Struktura zespołów kapsydów HIV-1 za pomocą mikroskopii krioelektronowej i iteracyjnej spiralnej rekonstrukcji w przestrzeni rzeczywistej

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie metody uzyskania trójwymiarowej struktury cząsteczek składanych z heli za pomocą mikroskopii krioelektronowej. Protokół rozpoczyna się od przygotowania próbki kriogenicznej EM przy użyciu metody szybkiego rozcieńczania i blottingu tylnej strony w celu przejściowego zmniejszenia stężenia soli podczas przygotowywania zamrożonej, uwodnionej siatki EM. Proces ten zapewnia stabilność białek przy jednoczesnej redukcji szumów tła i poprawie stosunku sygnału do szumu podczas zbierania danych o niskiej dawce cryo EM, które następuje po zebraniu danych.

Indeksowanie spiralne wzorów dyfrakcyjnych zostało zakończone. Następnie przeprowadzane jest przetwarzanie obrazu, a następnie rekonstrukcja 3D w przestrzeni rzeczywistej, w wyniku której powstaje ostateczna mapa gęstości wirusa HIV z jednym kapsydem lub rurką ca. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ istnieje kilka krytycznych punktów dla optymalnego gromadzenia i analizy danych.

Na przykład w przypadku HIV jeden kapsyd zespoły rurkowe, które tworzą się tylko w jednym roztworze źródła molowego, szybko zmniejszają stężenie soli bez wpływu na strukturę. Bardzo ważne jest uzyskanie wysokiej jakości obrazów krioelektromagnetycznych. Biorąc pod uwagę obraz lampy, bardzo trudno jest dowiedzieć się, co zrobić, aby zindeksować krytyczną lampę i jakie oprogramowanie można rozważyć do wykonania rekonstrukcji 3D.

Ten film przedstawia szczegółowe i proste podejście do uzyskania rekonstrukcji 3D obiektów fizycznych i może być wykorzystany jako odniesienie do eksperymentu. Będę demonstrować procedurę z dr Puja. Oboje jesteśmy doktorami z Dr.Laboratory Aby przygotować zespoły białek jednego kapsydu HIV do kriogenicznego światła, zacznij od świecenia, rozładowując stronę węglową miedzianych siatek o siatce 200 poniżej 25 miliamperów przez 25 sekund.

Użyj nebulizatora, aby doprowadzić wilgotność do 80% w komorze środowiskowej, która jest domowym ręcznym tłokiem grawitacyjnym. W międzyczasie, chłodny ciekły etan w tłoku do butli in vitro z ciekłym azotem zamontuj zamrażarkę wgłębną na ręcznym tłoku grawitacyjnym. Następnie za pomocą kleszczy zaciśnij szczypce zamknięte na krawędzi siatki.

Nałóż 2,5 mikrolitra wstępnie zmontowanego roztworu białka na węglową stronę siatki. Następnie załaduj kleszcze na tłok tak, aby węglowa strona siatki była skierowana na zewnątrz. Dodaj trzy mikrolitry buforu do rozcieńczania o niskiej zawartości soli na tylną stronę siatki.

Natychmiast osusz siatkę kawałkiem bibuły filtracyjnej po tej samej stronie. Utrzymuj całą tylną powierzchnię siatki w bliskim kontakcie z bibułą filtracyjną przez około sześć sekund. Po wyjęciu bibuły filtracyjnej natychmiast zanurz siatkę w ciekłym etanie.

Na koniec wyjmij kleszczyki z tłoka i szybko przenieś siatkę do skrzynki do przechowywania siatki. Rozpocznij mikroskopię krioelektronową, ładując zamrożoną uwodnioną siatkę do mikroskopu elektronowego FEI polar G two elektronowego. Działa przy napięciu 200 kilowoltów i jest wyposażony w kamerę CCD 4K by 4K.

W trybie wyszukiwania przy niskiej dawce dodaj powiększenie około 200 x. Przeszukuj całą siatkę w poszukiwaniu obszarów z odpowiednim lodem. Zapisz pozycje tych obszarów w pliku etapu.

Przywołaj zapisane pozycje i dalej przesiewaj te obszary. Dodaj powiększenie 3 900 x w trybie wyszukiwania niskiej dawki. Wybierz obszary z jednolitą cienką warstwą lodu do zbierania danych, które charakteryzują się tym, że zawierają długie rurki zawieszone nad otworem.

Zapisz wszystkie obszary w pliku drugiego etapu. Przełącz na tryb ekspozycji. Dodaj powiększenie 59 000 x i wstaw aperturę obiektywu 100 mikrometrów.

Następnie dostosuj obiektywny stygmatyzm i intensywność wiązki do dawki około 15 elektronów na angstrem do kwadratu na ekspozycję. Wróć do trybu wyszukiwania niskiej dawki i przejdź do zapisanej pozycji. Zidentyfikuj i wyśrodkuj dobrą rurkę.

Za pomocą kamery CCD przełącz na tryb ostrości, wyreguluj ostrość i ustaw wartość rozmycia zwykle w zakresie od 0.5 do 2.5 mikrometra. Następnie przełącz się w tryb ekspozycji i ustaw czas ekspozycji od 0,3 do 0,5 sekundy dla dawki 15 elektronów na angstrem do kwadratu. Zbierz obrazy w aparacie płytkowym, pozwalając filmom ustabilizować się na 10 sekund przed wykonaniem ekspozycji.

Po zebraniu obrazów przejdź do następnej zapisanej pozycji i powtórz ten proces, aby zebrać więcej obrazów. Wywoływać filmy w pełnej mocy D 19 przez 12 minut. Następnie zdigitalizuj obrazy za pomocą skanera Nikon Super cool scan 9 000 ED o rozmiarze piksela 6,35 mikrometra.

Obiekt spiralny może być indeksowany za pomocą dwóch parametrów. Rząd Bessela N i linia warstwy o numerze L w transformacji forera sieci powierzchniowej obiektu spiralnego. Każda linia warstwy jest scharakteryzowana przez N i L i odpowiada zestawowi linii na siatce powierzchniowej oznaczonej wskaźnikami H i K.

Aby rozpocząć indeksowanie spiralne, użyj programu Iman Helix boxer, aby zaboksować stosunkowo długą i prostą rurkę o jednolitej średnicy i zapisać obraz w formacie MRC. Następnie zmierz promień rury za pomocą boxera programu Imana. Określ odległość powtórzeń HEL za pomocą programu opartego na korelacji krzyżowej, takiego jak I-M-G-C-C-F w pakiecie MRC.

Następnie oblicz foyer. Przekształć z nową długością pola, która jest całką odległości powtórzenia. Następnie wybierz dwie główne linie warstw, które definiują dwa podstawowe wektory siatki powierzchniowej, jeden zero i zero jeden w jednostkach piksela FFT.

Określ numery linii warstw, a także promienie maksymalnej amplitudy dla dwóch głównych linii warstw w transformacie Fouriera. Biorąc pod uwagę numery linii warstw i wartości rzędów Bessela dla dwóch głównych linii warstw, obrót między podjednostkami i osiowe wznoszenie się helisy jednej gwiazdy można uzyskać przy użyciu reguły wyboru opisanej w procedurze pisemnej. Te dwie liczby rzeczywiste opisują symetrię rury.

Rekonstrukcja 3D rozpoczyna się od segmentacji cząstek za pomocą programu Iman. Bokser. Po otwarciu mikrofotografii zawierającej spiralne cząstki, pokrój cząstkę na nakładające się na siebie segmenty w panelu sterowania boksera. Wybierz tryb spirali i ustaw parametry boksu.

Rozmiar pudełka powinien być większy niż średnica cząstki, a wartość dla OLA powinna wynosić około 90% rozmiaru pudełka. Po lewej stronie, kliknięcie na dowolnym końcu boksera cząstek automatycznie wygeneruje serię pól cząstek wzdłuż długości helisy, zapisz segmenty w ramkach oraz ich współrzędne. Kolejnym krokiem jest wykonanie wstępnej rekonstrukcji 3D przy użyciu iteracyjnej metody rekonstrukcji helisalnej przestrzeni rzeczywistej I-H-R-S-R przed obróbką za pomocą I-H-R-S-R.

