Struktura zgromadzeń kapsydu HIV-1 określona za pomocą kriomikroskopii elektronowej i iteracyjnej helikalnej rekonstrukcji w przestrzeni rzeczywistej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie metody uzyskiwania trójwymiarowej struktury cząsteczek zmontowanych w helisę przy użyciu kriomikroskopii elektronowej. Protokół rozpoczyna się od przygotowania preparatu do kriomikroskopii elektronowej (cryo EM) z zastosowaniem metody szybkiego rozcieńczania i blottingu od strony tylnej w celu przejściowego obniżenia stężenia soli podczas przygotowywania mrożonej, uwodnionej siatki EM. Proces ten zapewnia stabilność białka, jednocześnie redukując szum tła i poprawiając stosunek sygnału do szumu podczas następującego po tym etapie zbierania danych w trybie niskiej dawki w kriomikroskopii elektronowej.

Indeksowanie helikalne obrazów dyfrakcyjnych zostało zakończone. Następnie przeprowadzono przetwarzanie obrazów, a po nim trójwymiarową rekonstrukcję w przestrzeni rzeczywistej, co pozwoliło uzyskać końcową mapę gęstości kapsydu HIV-1 lub rurki ca. Zazwyczaj osoby po raz pierwszy korzystające z tej metody mogą napotkać trudności, ponieważ istnieje kilka krytycznych punktów dla optymalnego gromadzenia i analizy danych.

Na przykład w przypadku HIV jedne z kapsydowych struktur rurkowych tworzą się wyłącznie w jednym roztworze źródłowym przy szybkim obniżaniu stężenia soli, co nie wpływa na ich strukturę. Kluczowe jest uzyskanie wysokiej jakości obrazów cryo-EM. Mając obraz rurki, bardzo trudno jest ustalić, jakie działania podjąć w celu indeksowania krytycznej rurki oraz jakie oprogramowanie można zastosować do rekonstrukcji 3D.

Niniejszy film prezentuje szczegółowe i przystępne podejście do uzyskiwania rekonstrukcji 3D obiektów fizycznych i może służyć jako punkt odniesienia dla Państwa eksperymentu. Procedurę zaprezentuję wraz z dr Pują. Oboje jesteśmy pracownikami podoktorskimi w laboratorium dr. Aby przygotować kompleksy białka kapsydu HIV-1 do cryo-EM, należy rozpocząć od naładowania powierzchniowego (glow discharge) strony węglowej miedzianych siatek o gęstości 200 mesh przy natężeniu 25 mA przez 25 s.

Użyj nebulizatora, aby doprowadzić wilgotność w komorze środowiskowej, która stanowi domowej roboty ręczny tłok grawitacyjny, do poziomu 80%. W międzyczasie schłodź ciekły etan w dozowniku typu vitro bott za pomocą ciekłego azotu, a następnie zamocuj dozownik do zamrażania szokowego do ręcznego tłoka grawitacyjnego. Następnie za pomocą pęsety zaciśnij szczypce na krawędzi siatki.

Nanieś 2,5 µL wcześniej przygotowanego roztworu białka na stronę węglową siatki. Następnie umieść pęsetę w tłoku tak, aby strona węglowa siatki była skierowana na zewnątrz. Dodaj 3 µL buforu rozcieńczającego o niskim zasoleniu na tylną stronę siatki.

Natychmiast osusz siatkę kawałkiem papieru filtracyjnego z tej samej strony. Utrzymuj całą tylną powierzchnię siatki w bliskim kontakcie z papierem filtracyjnym przez około sześć sekund. Po usunięciu papieru filtracyjnego natychmiast zanurz siatkę w ciekłym etanie.

Na koniec wyjmij pęsetę z tłoka i szybko przenieś siatkę do pudełka do przechowywania siatek. Rozpocznij kriomikroskopię elektronową, ładując zamrożoną uwodnioną siatkę do mikroskopu elektronowego FEI polar G two, pracującego przy napięciu 200 kilowoltów i wyposażonego w kamerę CCD Gatan 4K by 4K.

W trybie wyszukiwania przy niskiej dawce ustaw powiększenie około 200 x. Przeskanuj całą siatkę w celu znalezienia obszarów z odpowiednią warstwą lodu. Zapisz pozycje tych obszarów w pliku stołu.

Przywołaj zapisane pozycje i przeprowadź dalsze przesiewowe badanie tych obszarów. Zastosuj powiększenie 3 900 x w trybie poszukiwania z niską dawką. Do zbierania danych wybierz obszary z jednorodną cienką warstwą lodu, które charakteryzują się obecnością długich rurek zawieszonych nad otworem.

