Name: Struktura zespołów kapsydów HIV-1 za pomocą mikroskopii krioelektronowej i iteracyjnej spiralnej rekonstrukcji w przestrzeni rzeczywistej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Poznaj metodę krioelektronowej mikroskopii do rekonstrukcji trójwymiarowej struktury helikalnych zespołów kapsydów HIV-1. Protokół obejmuje przygotowanie próbek, indeksowanie helikalne i iteracyjną rekonstrukcję w przestrzeni rzeczywistej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr. Gongpu Zhao oraz Danxia Ke za wsparcie techniczne. Dziękujemy dr. Edwardowi Egelmanowi i dr. Niko Grigorieffowi za udostępnienie oprogramowania do przetwarzania obrazów. Wyrażamy również wdzięczność pracownikom wspierającym laboratorium krio-EM biologii strukturalnej oraz klaster i sieć Beowulf na School of Medicine Uniwersytetu w Pittsburghu. Praca ta była finansowana z grantów GM082251 oraz GM085043.

1. Przygotowanie mrożonych i nawodnionych próbek do EM
Ponieważ zgromadzenia białka kapsydu (CA) HIV-19 są stabilne jedynie w buforze o wysokim stężeniu soli (1M NaCl), co powoduje silny szum tła w obrazach cryo-EM, stosujemy metodę szybkiego rozcieńczania i osuszania od strony tylnej (back-side blotting), aby przejściowo obniżyć stężenie soli podczas przygotowywania mrożonej, uwodnionej siatki EM.
<ol>
<li>Poddać działaniu wyładowań żarowych stronę węglową miedzianych siatek Quantifoil R2/1 o oczku 200 mesh przy natężeniu 25mA przez 25 sekund.</li>
<li>Użyć nebulizatora, aby zwiększyć wilgotność w komorze środowiskowej (samodzielnie wykonanego ręcznego plungera grawitacyjnego) do 80%.</li>
<li>W naczyniu FEI Vitrobot Plunger schłodzić etan w stanie ciekłym za pomocą ciekłego azotu. Zamontować naczynie do mrożenia szokowego na ręcznym plungerze grawitacyjnym.</li>
<li>Nanieść 2,5 μl wcześniej przygotowanego roztworu CA na stronę węglową siatki zamocowanej w pincecie, a następnie umieścić pincetę w plungerze tak, aby strona węglowa siatki była skierowana od strony operatora.</li>
<li>Dodać 3 μl buforu rozcieńczającego o niskim zasoleniu (10 mM NaCl) na drugą stronę siatki i natychmiast osuszyć tę stronę za pomocą kawałka papieru filtracyjnego. Cała tylna powierzchnia siatki powinna pozostawać w bezpośrednim kontakcie z papierem filtracyjnym przez około 6 sekund przed jego usunięciem. Bezpośrednio po usunięciu papieru filtracyjnego zanurzyć siatkę w ciekłym etanie.</li>
<li>Wyjąć pincetę z plungera i szybko przenieść siatkę do pudełka do przechowywania siatek.</li>
</ol>
2.	Kriomikroskopia elektronowa struktur rurkowych CA
<ol>
<li>Umieść mrożoną siatkę w mikroskopie elektronowym FEI Polara G2 pracującym przy napięciu 20kv i wyposażonym w kamerę CCD Gatan 4Kx4K.</li>
<li>W trybie wyszukiwania przy niskiej dawce (low-dose-search mode), przy powiększeniu ~20x i dawce &lt;0,01e-/Å2, przeskanuj całą siatkę w poszukiwaniu obszarów z odpowiednią warstwą lodu i zapisz pozycje tych obszarów w pliku etapu (stage file).</li>
<li>Przywołaj zapisane pozycje i ponownie przeskanuj te obszary przy powiększeniu 390x w trybie wyszukiwania przy niskiej dawce. Do zbierania danych wybierz obszary z jednorodną, cienką warstwą lodu zawierającą dobrze odseparowane, długie tubule nad otworami. Zapisz lokalizacje tych obszarów w drugim pliku etapu.</li>
<li>Przełącz na tryb ekspozycji przy powiększeniu 59 0x, wstaw przysłonę obiektywu 10 μm i dostosuj stygmatyzm obiektywu oraz intensywność wiązki, aby uzyskać dawkę ˜15 e-/Å2 na ekspozycję.</li>
<li>Powróć do trybu wyszukiwania przy niskiej dawce, przejdź do zapisanej pozycji, a następnie zidentyfikuj i wycentruj odpowiednią tubulę za pomocą kamery CCD. Przełącz na tryb ustawiania ostrości, dostosuj ostrość i ustaw wartość defokusu, zazwyczaj od 0,5 do 2,5 μm. Przełącz na tryb ekspozycji, ustaw czas ekspozycji od 0,3 do 0,5 sekundy dla dawki 15 e-/Å2 i wykonaj zdjęcie. Obrazy są rejestrowane na kamerze płytkowej; przed wykonaniem ekspozycji należy odczekać 10 sekund, aby filmy się ustabilizowały.</li>
<li>Przejdź do następnej zapisanej pozycji i powtórz krok 5, aby zebrać więcej obrazów.</li>
<li>Filmy są wywoływane w pełnej mocy utrwalacza D19 przez 12 minut i digitalizowane za pomocą skanera Nikon super coolscan 90 ED przy rozmiarze piksela 6,35 μm. Format plików obrazów to TIFF.</li>
</ol>
3.	Indeksowanie helikalne
Obiekt helikalny można indeksować za pomocą dwóch parametrów: rzędu Bessela, n, oraz numeru linii warstwy, l. Każda linia warstwy w transformacie Fouriera, charakteryzowana przez (n, l), odpowiada zestawowi linii na sieci powierzchniowej obiektu helikalnego oznaczonemu indeksami (h, k), przy użyciu notacji sieci 2D. Dla dowolnego (h, k) linia warstwy (nhk, lhk) jest kombinacją liniową dwóch wektorów podstawowych (n10, l10) oraz (n01, l01), które stanowią wartości n i l dla dwóch głównych linii warstw (1, 0) i (0, 1). Wartość l można wyznaczyć z wysokości linii warstwy mierzonej wzdłuż osi Z w transformacie Fouriera. Wartość n można oszacować za pomocą następującego równania10
2πRr ≈ Jn ≈ 1.1|n|+0.9  .....................(1)
gdzie Jn jest funkcją Bessela, która określa natężenie nth linia warstwy, r to promień obiektu helikalnego, a R to promień maksymalnej amplitudy linii warstwy. Numer linii warstwy, l, jest powiązane z n zgodnie z regułą wyboru11
 l = tn + um   ....................(2)
gdzie t i u są stałymi helisy. Dla dowolnej danej helisy może istnieć dokładnie u jednostek w dokładnie (lub bardzo blisko) t pełnych obrotach.
<ol>
<li>Wyodrębnij fragment względnie prostej i długiej rurki o jednolitej średnicy, korzystając z programu helixboxer z pakietu EMAN12, a następnie zapisz obraz w formacie MRC.</li>
<li>Wyznacz odległość powtórzenia helisą, c, używając programu opartego na korelacji krzyżowej, takiego jak „imgccf” z pakietu MRC13.</li>
<li>Oblicz transformatę Fouriera z nową długością ramki, która stanowi wielokrotność całkowitą odległości powtórzenia c.</li>
<li>Wybierz dwie główne linie warstw definiujące dwa podstawowe wektory sieci powierzchniowej (1,0) i (0,1).</li>
<li>Zmierz promień rurki, r, oraz wysokość i promień dwóch głównych linii warstw w transformacie Fouriera, odpowiednio l10, R10, l01 oraz R01 (Rys. 1).</li>
<li>Oblicz n10 oraz n01 zgodnie z równaniem (1).</li>
<li>Ponieważ wartości n są jedynie szacunkami, w kolejnych krokach (patrz krok 4.2) testuje się kilka kombinacji n10 i n01, aby znaleźć poprawną symetrię helikalną przy użyciu pakietu programów IHRSR.</li>
