końcówek do pipet wolnych od kwasów nukleinowych i nukleaz oraz oczyszczenie blatu i sprzętu z zanieczyszczeń i RNA. Rozpuścić osad egzosomów w 350 µL roztworu lizującego i wymieszać próbkę za pomocą wortexa. Dodać 200 µL 95% etanolu i wymieszać przy użyciu wortexa.Umieść kolumnę w probówce do zbierania i przenieś lizowane egzosomy do kolumny, a następnie odwiruj. Przemyj trzykrotnie 400 µL roztworu do płukania, aby upewnić się, że kolumna jest sucha. Po ostatnim płukaniu wiruj przez dwie minuty przy 14 000 ×g, a następnie umieść suchą kolumnę w probówce wolnej od RNaz. Eluuj RNA w 50 µL buforu do elucji w celu wykrycia i analizy wyekstrahowanego całkowitego RNA egzosomalnego.Bioanalizator Agilent 2100 można wykorzystać z zestawem RNA 6, 000 nano lub RNA 6, 000 pico, ponieważ egzosomy są zbyt małe, aby można było je wykryć za pomocą dostępnych metod cytometrii przepływowej. Przed analizą są one przyłączane do kulek pokrytych przeciwciałami. Ponieważ kompleksy kulek z egzosomami mogą ulegać agregacji, wykres rozrzutu z cytometrii przepływowej może zawierać różne populacje pojedynczych, podwójnych i potrójnych kompleksów kulek z egzosomami.Jak pokazano tutaj, strzałka wskazuje populację pojedynczych kompleksów kuleczka-egzosom, która jest populacją poddaną dalszej analizie. Histogram z cytometrii przepływowej przedstawia populację pojedynczych kuleczek z egzosomami wykazującą dodatni wynik dla białka CD 63. Im bardziej otwarta krzywa jest przesunięta w prawo, tym bardziej próbka jest dodatnia pod kątem CD 63.Ze względu na niewielki rozmiar egzosomów, mogą być one wizualizowane wyłącznie za pomocą mikroskopii elektronowej. Typowe cechy morfologiczne egzosomów obejmują pęcherzyki o okrągłym kształcie i rozmiarze od 30 do 100 nanometrów. Immunobarwienie egzosomów z użyciem przeciwciała sprzężonego ze złotem przeciwko CD 63 zostało wskazane strzałką na obrazie Western blot.Wyniki wykazują brak białka retikulum endoplazmatycznego kalneksyny w próbce egzosomalnej, ale potwierdzają obecność tetraspaniny CD 81, która jest białkiem powszechnie wzbogaconym w egzosomach. RNA komórkowe zawiera głównie RNA rybosomalne, co w tej analizie bioanalizatorem jest widoczne jako dwa piki dla podjednostki RNA rybosomalnego 18 s po lewej stronie i podjednostki 28 s po prawej stronie. RNA egzosomalne różni się natomiast profilami, ponieważ zawiera mało lub wcale RNA rybosomalnego i jest wzbogacone w krótkie cząsteczki RNA, takie jak RNA posłańcowy i mikroRNA.Izolację można przeprowadzić w około trzy godziny, jeśli proces zostanie wykonany prawidłowo. Podczas stosowania tej metody ważne jest przeprowadzenie wszystkich etapów, w tym filtracji, aby uniknąć zanieczyszczenia większymi pęcherzykami. Po opracowaniu tej techniki charakterystyka egzosomów, zarówno biochemiczna, jak i biologiczna, stała się znacznie łatwiejsza.Ponadto dowiedzieliśmy się znacznie więcej o komunikacji międzykomórkowej zapośredniczonej przez egzosomy w różnych układach. Co więcej, technika ta umożliwiła opracowanie egzosomów jako biomarkerów różnych chorób. Bardzo dziękuję za uwagę.

isolation-and-characterization-of-rna-containing-exosomes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obecność stabilnych mikroRNA (miRNA) w egzosomach wzbudziła ogromne zainteresowanie jako nowy sposób komunikacji międzykomórkowej, ze względu na ich potencjalną użyteczność jako biomarkery i jako droga do interwencji terapeutycznej. Tutaj demonstrujemy oczyszczanie egzosomów z krwi i pożywek hodowlanych, a następnie ilościowy PCR w celu identyfikacji transportowanych miRNA.