Zapisz wszystkie obszary w pliku drugiego etapu. Przełącz urządzenie w tryb ekspozycji. Ustaw powiększenie 59 000 x i wprowadź aperturę obiektywu 100 µm.

Następnie należy skorygować stygmatyzm obiektywu oraz natężenie wiązki tak, aby dawka wynosiła około 15 elektronów na angstrom kwadrat na ekspozycję. Powróć do trybu wyszukiwania z niską dawką i przemieść się do zapisanej pozycji. Zidentyfikuj i wycentruj odpowiednią próbkę.

Używając kamery CCD, przełącz do trybu ustawiania ostrości, dostrój ostrość i ustaw wartość rozmycia (defocus) zazwyczaj między 0,5 a 2,5 micrometers. Następnie przełącz do trybu ekspozycji i ustaw czas naświetlania od 0,3 do 0,5 seconds dla dawki 15 electrons per angstrom squared. Zbierz obrazy na kamerze płytkowej, pozwalając filmom na stabilizację przez 10 seconds przed wykonaniem ekspozycji.

Po zebraniu obrazów przejdź do kolejnej zapisanej pozycji i powtórz ten proces, aby zebrać więcej obrazów. Wywołaj filmy w pełnej mocy odczynnika D 19 przez 12 minut. Następnie zdigitalizuj obrazy za pomocą skanera Nikon Super cool scan 9, 000 ED przy rozmiarze piksela 6.35 micrometers.

Obiekt helikalny może być indeksowany za pomocą dwóch parametrów: rzędu funkcji Bessela N oraz numeru linii warstwowej L w transformacie Fouriera sieci powierzchniowej obiektu helikalnego. Każda linia warstwowa jest charakteryzowana przez N i L i odpowiada zestawowi linii na sieci powierzchniowej, oznaczonych indeksami H i K.

Aby rozpocząć indeksowanie helikalne, należy użyć programu Boxer z pakietu Iman do wycięcia stosunkowo długiego i prostego fragmentu rurki o jednorodnej średnicy, a następnie zapisać obraz w formacie MRC. Następnie należy zmierzyć promień rurki za pomocą programu Boxer z pakietu Iman. Odległość powtórzenia HEL należy wyznaczyć przy użyciu programu opartego na korelacji wzajemnej, takiego jak I-M-G-C-C-F z pakietu MRC.

Następnie oblicz foyer. Przekształć go, stosując nową długość pudełka, która stanowi wielokrotność odległości powtórzenia. Następnie wybierz dwie główne linie warstwowe, które definiują dwa podstawowe wektory sieci powierzchniowej: [1 0] oraz [0 1] w jednostkach pikseli FFT.

Wyznacz numery linii warstwowych oraz promienie maksymalnej amplitudy dla dwóch głównych linii warstwowych w transformacie Fouriera. Znając numery linii warstwowych i wartości rzędów funkcji Bessela dla dwóch głównych linii warstwowych, można wyznaczyć kąt obrotu między podjednostkami oraz wzrost osiowy jednej helisy gwiazdowej, korzystając z reguły wyboru opisanej w procedurze pisemnej. Te dwie liczby rzeczywiste opisują symetrię śrubową rurki.

Rekonstrukcja 3D rozpoczyna się od segmentacji cząsteczek przy użyciu programu Iman.Boxer. Po otwarciu mikrografii zawierającej cząsteczki helikalne, należy podzielić cząsteczkę na nakładające się segmenty w panelu sterowania programu Boxer. Wybierz tryb helix i ustaw parametry obramowywania.

Rozmiar ramki powinien być większy niż średnica cząsteczki, a wartość OLA powinna wynosić około 90% rozmiaru ramki. Po kliknięciu w dowolny koniec ramki cząsteczki, zostanie automatycznie wygenerowana seria ramek wzdłuż długości helisy, a podzielone segmenty wraz z ich współrzędnymi zostaną zapisane. Kolejnym krokiem jest przeprowadzenie wstępnej rekonstrukcji 3D przy użyciu iteracyjnej metody rekonstrukcji w przestrzeni rzeczywistej dla helis (I-H-R-S-R) przed właściwym przetwarzaniem metodą I-H-R-S-R.

