Test aktywności enzymatycznej oparty na chromatografii cienkowarstwowej: technika określania aktywności pirofosfokinazy in vitro za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

Pirofosfokinaza katalizuje przenoszenie difosforanu lub pirofosforanu z prekursora nukleotydów, takiego jak trifosforan adenozyny, ATP, do substratu, takiego jak difosforan guanozyny, GDP. W ten sposób powstaje tetrafosforan guanozyny - ważna cząsteczka sygnałowa.

W celu określenia aktywności pirofosfokinazy należy przygotować mieszaninę reakcyjną składającą się z GDP i znakowanych radioizotopowo ATP w odpowiednim buforze uzupełnionym chlorkiem magnezu. Dodać żądaną ilość pirofosfokinazy do mieszaniny reakcyjnej i inkubować.

Z biegiem czasu, w obecności jonów magnezu, pirofosfokinaza zaczyna przenosić znakowaną radioaktywnie cząstkę pirofosforanową z ATP do GDP, wytwarzając radioaktywny tetrafosforan guanozyny.

Teraz weź chromatografię cienkowarstwową lub TLC, płytkę wstępnie pokrytą polietyleno-celulozą - kationową fazą stacjonarną na bazie polimeru. Umieść podwielokrotności analitów mieszaniny reakcyjnej w pobliżu podstawy płytki TLC w różnych punktach czasowych, aby zatrzymać reakcję i ocenić postęp.

Zanurzyć płytkę w szklanej komorze zawierającej jednozasadowy fosforan potasu - rozpuszczalnik w fazie ruchomej. Gdy front rozpuszczalnika przesuwa się w górę, ujemnie naładowane anality zaczynają migrować w oparciu o ich powinowactwo do dodatnio naładowanej fazy stacjonarnej.

Różnice w ładunkach ujemnych i masie różnie fosforylowanych analitów determinują ich względną migrację na płytce TLC, umożliwiając im unieruchomienie jako odrębne pasma.

Gdy czoło rozpuszczalnika osiągnie żądaną odległość, wyjmij płytkę i wysusz na powietrzu. Zmierz intensywność sygnału radioaktywnego, odpowiadającą radioaktywnie znakowanemu zubożeniu ATP i akumulacji tetrafosforanu guanozyny, aby przeanalizować aktywność pirofosfokinazy.

Przed przeprowadzeniem reakcji należy przygotować płytki do chromatografii cienkowarstwowej PEI-celulozy, myjąc je w wodzie dejonizowanej. Umieść płytki w szklanej komorze z podwójnie destylowaną wodą, na głębokość około 0,5 centymetra. Po umożliwieniu wodzie migracji na wierzch talerza, wyjmij talerze ze szklanej komory i pozostaw na noc na stojaku do wyschnięcia.

Zaznacz suche płytki w odległości 2 centymetrów od jednej krawędzi miękkim ołówkiem, aby wskazać, gdzie próbki zostaną zastosowane do TLC. W przypadku próbek o objętości 2 mikrolitrów należy nakładać próbki w odległości nie mniejszej niż 1 centymetr od siebie. Planując eksperymenty, zawsze pozostawiaj jedno miejsce na każdej płytce niewykorzystane, aby służyło jako puste miejsce do oznaczania ilościowego próbki.

Aby wykonać test aktywności enzymatycznej, należy przygotować indywidualne reakcje przy użyciu ^γ-32P-ATP, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodać RSH po wymieszaniu pozostałych składników, ponieważ dodanie RSH do mieszaniny zawierającej nukleotydy inicjuje test aktywności enzymatycznej.

Aby kontrolować hydrolizę ATP spowodowaną zanieczyszczeniem aktywności nukleazy, zbierz 10-mikrolitrową reakcję niezawierającą białka i inkubuj ją równolegle. Umieścić 2 mikrolitry próbek przy t = 0 i na końcu eksperymentu, aby upewnić się, że ATP nie uległo hydrolizie pod nieobecność białka.

Natychmiast po dodaniu RSH usunąć 2 mikrolitry i umieścić je na oznakowanej płytce celulozowej PEI jako próbkę t = 0-minutową.

Inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza, usuwając 2 mikrolitry podwielokrotności w żądanych punktach czasowych. Po zebraniu wszystkich podwielokrotności należy przeprowadzić chromatografię cienkowarstwową, wypełniając komorę chromatograficzną 1,5 molowym monozasadowym fosforanem potasu na głębokość 0,5 centymetra. Zanurzyć dolną krawędź płytki w rozpuszczalniku i pozwolić rozpuszczalnikowi migrować do górnej części płytki przez około 90 minut.

Wyjmij płytkę ze zbiornika chromatograficznego i umieść ją na stojaku do suszenia na stole do wyschnięcia na powietrzu przez noc. Po wyschnięciu płytki owiń ją folią z tworzywa sztucznego, aby uniknąć przeniesienia materiału radioaktywnego do kasety obrazowej i przeanalizuj za pomocą autoradiografii.

Płytkę z celulozy PEI zawierającą oddzielone reakcje należy wystawić na działanie kasety z luminofilem przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Po naświetleniu zobrazuj kasetę na luminoobrazie.

Korzystając z oprogramowania do obrazowania z graficznym interfejsem użytkownika, narysuj obszary zainteresowania lub ROI, wybierając najpierw opcję "Rysuj prostokąt". Następnie użyj myszki, aby narysować prostokątne ROI wokół jednego całego pasa oraz miejsca ATP i tetrafosforanu guanozyny znajdujące się w tym pasie.

Użyj poleceń "Wybierz, Kopiuj i Wklej", aby narysować identyczne ROI na innych pasach, aby upewnić się, że ROI mierzą sygnały w identycznych obszarach na każdym pasie. Uwzględnij zwrot z inwestycji z nieużywanego pasa, który ma być używany jako puste miejsca.

Korzystanie z punktu menu "Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji | Dodaj" w oprogramowaniu do obrazowania, wybierz wszystkie ROI narysowane na płycie celulozowej PEI. Teraz użyj opcji "Analizuj | Ustawianie pomiarów | Zmierz ", aby określić ilościowo intensywność sygnału w ramach każdego ROI i wyeksportować pomiary jako arkusz kalkulacyjny. W arkuszu kalkulacyjnym odejmij puste wartości zwrotu z inwestycji od sygnałów eksperymentalnych.