Izolacja i charakterystyka egzosomów zawierających RNA

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ustalenie, czy komórki i płyn biologiczny będące przedmiotem zainteresowania uwalniają lub zawierają egzosomy zawierające RNA. Pierwszym krokiem do wyizolowania egzosomów jest usunięcie komórek i szczątków komórkowych. Następnie supernat jest filtrowany w celu usunięcia większych cząstek.

Egzosomy są następnie granulowane przez ultrawirowanie jako drugi etap. Egzosomy są scharakteryzowane za pomocą mikroskopii elektronowej, cytometrii przepływowej i zachodniej analizy krwi, aby pokazać, że izolowane pęcherzyki mają morfologię, rozmiar i skład białkowy egzosomów. Następnie RNA jest izolowane z oczyszczonych egzosomów.

Aby określić, które RNA, egzosomy zawierają wyniki, które są uzyskiwane za pomocą tych dobrze znanych metod oczyszczania, wykrywania i charakteryzowania egzosomów, które mogą ułatwić dalsze badania egzosomów, takie jak ich funkcje biologiczne. Ta prezentacja pokaże wam, jak egzosomy mogą być izolowane na różne sposoby, a dwie osoby, które będą prezentować, to moje dwie doktorantki, Maria, El i Cecelia. Eee.Powodzenia.

Linia komórkowa ludzkiej masy, HC one, jest używana do tej demonstracji izolacji egzosomów, aby rozpocząć procedurę izolacji egzosomów. Najpierw hoduj komórki w pożywce z surowicą wolną od egzosomów. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do stożkowych probówek i odwiruj w temperaturze 300 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Aby osadzać komórki, przenieś super nazwę do ultra probówek wirówkowych i odwiruj próbkę w temperaturze 16 500 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby dalej usunąć komórki i resztki komórek. Następnie przefiltruj SANE przez filtr 0,2 mikrona, aby dalej usunąć cząstki większe niż 200 nanometrów. Na koniec probówki ultrawirówki zawierające przefiltrowany san są zamykane w ultrawirówce pod ciśnieniem 120 000 razy G przez 70 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu osadzenia egzosomów.

Egzosomy są pobierane przez rozcięcie probówki ultrawirówki, odrzucenie snat i resus zawieszający osad wzbogacony w egzosom. Do maksymalnego odzyskiwania egzosomów. Resus zawiesić wielokrotnie wzbogacony w egzosom osad w małej objętości odpowiedniego buforu do probówki eend orph.

Przepłukać dwukrotnie dodatkowym buforem o tej samej objętości co poprzednio. Bufor zależy od rodzaju eksperymentów po egzosomie. Izolacja. Do mikroskopii elektronowej użyj około 10 mikrogramów białka egzosomalnego z nienaruszonych egzosomów.

Ponownie zawieszone w PBS wykonane. Nasza mikroskopia elektronowa z siatką niklową pokrytą węglem może być wykonywana bez barwienia immunologicznego, ponieważ egzosomy można zidentyfikować wyłącznie na podstawie morfologii wielkości. Zaleca się jednak stosowanie przeciwciała pierwszorzędowego, takiego jak anty CD 63 lub anty MHC klasy drugiej, a następnie przeciwciał drugorzędowych znakowanych złotem o wielkości 10 nanometrów.

Ponieważ egzosomy są zbyt małe, aby można je było wykryć za pomocą obecnego sprzętu do cytometrii przepływowej, konieczne jest najpierw związanie egzosomów z kulkami pokrytymi przeciwciałami. W zależności od egzosomalnego pochodzenia komórkowego różne przeciwciała są sprzężone z kulkami magnetycznymi lub lateksowymi. W tej demonstracji do każdej próbki zostaną użyte kulki lateksowe pokryte anty CD 63.

Użyj objętości równej 30 do 40 mikrogramów białka egzosomalnego nienaruszonego egzosomu. Zawieszone w PBS inkubują egzosomy w kulkach przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza pod delikatnym ruchem. Następnego dnia zablokowany przez dodanie 300 mikrolitrów 200-milimolowej glicyny i inkubować przez 30 minut.

Przemyj kompleks kulek egzosomów dwukrotnie i przepłucz bufor inkubacyjny kompleksy kulek egzosomów z przeciwciałem IgG o pojemności 50 mikrolitrów w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj dwukrotnie kompleksy kulek egzosomu, dodaj 90 mikrolitrów, przemyj bufor i 10 mikrolitrów wybranego przeciwciała do kompleksów kulek egzomu i inkubuj przez 40 minut w ciemności. Pod delikatnym ruchem dwukrotnie przemyj kompleksy kulek egzomu, dodaj 300 mikrolitrów buforu płuczącego i przenieś próbki do probówek cytometrii przepływowej i uzyskaj dane za pomocą cytometrii przepływowej.