<li>Oblicz symetrię śrubową opisaną dwiema liczbami rzeczywistymi: kątem obrotu między podjednostkami (Δφ) oraz wzrostem osiowym (Δz) helisy jednogwiazdkowej (n=1). Znając wartości l10, l01, n10 oraz n01, wartości u i t można uzyskać poprzez przetestowanie zakresu wartości m (na przykład -50&lt;m&lt;50) zgodnie z regułą wyboru. Na koniec oblicz Δφ i Δz, stosując wzory Δφ =360t/u oraz Δz =c/u.</li>
</ol>
4. Rekonstrukcja trójwymiarowa
<ol>
<li>Segmentacja cząsteczek<ol>
<li>Otwórz mikrografię zawierającą cząsteczki helikalne, korzystając z programu graficznego Boxer, który jest częścią pakietu EMAN. </li>
<li>Podziel cząsteczkę helikalną na nakładające się segmenty. W panelu sterowania programu Boxer wybierz tryb Helix i ustaw parametry ramkowania: rozmiar ramki powinien być większy niż średnica cząsteczki, a wartość „Olap” powinna wynosić ˜90% rozmiaru ramki.</li>
<li>Po kliknięciu lewym przyciskiem myszy na obu końcach cząsteczki helikalnej, program Boxer automatycznie wygeneruje serię ramek cząsteczek wzdłuż długości helisy.</li>
<li>Zapisz ramkowane segmenty oraz ich współrzędne.</li></ol></li>
<li>Wstępna rekonstrukcja 3D przy użyciu programów IHRSR<ol>
<li>Odwróć kontrast obrazów cryo-EM i zastosuj filtr dolnoprzepustowy14 (opcjonalnie) przed przetwarzaniem metodą iteracyjnej rekonstrukcji helikalnej w przestrzeni rzeczywistej (IHRSR). </li>
<li>Otwórz interfejs graficzny programu IHRSR, wpisując „Generator”. Wprowadź do interfejsu graficznego wszystkie informacje dotyczące stosu ramkowanych cząsteczek, w tym nazwę i ścieżkę stosu, liczbę obrazów w stosie, wartości parametrów symetrii itp. Kliknij przycisk „Finish”, aby utworzyć skrypt rekonstrukcji, b25.spi.</li>
<li>Użyj litego lub pustego cylindra jako referencji początkowej i pozwól procedurze cyklicznie pracować do momentu, aż nie będzie już zmian w zdefiniowanej symetrii śrubowej, co zazwyczaj następuje po kilku cyklach. Prawoskrętna symetria helikalna powinna zapewnić stabilnie zbieżną rekonstrukcję. Rekonstrukcja wygenerowana w ostatnim cyklu zostanie użyta jako referencja początkowa do dalszego doprecyzowania. IHRSR wykonuje rekonstrukcję 3D przy użyciu programów SPIDER.</li></ol></li>
<li>Rekonstrukcja z iteracyjnym doprecyzowaniem15
Rekonstrukcja 3D wygenerowana przez IHRSR jest teraz używana jako referencja początkowa do dodatkowego doprecyzowania. Podczas doprecyzowania symetria helikalna jest stała dla Δφ i Δz, które zostały określone w procedurze IHRSR.<ol>
<li>Określ defokus i astygmatyzm występujące w mikrografii za pomocą programów CTFFIND3 i CTFTILT16.</li>
<li>Pomnóż segmenty cząsteczek przez CTF przy użyciu programów SPIDER17. Operacja określana jako FT w pakiecie SPIDER służy do obliczenia transformaty Fouriera (FFT) obrazu 2D. Następnie FFT jest mnożone przez wartości CTF określone w poprzednich krokach, przy użyciu operacji MU w pakiecie SPIDER. Otrzymaną wartość poddaje się następnie odwrotnej transformacji, aby utworzyć nowy obraz (skorygowany o CTF) w przestrzeni rzeczywistej, ponownie używając operacji FT w programie SPIDER.</li>
<li>Wykonaj dopasowanie projekcji poprzez porównanie projekcji wolumenów referencyjnych z obrazami skorygowanymi o CTF, stosując wyrównanie wieloreferencyjne. Zmienność kąta nachylenia poza płaszczyzną jest ograniczona do +/-10° i próbkowana w krokach 1°. Wprowadź ograniczenia, takie jak wysokie współczynniki korelacji, kąty w płaszczyźnie bliskie 0° lub 180° oraz ograniczone przesunięcia w osi x, dla parametrów wyrównania każdego segmentu. Do rekonstrukcji włącz tylko te segmenty, które spełniają te ograniczenia.</li>
<li>Po każdym cyklu iteracyjnego doprecyzowania generowana jest rekonstrukcja 3D przy użyciu rzutowania wstecznego, a następnie dzielona przez sumę CTFˆ2. </li>
<li>Zastosuj symetrię helikalną w celu wygenerowania zsymetryzowanego wolumenu. Iteracyjne doprecyzowanie kończy się, gdy nie następuje już dalsza poprawa rozdzielczości nowej rekonstrukcji 3D.</li>
<li>Pakiet przetwarzania obrazów SPIDER jest używany w większości etapów doprecyzowania. Seria operacji jest sterowana przez skrypty SPIDER, które są tworzonymi przez użytkownika plikami sterującymi wsadowymi zawierającymi sekwencje operacji i wartości parametrów. Końcowa rekonstrukcja jest obliczana przy użyciu programów z pakietu SPIDER.</li></ol></li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Pojedyncza rurka HIV-1 CA A92E (Ryc. 1a) została wyodrębniona z tła, a następnie obliczono jej transformatę Fouriera (Ryc. 1b) w celu indeksowania helikalnego. Dla linii warstw (1, 0) i (0, 1) wartości wynosiły: l10=28, l01=37, R10=5, R01=4. Przy promieniu rurki wynoszącym 21.57Å, przyjęto przybliżone wartości n10=-12, n01=1 (tutaj chiralność została określona uprzednio). Przy dystansie powtórzenia wynoszącym 5195.48Å, symetrię śrubową rurki określono jako Δz=6.8093Å, Δφ=328.8°. Wartości Δz i Δφ doprecyzowano do 7.1321Å i 328.86° przy użyciu IHRSR (Ryc. 2a), a wstępna rekonstrukcja przedstawiona jest na Ryc. 2b. Ostateczna rekonstrukcja (Ryc. 3), po iteracyjnym doprecyzowaniu, znacząco poprawiła mapę gęstości w stosunku do modelu wstępnego obliczonego za pomocą IHRSR (Ryc. 2b).
<img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="Dyfraktogram rentgenowski, mikroskopia elektronowa; analiza strukturalna rozmieszczenia cząsteczek; schemat." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rycina 1. Indeksowanie helikalnej rurki CA HIV-1. (A) Obraz pojedynczej rurki CA HIV-1 A92E. Pasek skali, 30 nm. (B) Transformata Fouriera rurki pokazanej na (A). Indeksy helikalne (n10=-12, n01=1) są oznaczone. Grot strzałki wskazuje linię warstwową przy rozdzielczości 23Å.
<img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="Analiza krystalograficzna; wykres zmian kątów i odległości w funkcji cykli; obraz struktury atomowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Wstępna rekonstrukcja z wykorzystaniem IHRSR. (A) Wyznaczanie symetrii śrubowej dla każdego cyklu iteracyjnego. Δφ i Δz, zaczynając od wartości początkowych, zbiegają do wartości stabilnych po 10 cyklach iteracyjnego ulepszenia. (B) Wstępna trójwymiarowa mapa gęstości po 10 cyklach iteracyjnych.
<img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="Obraz z kriomikroskopii elektronowej przedstawiający strukturę filamentów białkowych oraz analizę ich ułożenia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3Trójwymiarowa mapa gęstości po iteracyjnym udoskonaleniu. (A-C) Mapa gęstości rurek CA została przedstawiona w trzech przekrojach ortogonalnych: równoległym do osi rurki i blisko jej powierzchni (A), prostopadłym do osi rurki (B) oraz równoległym do osi rurki i przechodzącym przez nią (C). Paski skali, 10 nm. (D) Renderowanie powierzchni trójwymiarowej mapy gęstości z konturowaniem na poziomie 1,8$\sigma$ obejmujące 10% objętości.