Odwróć kontrast obrazów cryo-EM i zastosuj filtrowanie dolnoprzepustowe (LOWPASS). Następnie otwórz interfejs graficzny programu I-H-R-S-R, wpisując polecenie generator. Wprowadź do interfejsu graficznego wszystkie informacje dotyczące stosu obramowanych cząstek, w tym nazwę i ścieżkę dostępu do stosu, liczbę obrazów w stosie oraz wartości parametrów symetrii.

Kliknij przycisk finish, aby utworzyć skrypt rekonstrukcji. B 25 SP.I użyj pełnego lub pustego cylindra jako początkowego punktu odniesienia i pozwól procedurze cyklicznie działać do momentu, aż nie wystąpią już żadne zmiany w zdefiniowanej symetrii śruby, co zazwyczaj dzieje się po kilku cyklach. Prawoskrętna symetria helikalna powinna zapewnić stabilnie zbieżną rekonstrukcję.

Rekonstrukcja wygenerowana w ostatnim cyklu zostanie wykorzystana jako referencja początkowa do dalszego udoskonalenia. Na koniec należy przeprowadzić rekonstrukcję 3D z iteracyjnym udoskonaleniem, wykorzystując mapę gęstości 3D wygenerowaną przez I-H-R-S-R jako referencję początkową do dodatkowego udoskonalenia w trakcie procesu optymalizacji. Symetria helikalna jest ustalona na podstawie rotacji między podjednostkami oraz wzrostu osiowego, które zostały określone w procedurze I-H-R-S-R.

Następnie, za pomocą programów CTF find oraz CTF tilt z pakietu Spider, określ wartość defocusu i astygmatyzmu obecnych na mikrografii, wykorzystując funkcje FT oraz mu; pomnóż segmenty cząsteczek przez funkcję przenoszenia kontrastu (CTF). Przeprowadź dopasowanie projekcji (projection matching), porównując projekcje wolumenów referencyjnych z obrazami skorygowanymi pod kątem CTF, stosując wyrównanie wieloreferencyjne (multi reference alignment). Zmienność kąta nachylenia poza płaszczyzną ograniczono do zakresu plus lub minus 10 stopni z próbkowaniem w krokach jednostopniowych; wprowadź ograniczenia, takie jak wysokie współczynniki korelacji dla kątów w płaszczyźnie bliskich 0 stopni lub 180 stopni oraz ograniczone przesunięcia w osi X.

W przypadku parametrów dopasowania każdego segmentu, w rekonstrukcji uwzględnia się tylko te segmenty, które spełniają określone ograniczenia. Po każdym cyklu iteracyjnej rafinacji generowana jest rekonstrukcja 3D za pomocą wstecznej projekcji i dzielona przez kwadrat CTF, a następnie nakładana jest symetria helikalna w celu wygenerowania objętości symetrycznej. Rafinacja iteracyjna zostaje zakończona, gdy nie następuje już dalsza poprawa rozdzielczości nowej rekonstrukcji 3D.

Pojedynczy montaż kapsydu HIV-1, rurka o promieniu 92 Å, został wyodrębniony, a następnie obliczono jego transformatę Fouriera w celu indeksowania helikalnego dwóch promieni; wyznaczono numery linii warstw oraz promienie maksymalnej amplitudy dla linii warstw 10 i 01. Następnie obliczono wartości końcowe wynoszące odpowiednio -12 i 11 dla linii 10 i 01, przy odległości powtórzenia wynoszącej 5195,48 angstromów. Symetrię śrubową rurki określono jako delta Z równe 6,81 angstromów oraz delta pięć równe 328,88 stopnia; wartości delta Z i delta pięć zostały doprecyzowane do 7,13 angstromów i 328,86 stopnia przy użyciu I-H-R-S-R, a po 10 cyklach iteracyjnych wygenerowano wstępną rekonstrukcję.

Końcowa rekonstrukcja po iteracyjnym doprecyzowaniu znacznie poprawiła mapę gęstości w porównaniu z modelem początkowym obliczonym za pomocą I-H-R-S-R. Mapa gęstości rurek złożonych z kapsydów jest przedstawiona jako trzy orthogonalne przekroje: równoległe do osi rurki i blisko jej powierzchni, prostopadłe do osi rurki oraz równoległe i przechodzące przez oś rurki. Przedstawiona struktura jest wynikiem renderowania powierzchni trójwymiarowej mapy gęstości z konturowaniem przy poziomie 1,8 Sigma, obejmującym 100% objętości.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać bardzo dobrą wiedzę na temat tego, jak uzyskać strukturę 3D cząsteczki złożonej z ally za pomocą krio-mikroskopii elektronowej.