Test tworzenia agregatów białkowych: metoda wykrywania i ilościowego określania agregacji białek w hodowanych komórkach po indukcji przez inhibitor proteasomu

Usuwanie nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórce jest głównie regulowane przez komórkowy układ ubikwityna-proteasom, w którym białko jest najpierw rozpoznawane i znakowane przez ubikwitynę, małe białko regulatorowe, i transportowane do proteasomu, kompleksu wielobiałkowego, w celu hydrolizy i klirensu.

Upośledzona aktywność układu ubikwityna-proteosom, częste zjawisko w chorobach neurodegeneracyjnych, może powodować gromadzenie się nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórkach, tworząc nierozpuszczalne agregaty białkowe o działaniu cytotoksycznym.

Aby uwidocznić i określić ilościowo agregację białek in vitro, należy uzyskać zawiesinę transdukowanych komórek ssaków - wyrażających zmutowane białko znakowane fluorescencyjnie, które przyjmuje nieprawidłowo sfałdowaną konformację z odsłoniętymi resztami hydrofobowymi - w odpowiednich podłożach.

Pipetować zwiększając stężenie inhibitora proteasomu do dołków czarnej płytki wielodołkowej w celu zminimalizowania fluorescencji tła podczas obrazowania. Zasiej zawiesinę komórek ssaków do studzienek. Inkubować, aby komórki przylegały do dna płytki i rozmnażały się.

Po wejściu do środka inhibitor proteasomu wiąże się z miejscami proteolityki i blokuje jego aktywność, powodując gromadzenie się wyrażonych zmutowanych białek, które następnie oddziałują poprzez odsłonięte reszty hydrofobowe i tworzą agregaty cytoplazmatyczne, ostatecznie prowadząc do śmierci komórki.

Dodaj fluorescencyjny barwnik wiążący DNA, aby zabarwić jądra komórkowe. Wyobraź sobie płytę. Fluorescencyjne zmutowane agregaty białkowe wydają się rozproszone w niebarwionej cytoplazmie.

Studzienki zawierające wyższe stężenia inhibitorów proteasomu wykazują wyższy stosunek zagregowanej liczby białek do liczby komórek niż studzienki o niższych stężeniach inhibitorów proteasomów.

W celu przeniesienia związku, na 384-dołkowej płytce polipropylenowej do przechowywania, dodać seryjne rozcieńczenia związków w standardowej serii rozcieńczeń od 1 do 3. Następnie, za pomocą urządzenia do obsługi cieczy wyposażonego w głowicę kapilarną 384, rozprowadź 0,25 mikrolitra inhibitorów proteasomu na pustych, czarnych, 384-dołkowych płytkach testowych z płaskim dnem. Następnie zasiej 1,5 x 10⁴ komórki na tych płytkach. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny.

Przed obrazowaniem linii komórkowej poddanej działaniu inhibitorów proteasomu należy dodać 10 mikrolitrów wstępnie podgrzanego DMEM z roztworem barwiącym i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Po barwieniu uruchom oprogramowanie do obsługi automatycznego mikroskopu, wybierając zakładkę "Mikroskop". Najpierw wybierz zakładkę "Konfiguracja", a następnie wybierz obiektyw 20X i odpowiedni typ płytki.

Aby umożliwić prawidłowe ustawienie ostrości na różnych typach płytek, upewnij się, że "Kołnierz" jest ustawiony na odpowiednią wartość na obiektywie.

Następnie wybierz "Ekspozycja 1", ustaw wysokość ostrości na "0 mikrometrów", a następnie wybierz "Ostrość". Po ustawieniu ostrości naświetl kamerę 1.

Aby zoptymalizować płaszczyznę ekspozycji, dostosuj wysokość ostrości i kliknij "Weź wysokość". Zmień czasy naświetlania mocy lasera, aby uzyskać maksymalną intensywność pikseli około 3 000 pikseli, i zapisz parametry ekspozycji.

Wybierz kartę "Definicja eksperymentu". Utwórz układ i układ podrzędny. Następnie przeciągnij i upuść odpowiedni układ, ekspozycję, obraz referencyjny, plik pochylenia i układ podrzędny. Następnie zapisz eksperyment.

Na koniec wybierz zakładkę "Automatyczny eksperyment" i uzyskaj obrazy. W przypadku obrazów 2-kanałowych należy najpierw wybrać algorytm oprogramowania, aby podzielić obiekty podstawowe, takie jak jądra, cytozol i agregaty.