<ol><li>Frank, J., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+negatively+stained+or+in+vitreous+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice.</a> Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).</li>
<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Purple+Membrane+from+Halobacterium-Halobium+-+Analysis+of+X-Ray-Diffraction+Pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern.</a> J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).</li>
<li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iterative+helical+real+space+reconstruction+method%3A+surmounting+the+problems+posed+by+real+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers.</a> J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).</li>
<li>Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-Actin+Is+a+Helix+with+a+Random+Variable+Twist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist.</a> Nature. 298, 131-135 (1982).</li>
<li>Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+model+of+the+microtubule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution model of the microtubule.</a> Cell. 96, 79-88 (1999).</li>
<li>Jimenez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+structure+of+an+SH3+amyloid+fibril+and+model+of+the+molecular+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing.</a> Embo J. 18, 815-821 (1999).</li>
<li>Butler, P. J., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+particle+of+tobacco+mosaic+virus+from+RNA+and+disks+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+New+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein.</a> Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).</li>
<li>Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+core+and+central+channel+of+bacterial+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the core and central channel of bacterial flagella.</a> Nature. 342, 648-654 (1989).</li>
<li>Byeon, I. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Convergence+between+Cryo-EM+and+NMR+Reveals+Intersubunit+Interactions+Critical+for+HIV-1+Capsid+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function.</a> Cell. 139, 780-790 (2009).</li>
<li>Toyoshima, C., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+the+acetylcholine+receptor+by+cryoelectron+microscopy+and+helical+image+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction.</a> J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).</li>
<li>Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+I.+Indexing+of+diffraction+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns.</a> Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).</li>
<li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN%3A+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li>
<li>Yonekura, K., Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+IV.+Distortion+correction+and+its+combined+application+with+real-space+averaging+and+solvent+flattening%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening.</a> Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).</li>
<li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+electron+cryo-microscopy%3A+towards+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution.</a> Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).</li>
<li>Sachse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+electron+microscopy+of+helical+specimens%3A+A+fresh+look+at+Tobacco+Mosaic+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus.</a> J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).</li>
<li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+Processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+dynamin+in+the+constricted+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state.</a> Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiamy zestaw protokołów zapewniających prosty sposób uzyskiwania struktur 3D obiektów helikalnych. Stosując opisane procedury, otrzymaliśmy strukturę 3D kompleksu kapsydu HIV-1 z obrazu pojedynczej probówki (176 segmentów). Wyższą rozdzielczość struktur można osiągnąć, dołączając większą ilość danych obrazowych.
Istnieje kilka krytycznych punktów dla optymalnego gromadzenia i analizy danych: po pierwsze, podczas przygotowywania preparatu do krio-EM, należy odsączyć roztwór próbki, pozostawiając jednorodną, cienką warstwę roztworu, która jest nieco grubsza niż rozmiar próbki. Istnieje kilka różnych sposobów odsączania próbki. W przypadku komórek bakteryjnych i preparatów rurkowatych, takich jak montaż CA HIV-1, najbardziej odpowiednie jest odsączanie jednostronne, w szczególności od strony tylnej.
Po drugie, należy określić kierunkowość skrętu helisy, ponieważ nie można tego zrobić za pomocą indeksowania helikalnego ani rekonstrukcji. Powszechną praktyką jest stosowanie trawienia mrozowego, a następnie cieniowania obrotowego18 w celu ustalenia kierunkowości. Kierunkowość można również określić po rekonstrukcji, gdy rozdzielczość mapy gęstości jest wystarczająco wysoka; trójwymiarowe modele atomowe poszczególnych komponentów powinny dobrze pasować do mapy gęstości przy założeniu prawidłowej kierunkowości. W przeciwnym razie należy przyjąć kierunkowość przeciwną.
Po trzecie, podczas przetwarzania obrazów należy zastosować filtr Wienera do korekcji zarówno fazy, jak i amplitudy, aby zredukować wzmocnienie szumów. Ponieważ funkcja przenoszenia kontrastu (CTF) dla pojedynczego obrazu zawsze posiada punkty zerowe, część informacji w przestrzeni odwrotnej zostaje utracona. W związku z tym do rekonstrukcji 3D niezbędne jest uwzględnienie wielu zestawów danych projekcyjnych, z których każdy został obrazowany przy innych wartościach defokusu.

