JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:12 min. • July 8th, 2025
Usuwanie nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórce jest głównie regulowane przez komórkowy układ ubikwityna-proteasom, w którym białko jest najpierw rozpoznawane i znakowane przez ubikwitynę, małe białko regulatorowe, i transportowane do proteasomu, kompleksu wielobiałkowego, w celu hydrolizy i klirensu.
Upośledzona aktywność układu ubikwityna-proteosom, częste zjawisko w chorobach neurodegeneracyjnych, może powodować gromadzenie się nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórkach, tworząc nierozpuszczalne agregaty białkowe o działaniu cytotoksycznym.
Aby uwidocznić i określić ilościowo agregację białek in vitro, należy uzyskać zawiesinę transdukowanych komórek ssaków - wyrażających zmutowane białko znakowane fluorescencyjnie, które przyjmuje nieprawidłowo sfałdowaną konformację z odsłoniętymi resztami hydrofobowymi - w odpowiednich podłożach.
Pipetować zwiększając stężenie inhibitora proteasomu do dołków czarnej płytki wielodołkowej w celu zminimalizowania fluorescencji tła podczas obrazowania. Zasiej zawiesinę komórek ssaków do studzienek. Inkubować, aby komórki przylegały do dna płytki i rozmnażały się.
Po wejściu do środka inhibitor proteasomu wiąże się z miejscami proteolityki
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych