Test aktywności enzymatycznej oparty na chromatografii cienkowarstwowej: technika określania aktywności pirofosfokinazy in vitro za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

Pirofosfokinaza katalizuje przenoszenie difosforanu lub pirofosforanu z prekursora nukleotydów, takiego jak trifosforan adenozyny, ATP, do substratu, takiego jak difosforan guanozyny, GDP. W ten sposób powstaje tetrafosforan guanozyny - ważna cząsteczka sygnałowa.

W celu określenia aktywności pirofosfokinazy należy przygotować mieszaninę reakcyjną składającą się z GDP i znakowanych radioizotopowo ATP w odpowiednim buforze uzupełnionym chlorkiem magnezu. Dodać żądaną ilość pirofosfokinazy do mieszaniny reakcyjnej i inkubować.

Z biegiem czasu, w obecności jonów magnezu, pirofosfokinaza zaczyna przenosić znakowaną radioaktywnie cząstkę pirofosforanową z ATP do GDP, wytwarzając radioaktywny tetrafosforan guanozyny.

Teraz weź chromatografię cienkowarstwową lub TLC, płytkę wstępnie pokrytą polietyleno-celulozą - kationową fazą stacjonarną na bazie polimeru. Umieść podwielokrotności analitów mieszaniny reakcyjnej w pobliżu podstawy płytki TLC w różnych punktach czasowych, aby zatrzymać reakcję i ocenić postęp.

Zanurzyć płytkę w szklanej komorze zawierającej jednozasadowy fosforan potasu - rozpuszczalnik w fazie ruchomej. Gdy front rozpuszczalnika przesuwa się w górę, ujemnie naładowane an