<table><tbody><tr><td>Urządzenie do wyładowań żarowych 100X</td><td>Urządzenie do wyładowań żarowych 100X</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Tecnai Polara F30 z emiterem polowym (Field Emission Gun)</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD Gatan 4K x 4K</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do witryfikacji (plunge-freezing)</td><td></td><td></td><td>Własnoręcznie wykonany grawitacyjny plungier manualny</td></tr><tr><td>Miedziane siatki z dziurkowanym węglem Quantifoil R2/1 200 mesh</td><td>Quantifoil Micro Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie EM EMAN</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie EM IHRSR</td><td></td><td></td><td>Programy dostępne od Edwarda H. Egelmana&lt;a href=&quot;http://people.virginia.edu/%7Eehe2n/">http://people.virginia.edu/~ehe2n/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie EM Spider</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania helikalnego oparte na MRC</td><td></td><td></td><td>Programy dostępne od Kojiego Yonekury&lt;a href=&quot;http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie CTFFIND3/CTFTILT oraz oprogramowanie do rafinacji helikalnej w przestrzeni rzeczywistej</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

struktura zgromadzeń kapsydu hiv-1 określona za pomocą kriomikroskopii elektronowej i iteracyjnej helikalnej rekonstrukcji w przestrzeni rzeczywistej