Oczyszczanie i profilowanie mikroRNA egzosomów pochodzących z krwi i pożywek hodowlanych

Opisano techniki opisujące gradientową procedurę oddzielania egzosomów od cząsteczek ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). Procedura ta została wykorzystana do wyizolowania egzosomów z dala od cząstek HIV w ludzkim osoczu od osób zakażonych wirusem HIV. Wyizolowane egzosomy analizowano pod kątem zawartości cytokin/chemokin.

Izolacja egzosomów z osocza osób zakażonych wirusem HIV-1

Płyn żółciowy jest cennym źródłem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów, które zawierają potencjalnie ważne biomarkery. Protokół ten stanowi solidną metodę izolowania egzosomów z ludzkiej żółci w celu dalszych analiz, w tym profilowania miRNA.

Izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikroRNA z ludzkiej żółci

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Tutaj opisujemy dwa protokoły izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, wirowanie ultrafiltracji i ultrawirowanie z wirowaniem gradientu gęstości, aby wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z próbek płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego myszy. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z mysiego płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego za pomocą obu metod są określane ilościowo i charakteryzowane.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu płucnego z oskrzelowo-pęcherzykowego przy użyciu techniki wirowania ultrafiltracji

Ten protokół pokazuje, jak oczyszczać zewnątrzkomórkowe mikroRNA z pożywek do hodowli komórkowych w celu budowy małych bibliotek RNA i sekwencjonowania nowej generacji. Opisano różne punkty kontrolne kontroli jakości, aby umożliwić czytelnikom zrozumienie, czego można się spodziewać podczas pracy z próbkami o niskim poziomie wejściowym, takimi jak exRNA.

Izolowanie, sekwencjonowanie i analiza zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Egzosom to nowa generacja nośników leków. Opracowaliśmy protokół izolacji egzosomów o wysokiej wydajności i czystości dostarczania siRNA. Otorbiliśmy również znakowane fluorescencyjnie niespecyficzne siRNA do egzosomów i zbadaliśmy wychwyt komórkowy egzosomów obciążonych siRNA w komórkach nowotworowych.

Przygotowanie egzosomów do dostarczania siRNA do komórek nowotworowych

Ten protokół ilustruje 1) izolację i hodowlę pierwotnych fibroblastów z mięśnia brzuchatego łydki dorosłej myszy, a także 2) oczyszczanie i charakterystykę egzosomów za pomocą różnicowej metody ultrawirowania w połączeniu z gradientami gęstości sacharozy, a następnie analizami western blot.

Izolacja i charakterystyka egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych

Tutaj prezentujemy protokół izolowania egzosomów pochodzących z śledziony myszy za pomocą kombinacji trawienia z kolagenazą typu I i ultrawirowania.

Izolacja i charakterystyka egzosomów pochodzących z tkanek śledziony myszy

Niniejsza praca pokazuje, jak tworzyć hybrydy RNA/DNA na poziomie chromosomowym oraz wykazać transfer informacji genetycznej z RNA do genomowego DNA w komórkach drożdży.

Generowanie hybryd RNA/DNA w genomowym DNA poprzez transformację z wykorzystaniem oligonukleotydów zawierających RNA

Poznaj metody izolacji i charakteryzacji egzosomów zawierających RNA z mediów hodowlanych i płynów biologicznych. Techniki ultrawirówki, mikroskopii elektronowej i cytometrii przepływowej umożliwiają analizę morfologii i składu białkowego.

Izolacja i charakterystyka egzosomów zawierających RNA

Przeglądaj więcej filmów