Ta demonstracja Western blot skupi się na znaczeniu odpowiedniej izolacji białka przed Western blot i różnych stosowanych przeciwciałach. Rozpuść osad egzosomu w wybranym zaciągnięciu się białkiem i dokładnie odpipetuj pipetą, a następnie mieszaj wirowo, aby dalej usunąć egzosomy, sonikować próbkę w łaźni wodnej, odwirować próbkę 13 000 razy G przez pięć minut i przenieść SANE do nowej probówki einor. Zmierz całkowitą zawartość białka za pomocą wybranej metody i załaduj białko na żel.

Następnie oddziel i przenieś białka za pomocą elektroforezy żelowej i bloku elektroblottingu i umyj błonę przed wykonaniem barwienia immunologicznego na białkach wzbogaconych w egzosomy, ponieważ nie ma markerów specyficznych dla egzosomów. Białka, które są wzbogacone w egzosomy o różnym pochodzeniu komórkowym, są powszechnie używane do wykrywania egzosomów. Są to białka, takie jak tetraspaniny, na przykład CD 9, CD 63 i CD 81.

Białka związane z cytoszkieletem, takie jak ezryna i białka biorące udział w biogenezie wielopęcherzykowej, takie jak TSG, 1, 0, 1 i LY, jako kontrola ujemna pod kątem zanieczyszczających białek powszechnie występujących w pęcherzykach z innych przedziałów, takich jak keksyna i GRP 78 z retikulum endoplazmatycznego. W zależności od planowanych eksperymentów można stosować różne zestawy do izolacji RNA. W tej demonstracji podczas izolacji RNA zostanie użyta metoda oparta na kolumnach.

Ważne jest, aby używać końcówek pipet wolnych od kwasów nukleinowych i nukleaz oraz wycierać zarówno stół, jak i sprzęt z zanieczyszczeń i RNA. Rozpuść osad egzosomu w 350 mikrolitrach roztworu do lizy i zwiruj próbkę. Dodaj 200 mikrolitrów 95% etanolu i wymieszaj za pomocą wiru.

Umieść kolumnę w probówce zbiorczej i przenieś lizowane egzosomy do kolumny i odwiruj Umyj trzykrotnie w 400 mikrolitrach roztworu do mycia, aby upewnić się, że kolumna jest sucha. Wirować przez dwie minuty w temperaturze 14 000 G po ostatnim płukaniu i umieścić suchą kolumnę w wymywanej probówce bez RNA. RNA w buforze elucjańskim o pojemności 50 mikrolitrów do wykrywania i analizy wyekstrahowanego całkowitego egzosomalu, RNA.

Bioanalizator Agilent 2100 może być używany z zestawem RNA 6,000 nano lub RNA 6,000 pico, ponieważ egzosomy są zbyt małe, aby można je było wykryć dostępnymi metodami cytometrii przepływowej. Są one przyczepiane do kulek pokrytych przeciwciałami przed ich analizą. Ponieważ te kompleksy egzosomów mogą agregować cytometrię przepływową, wykres rozrzutu może zawierać różne populacje pojedynczych, podwójnych i potrójnych kompleksów egzosomów.

Jak pokazano tutaj, strzałka wskazuje populację pojedynczych kompleksów kulek egzosomowych, czyli populację, która jest dalej analizowana. Hitogram cytometrii przepływowej pokazuje populację pojedynczych kulek egzosomów dodatnich dla białka CD 63. Im dalej w prawo znajduje się krzywa otwarta, tym bardziej dodatnia jest próbka dla CD 63.

Ze względu na niewielkie rozmiary egzosomów można je uwidocznić tylko za pomocą mikroskopii elektronowej. Typowe cechy morfologiczne egzosomów obejmują okrągłe pęcherzyki o wielkości od 30 do 100 nanometrów. Egzosom immunologiczny z liberalnym przeciwciałem złotym dla CD 63 jest pokazany, na co wskazuje plama Arrow Western.

Wyniki wskazują na brak kalneksyny białka retikulum endoplazmatycznego w próbce egzoomalnej, ale wskazują na obecność tetraspanu w CD 81, który jest białkiem powszechnie wzbogacanym w egzosomach. Komórkowy RNA zawiera głównie rybosomalny RNA, widziany jako dwa piki dla podjednostki 18 s rybosomalnego RNA widocznej po lewej stronie i podjednostki 28 s widocznej po prawej stronie w tej analizie bioanalizatora. Egzosomalne RNA różnią się jednak profilami, ponieważ zawierają niewiele rybosomalnego RNA lub nie zawierają go wcale i są wzbogacone w krótkie RNA, takie jak przekaźnik, RNA i mikro RNA Po opanowaniu.

Izolację można wykonać w ciągu około trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas korzystania z tej metody ważne jest, aby wykonać wszystkie kroki, w tym nieskładanie, aby uniknąć zanieczyszczenia większych układów scalonych. Po opracowaniu tej techniki znacznie łatwiej jest scharakteryzować egzosomy, zarówno biochemicznie, jak i biologicznie.

Co więcej, dowiedzieliśmy się znacznie więcej o komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem egzosomów w różnych systemach. Technika ta umożliwiła również opracowanie egzosomów jako biomarkerów różnych chorób. Bardzo dziękuję państwu za uwagę.