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Kriomikroskopia elektronowa (cryo-EM) w połączeniu z przetwarzaniem obrazów staje się coraz potężniejszym narzędziem do wyznaczania struktury makromolekularnych kompleksów i zgrupowań białkowych. W rzeczywistości mikroskopia elektronowa pojedynczych cząsteczek1 oraz dwuwymiarowa (2D) krystalografia elektronowa2 stały się stosunkowo rutynowymi metodologiami, a za ich pomocą rozwiązano już dużą liczbę struktur. Jednocześnie gwałtownie rozwinęło się przetwarzanie obrazów i trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja obiektów helikalnych, w szczególności metoda iteracyjnej rekonstrukcji helikalnej w przestrzeni rzeczywistej (IHRSR)3, która wykorzystuje narzędzia analizy pojedynczych cząsteczek w połączeniu z symetrią helikalną. Wiele bytów biologicznych funkcjonuje w formach włóknistych lub helikalnych, w tym filamenty aktynowe4, mikrotubule5, włókna amyloidowe6, wirusy mozaiki tytoniowej7 oraz wici bakteryjne8. Ponieważ dzięki metodzie IHRSR trójwymiarową mapę gęstości obiektu helikalnego można uzyskać z pojedynczego obrazu projekcyjnego, w przeciwieństwie do wielu obrazów wymaganych do rekonstrukcji 3D obiektu niehelikalnego, analiza strukturalna tak elastycznych i nieuporządkowanych zgrupowań helikalnych jest obecnie możliwa do zrealizowania.
W niniejszym artykule wideo przedstawiamy szczegółowe protokoły uzyskiwania trójwymiarowej (3D) mapy gęstości helikalnego kompleksu białkowego (naszym przykładem jest kapsyd HIV-19), obejmujące protokoły przygotowania próbek do krio-EM, zbierania danych przy niskiej dawce promieniowania w krio-EM, indeksowania helikalnych wzorów dyfrakcyjnych oraz przetwarzania obrazów i rekonstrukcji 3D z wykorzystaniem metody IHRSR. W porównaniu z innymi technikami, krio-EM zapewnia optymalne zachowanie próbek w warunkach zbliżonych do naturalnych. Próbki są zatapiane w cienkiej warstwie lodu witryfikowanego poprzez szybkie mrożenie, a następnie obrazowane w mikroskopach elektronowych w temperaturze ciekłego azotu, przy zastosowaniu niskiej dawki promieniowania w celu zminimalizowania uszkodzeń radiacyjnych. Obrazy próbek są uzyskiwane w warunkach bliskich natywnym, co wiąże się z niskim sygnałem i niskim kontrastem zarejestrowanych mikrografii. Na szczęście proces rekonstrukcji helikalnej został w znacznym stopniu zautomatyzowany, z wyjątkiem indeksowania helikalnego wzoru dyfrakcyjnego. Opisujemy tutaj podejście do indeksowania struktury helikalnej i wyznaczania symetrii helikalnych (parametrów helikalnych) z cyfrowych mikrografii, co jest kluczowym etapem trójwymiarowej rekonstrukcji helikalnej. W skrócie, uzyskujemy wstępną mapę gęstości 3D, stosując metodę IHRSR. Następnie mapa ta jest iteracyjnie dopracowywana poprzez wprowadzenie ograniczeń dla parametrów dopasowania każdego segmentu, co pozwala kontrolować ich stopnie swobody. Dalszą poprawę uzyskuje się poprzez korektę funkcji przenoszenia kontrastu (CTF) mikroskopu elektronowego (korekta amplitudy i fazy) oraz optymalizację symetrii helikalnej kompleksu.

Niniejszy artykuł opisuje metodę uzyskiwania trójwymiarowej (3D) struktury cząsteczek zmontowanych helikalnie przy użyciu krio-mikroskopii elektronowej. W niniejszym protokole wykorzystujemy zgromadzenia kapsydów HIV-1, aby zilustrować szczegółową procedurę rekonstrukcji 3D w celu uzyskania mapy gęstości za pomocą iteracyjnej metody rekonstrukcji helikalnej w przestrzeni rzeczywistej.

Struktura zgromadzeń kapsydu HIV-1 określona za pomocą kriomikroskopii elektronowej i iteracyjnej helikalnej rekonstrukcji w przestrzeni rzeczywistej