Odwróć kontrast obrazów krio-EM i zastosuj filtrowanie dolnoprzepustowe. Następnie otwórz interfejs graficzny programu I-H-R-S-R, wpisując generator. Udostępnij interfejs graficzny ze wszystkimi informacjami dotyczącymi stosu cząstek w ramkach, w tym nazwą i ścieżką stosu, liczbą obrazów w stosie oraz wartościami parametrów symetrii.

Kliknij przycisk zakończenia, aby utworzyć skrypt rekonstrukcji. B 25 SP. Używam pełnego lub pustego cylindra jako początkowego odniesienia i pozwalam, aby procedura powtarzała się, aż nie nastąpią żadne zmiany w zdefiniowanej symetrii, co zwykle następuje po kilku cyklach. Symetria prawej heliki powinna dawać stabilnie zbieżną rekonstrukcję

Rekonstrukcja wygenerowana w ostatnim cyklu zostanie wykorzystana jako wstępny punkt odniesienia do dalszego udoskonalenia. Na koniec wykonaj rekonstrukcję 3D z iteracyjnym zagęszczeniem, korzystając z mapy gęstości 3D wygenerowanej przez I-H-R-S-R jako początkowego odniesienia dla dodatkowego udoskonalenia podczas udoskonalania. Symetria śrubowa jest ustalona przy obrocie między podjednostkami i wzniesieniu osiowym, które są określane na podstawie procedury I-H-R-S-R.

Następnie określ rozmycie i astygmatyzm obecne na mikrofotografii za pomocą programów CTF znajdź trzy i CTF tilt za pomocą programów pająków zwanych FT i mu pomnóż segmenty cząstek przez funkcję transferu kontrastu. Skrócony CTF wykonuje dopasowywanie projekcji, porównując projekcje objętości odniesienia z obrazami skorygowanymi przez CTF przy użyciu wyrównania wielu odniesień. Zmienność kąta nachylenia poza płaszczyzną jest ograniczona do plus minus 10 stopni i próbkowana w krokach co jeden stopień wprowadza ograniczenia, takie jak wysokie współczynniki korelacji w kątach płaskich, bliskie zeru stopni lub 180 stopni oraz ograniczone przesunięcia X.

Parametry wyrównania każdego segmentu są uwzględniane w rekonstrukcji tylko te segmenty, które spełniają wiązania. Po każdym iteracyjnym cyklu udoskonalania, rekonstrukcja 3D jest generowana przy użyciu projekcji wstecznej i dzielona przez niektóre przez CTF do kwadratu narzuca symetrię spiralną w celu wygenerowania objętości symetrii. Iteracyjne udoskonalanie jest przerywane, gdy nie nastąpi dalsza poprawa rozdzielczości nowej rekonstrukcji 3D.

Pojedynczy zespół kapsydu HIV z jednym kapsydem, rurka 92 e, został zapakowany, a jego transformata Fouriera jest obliczana dla spiralnego indeksowania dwóch promieni, określono numery linii warstwy i promienie maksymalnej amplitudy dla linii warstwy zero zero i zero jeden. Wartości końcowe ujemne 12 i 11 zostały następnie obliczone odpowiednio dla jednego zera i zera jedynki z powtarzaną odległością 5195,48 angstremów. Symetria śrubowa rury została określona jako delta Z równa się 6,81 angstrema, a delta pięć równa się 328,88 stopnia, delta Z i delta pięć zostały doprecyzowane do 7,13 angstremów i 328,86 stopni przy użyciu I-H-R-S-R, a wstępna rekonstrukcja została wygenerowana po 10 cyklach iteracyjnych.

Ostateczna rekonstrukcja po iteracyjnym udoskonaleniu znacznie poprawiła mapę gęstości w porównaniu z początkowym modelem obliczonym za pomocą I-H-R-S-R. Mapa gęstości rur montażowych kapsydu jest wyświetlana jako trzy ortogonalne przekroje równoległe do osi rury i blisko powierzchni, prostopadłe do osi rury i równoległe do i przez oś rury. Wyświetlana struktura wynika z renderowania powierzchni mapy gęstości 3D wyprofilowanej na 1,8 Sigma przy 100% objętości.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć bardzo dobre zrozumienie, jak uzyskać strukturę 3D sprzymierzeńca złożonej cząsteczki za pomocą mikroskopii elektronowej wrony.