Kriomikroskopia elektronowa (cryo-EM) w połączeniu z przetwarzaniem obrazów jest coraz potężniejszym narzędziem do wyznaczania struktury makromolekularnych białek...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie metody uzyskiwania trójwymiarowej struktury cząsteczek zmontowanych w helisę przy użyciu kriomikroskopii elektronowej. Protokół rozpoczyna się od przygotowania preparatu do kriomikroskopii elektronowej (cryo EM) z zastosowaniem metody szybkiego rozcieńczania i blottingu od strony tylnej w celu przejściowego obniżenia stężenia soli podczas przygotowywania mrożonej, uwodnionej siatki EM. Proces ten zapewnia stabilność białka, jednocześnie redukując szum tła i poprawiając stosunek sygnału do szumu podczas następującego po tym etapie zbierania danych w trybie niskiej dawki w kriomikroskopii elektronowej.Indeksowanie helikalne obrazów dyfrakcyjnych zostało zakończone. Następnie przeprowadzono przetwarzanie obrazów, a po nim trójwymiarową rekonstrukcję w przestrzeni rzeczywistej, co pozwoliło uzyskać końcową mapę gęstości kapsydu HIV-1 lub rurki ca. Zazwyczaj osoby po raz pierwszy korzystające z tej metody mogą napotkać trudności, ponieważ istnieje kilka krytycznych punktów dla optymalnego gromadzenia i analizy danych.Na przykład w przypadku HIV jedne z kapsydowych struktur rurkowych tworzą się wyłącznie w jednym roztworze źródłowym przy szybkim obniżaniu stężenia soli, co nie wpływa na ich strukturę. Kluczowe jest uzyskanie wysokiej jakości obrazów cryo-EM. Mając obraz rurki, bardzo trudno jest ustalić, jakie działania podjąć w celu indeksowania krytycznej rurki oraz jakie oprogramowanie można zastosować do rekonstrukcji 3D.Niniejszy film prezentuje szczegółowe i przystępne podejście do uzyskiwania rekonstrukcji 3D obiektów fizycznych i może służyć jako punkt odniesienia dla Państwa eksperymentu. Procedurę zaprezentuję wraz z dr Pują. Oboje jesteśmy pracownikami podoktorskimi w laboratorium dr. Aby przygotować kompleksy białka kapsydu HIV-1 do cryo-EM, należy rozpocząć od naładowania powierzchniowego (glow discharge) strony węglowej miedzianych siatek o gęstości 200 mesh przy natężeniu 25 mA przez 25 s.Użyj nebulizatora, aby doprowadzić wilgotność w komorze środowiskowej, która stanowi domowej roboty ręczny tłok grawitacyjny, do poziomu 80%. W międzyczasie schłodź ciekły etan w dozowniku typu vitro bott za pomocą ciekłego azotu, a następnie zamocuj dozownik do zamrażania szokowego do ręcznego tłoka grawitacyjnego. Następnie za pomocą pęsety zaciśnij szczypce na krawędzi siatki.Nanieś 2,5 µL wcześniej przygotowanego roztworu białka na stronę węglową siatki. Następnie umieść pęsetę w tłoku tak, aby strona węglowa siatki była skierowana na zewnątrz. Dodaj 3 µL buforu rozcieńczającego o niskim zasoleniu na tylną stronę siatki.Natychmiast osusz siatkę kawałkiem papieru filtracyjnego z tej samej strony. Utrzymuj całą tylną powierzchnię siatki w bliskim kontakcie z papierem filtracyjnym przez około sześć sekund. Po usunięciu papieru filtracyjnego natychmiast zanurz siatkę w ciekłym etanie.Na koniec wyjmij pęsetę z tłoka i szybko przenieś siatkę do pudełka do przechowywania siatek. Rozpocznij kriomikroskopię elektronową, ładując zamrożoną uwodnioną siatkę do mikroskopu elektronowego FEI polar G two, pracującego przy napięciu 200 kilowoltów i wyposażonego w kamerę CCD Gatan 4K by 4K.W trybie wyszukiwania przy niskiej dawce ustaw powiększenie około 200 x. Przeskanuj całą siatkę w celu znalezienia obszarów z odpowiednią warstwą lodu. Zapisz pozycje tych obszarów w pliku stołu.Przywołaj zapisane pozycje i przeprowadź dalsze przesiewowe badanie tych obszarów. Zastosuj powiększenie 3 900 x w trybie poszukiwania z niską dawką. Do zbierania danych wybierz obszary z jednorodną cienką warstwą lodu, które charakteryzują się obecnością długich rurek zawieszonych nad otworem.Zapisz wszystkie obszary w pliku drugiego etapu. Przełącz urządzenie w tryb ekspozycji. Ustaw powiększenie 59 000 x i wprowadź aperturę obiektywu 100 µm.Następnie należy skorygować stygmatyzm obiektywu oraz natężenie wiązki tak, aby dawka wynosiła około 15 elektronów na angstrom kwadrat na ekspozycję. Powróć do trybu wyszukiwania z niską dawką i przemieść się do zapisanej pozycji. Zidentyfikuj i wycentruj odpowiednią próbkę.Używając kamery CCD, przełącz do trybu ustawiania ostrości, dostrój ostrość i ustaw wartość rozmycia (defocus) zazwyczaj między 0,5 a 2,5 micrometers. Następnie przełącz do trybu ekspozycji i ustaw czas naświetlania od 0,3 do 0,5 seconds dla dawki 15 electrons per angstrom squared. Zbierz obrazy na kamerze płytkowej, pozwalając filmom na stabilizację przez 10 seconds przed wykonaniem ekspozycji.Po zebraniu obrazów przejdź do kolejnej zapisanej pozycji i powtórz ten proces, aby zebrać więcej obrazów. Wywołaj filmy w pełnej mocy odczynnika D 19 przez 12 minut. Następnie zdigitalizuj obrazy za pomocą skanera Nikon Super cool scan 9, 000 ED przy rozmiarze piksela 6.35 micrometers.Obiekt helikalny może być indeksowany za pomocą dwóch parametrów: rzędu funkcji Bessela N oraz numeru linii warstwowej L w transformacie Fouriera sieci powierzchniowej obiektu helikalnego. Każda linia warstwowa jest charakteryzowana przez N i L i odpowiada zestawowi linii na sieci powierzchniowej, oznaczonych indeksami H i K.Aby rozpocząć indeksowanie helikalne, należy użyć programu Boxer z pakietu Iman do wycięcia stosunkowo długiego i prostego fragmentu rurki o jednorodnej średnicy, a następnie zapisać obraz w formacie MRC. Następnie należy zmierzyć promień rurki za pomocą programu Boxer z pakietu Iman. Odległość powtórzenia HEL należy wyznaczyć przy użyciu programu opartego na korelacji wzajemnej, takiego jak I-M-G-C-C-F z pakietu MRC.Następnie oblicz foyer. Przekształć go, stosując nową długość pudełka, która stanowi wielokrotność odległości powtórzenia. Następnie wybierz dwie główne linie warstwowe, które definiują dwa podstawowe wektory sieci powierzchniowej: [1 0] oraz [0 1] w jednostkach pikseli FFT.Wyznacz numery linii warstwowych oraz promienie maksymalnej amplitudy dla dwóch głównych linii warstwowych w transformacie Fouriera. Znając numery linii warstwowych i wartości rzędów funkcji Bessela dla dwóch głównych linii warstwowych, można wyznaczyć kąt obrotu między podjednostkami oraz wzrost osiowy jednej helisy gwiazdowej, korzystając z reguły wyboru opisanej w procedurze pisemnej. Te dwie liczby rzeczywiste opisują symetrię śrubową rurki.Rekonstrukcja 3D rozpoczyna się od segmentacji cząsteczek przy użyciu programu Iman.Boxer. Po otwarciu mikrografii zawierającej cząsteczki helikalne, należy podzielić cząsteczkę na nakładające się segmenty w panelu sterowania programu Boxer. Wybierz tryb helix i ustaw parametry obramowywania.Rozmiar ramki powinien być większy niż średnica cząsteczki, a wartość OLA powinna wynosić około 90% rozmiaru ramki. Po kliknięciu w dowolny koniec ramki cząsteczki, zostanie automatycznie wygenerowana seria ramek wzdłuż długości helisy, a podzielone segmenty wraz z ich współrzędnymi zostaną zapisane. Kolejnym krokiem jest przeprowadzenie wstępnej rekonstrukcji 3D przy użyciu iteracyjnej metody rekonstrukcji w przestrzeni rzeczywistej dla helis (I-H-R-S-R) przed właściwym przetwarzaniem metodą I-H-R-S-R.Odwróć kontrast obrazów cryo-EM i zastosuj filtrowanie dolnoprzepustowe (LOWPASS). Następnie otwórz interfejs graficzny programu I-H-R-S-R, wpisując polecenie generator. Wprowadź do interfejsu graficznego wszystkie informacje dotyczące stosu obramowanych cząstek, w tym nazwę i ścieżkę dostępu do stosu, liczbę obrazów w stosie oraz wartości parametrów symetrii.Kliknij przycisk finish, aby utworzyć skrypt rekonstrukcji. B 25 SP.I użyj pełnego lub pustego cylindra jako początkowego punktu odniesienia i pozwól procedurze cyklicznie działać do momentu, aż nie wystąpią już żadne zmiany w zdefiniowanej symetrii śruby, co zazwyczaj dzieje się po kilku cyklach. Prawoskrętna symetria helikalna powinna zapewnić stabilnie zbieżną rekonstrukcję.Rekonstrukcja wygenerowana w ostatnim cyklu zostanie wykorzystana jako referencja początkowa do dalszego udoskonalenia. Na koniec należy przeprowadzić rekonstrukcję 3D z iteracyjnym udoskonaleniem, wykorzystując mapę gęstości 3D wygenerowaną przez I-H-R-S-R jako referencję początkową do dodatkowego udoskonalenia w trakcie procesu optymalizacji. Symetria helikalna jest ustalona na podstawie rotacji między podjednostkami oraz wzrostu osiowego, które zostały określone w procedurze I-H-R-S-R.Następnie, za pomocą programów CTF find oraz CTF tilt z pakietu Spider, określ wartość defocusu i astygmatyzmu obecnych na mikrografii, wykorzystując funkcje FT oraz mu; pomnóż segmenty cząsteczek przez funkcję przenoszenia kontrastu (CTF). Przeprowadź dopasowanie projekcji (projection matching), porównując projekcje wolumenów referencyjnych z obrazami skorygowanymi pod kątem CTF, stosując wyrównanie wieloreferencyjne (multi reference alignment). Zmienność kąta nachylenia poza płaszczyzną ograniczono do zakresu plus lub minus 10 stopni z próbkowaniem w krokach jednostopniowych; wprowadź ograniczenia, takie jak wysokie współczynniki korelacji dla kątów w płaszczyźnie bliskich 0 stopni lub 180 stopni oraz ograniczone przesunięcia w osi X.W przypadku parametrów dopasowania każdego segmentu, w rekonstrukcji uwzględnia się tylko te segmenty, które spełniają określone ograniczenia. Po każdym cyklu iteracyjnej rafinacji generowana jest rekonstrukcja 3D za pomocą wstecznej projekcji i dzielona przez kwadrat CTF, a następnie nakładana jest symetria helikalna w celu wygenerowania objętości symetrycznej. Rafinacja iteracyjna zostaje zakończona, gdy nie następuje już dalsza poprawa rozdzielczości nowej rekonstrukcji 3D.Pojedynczy montaż kapsydu HIV-1, rurka o promieniu 92 Å, został wyodrębniony, a następnie obliczono jego transformatę Fouriera w celu indeksowania helikalnego dwóch promieni; wyznaczono numery linii warstw oraz promienie maksymalnej amplitudy dla linii warstw 10 i 01. Następnie obliczono wartości końcowe wynoszące odpowiednio -12 i 11 dla linii 10 i 01, przy odległości powtórzenia wynoszącej 5195,48 angstromów. Symetrię śrubową rurki określono jako delta Z równe 6,81 angstromów oraz delta pięć równe 328,88 stopnia; wartości delta Z i delta pięć zostały doprecyzowane do 7,13 angstromów i 328,86 stopnia przy użyciu I-H-R-S-R, a po 10 cyklach iteracyjnych wygenerowano wstępną rekonstrukcję.Końcowa rekonstrukcja po iteracyjnym doprecyzowaniu znacznie poprawiła mapę gęstości w porównaniu z modelem początkowym obliczonym za pomocą I-H-R-S-R. Mapa gęstości rurek złożonych z kapsydów jest przedstawiona jako trzy orthogonalne przekroje: równoległe do osi rurki i blisko jej powierzchni, prostopadłe do osi rurki oraz równoległe i przechodzące przez oś rurki. Przedstawiona struktura jest wynikiem renderowania powierzchni trójwymiarowej mapy gęstości z konturowaniem przy poziomie 1,8 Sigma, obejmującym 100% objętości.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać bardzo dobrą wiedzę na temat tego, jak uzyskać strukturę 3D cząsteczki złożonej z ally za pomocą krio-mikroskopii elektronowej.

structure-hiv-1-capsid-assemblies-cryo-electron-microscopy-iterative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Struktura zespołów kapsydu HIV-1 poprzez krio-mikroskopię elektronową i iteracyjną rekonstrukcję przestrzeni rzeczywistej helisami

Region korony różnych sekwencji pętli V3 powierzchniowego glikoproteiny otoczki (gp120) HIV-1 może w wielu przypadkach zostać scharakteryzowany strukturalnie poprzez zwijanie in silico pozycji od 10 do 22 pętli przy użyciu nowoczesnego algorytmu zwijania ab initio. W niniejszej pracy prezentujemy zwijanie i ocenę tego regionu pętli V3 szczepu R2 HIV-1, który jest wyjątkowo wrażliwym na neutralizację szczepem o zagadkowych właściwościach funkcjonalnych.

Ocena immunologicznie istotnych dynamicznych cech struktury trzeciorzędowej sekwencji R2 korony pętli V3 HIV-1 za pomocą zwijania ab initio

Protokół opisuje wysokoprzepustowe podejście do wyznaczania struktur białek błonowych z wykorzystaniem krio-tomografii elektronowej oraz trójwymiarowego przetwarzania obrazów. Obejmuje on szczegóły przygotowania preparatów, gromadzenia danych, ich przetwarzania i interpretacji, a kończy się opracowaniem reprezentatywnego celu dla tej metody, jakim jest glikoproteina otoczki HIV-1. Procedury obliczeniowe zostały zaprojektowane w sposób umożliwiający badaczom i studentom pracę zdalną oraz wkład w...

Wyznaczanie struktur molekularnych glikoprotein otoczki HIV z wykorzystaniem krioelektronowej tomografii i zautomatyzowanego uśredniania subtomogramów

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Przedstawiono podejście do określania struktur kompleksów glikoprotein błony wirusowej za pomocą kombinacji kriotomografii elektronowej i uśredniania sub-tomogramu za pomocą pakietu obliczeniowego Jsubtomomo.

Uśrednianie kolców glikoproteiny otoczki wirusowej z rekonstrukcji kriotomografii elektronowej przy użyciu Jsubtomo

Ten artykuł opisuje metodologię mikroskopii krioelektronowej, która jest używana do uzyskiwania wysokiej jakości mikroskopowych obrazów makrocząsteczek w ich stanie zbliżonym do natywnego. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy nadające się do dalszego przetwarzania komputerowego przy użyciu podejścia pojedynczej cząstki, opracowanego w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki.

Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

Ten artykuł przedstawia protokół do przetwarzania obrazów cryo-EM za pomocą pakietu oprogramowania SPHIRE. Obecny protokół może być stosowany do prawie wszystkich projektów EM pojedynczych cząstek, które są ukierunkowane na rozdzielczość bliską atomowi.

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Ten artykuł opisuje, jak efektywnie wykorzystać trzy platformy przetwarzania cryo-EM, tj. cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3, aby stworzyć pojedynczy i solidny przepływ pracy mający zastosowanie do różnych zestawów danych o pojedynczych cząstkach do określania struktury w wysokiej rozdzielczości.

Solidny przebieg przetwarzania w mikroskopii krioelektronowej jednocząsteczkowej (cryo-EM) z cryoSPARC, RELION, i Scipion

Tutaj opisane są protokoły przygotowania zestawów wirusów odpowiednich do analizy ciekłego EM i krio-EM w nanoskali przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Postęp w obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości zespołów wirusów w cieczach i lodzie

W artykule przedstawiono protokół przetwarzania danych wirusów grypy obrazowanych za pomocą tomografii krioelektronowej oraz późniejszego uśredniania glikoproteiny hemaglutyniny subtomogramem. Protokół ten obejmuje proces krok po kroku, od wstępnego przetwarzania obrazu po ostateczne udoskonalanie modelu.

Określanie struktury hemaglutininy w rozdzielczości subnanometrowej na podstawie tomografii krioelektronowej wirusów grypy

Poznaj metodę krioelektronowej mikroskopii do rekonstrukcji trójwymiarowej struktury helikalnych zespołów kapsydów HIV-1. Protokół obejmuje przygotowanie próbek, indeksowanie helikalne i iteracyjną rekonstrukcję w przestrzeni rzeczywistej.

Struktura zespołów kapsydów HIV-1 za pomocą mikroskopii krioelektronowej i iteracyjnej spiralnej rekonstrukcji w przestrzeni rzeczywistej (Wideo) | JoVE Journal

Struktura zgromadzeń kapsydu HIV-1 określona za pomocą kriomikroskopii elektronowej i iteracyjnej helikalnej rekonstrukcji w przestrzeni rzeczywistej

Przeglądaj więcej filmów