JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:27 min. • July 8th, 2025
Biomasa to materia organiczna pochodzenia roślinnego składająca się głównie ze złożonych polisacharydów. Enzymy rozkładające węglowodany działają na te polisacharydy, tworząc mniejsze oligosacharydy.
Aby ocenić aktywność degradacji enzymu, zacznij od pobrania różnych nierozpuszczalnych biomas chromogennych - substratów ICB obecnych w studzienkach porowatej płytki reakcyjnej. Podłoża te otrzymywane są z barwienia materiałów pochodzenia roślinnego barwnikiem chlorotriazynowym o określonym kolorze. Powstała w ten sposób biomasa zawiera znakowane barwnikiem złożone polisacharydy, które służą jako substrat dla aktywności enzymów.
Teraz dodaj roztwór buforowy zawierający enzym hydrolizujący węglowodany. Bufor utrzymuje pH dla optymalnej aktywności enzymów. Umieścić płytkę reakcyjną na wytrząsarce i inkubować. Ciągłe mieszanie pozwala cząsteczkom enzymu dotrzeć do docelowego polisacharydu w podłożu ICB.
Podczas inkubacji enzym hydrolizujący rozszczepia kowalencyjne wiązania glikozydowe w długołańcuchowych polisacharydach. W wyniku reakcji powstają rozpuszczalne oligosacharydy połączone z cząsteczkami barwnika, które pozostają w roztworze.
Po zakończeniu degradacji umieść płytkę reakcyjną na wierzchu płytki produktu i odwiruj zespół. Podczas wirowania kolorowy roztwór zawierający produkty reakcji przechodzi przez filtr na dnie płytki i gromadzi się w płytce produktu. Za pomocą czytnika płytek zapisać absorbancję supernatantu.
Wyższa wartość absorbancji oznacza wytwarzanie dużej liczby oligosacharydów związanych z barwnikiem - co wskazuje na skuteczność enzymu w degradacji substratu ICB.
Aby przeprowadzić test chromogeniczny z czerwoną nierozpuszczalną biomasą chromogenną lub słomą pszenną ICB, należy rozpocząć od dodania 200 mikrolitrów roztworu aktywacyjnego do każdej studzienki płytki testowej. Następnie inkubować płytkę w temperaturze pokojowej, bez mieszania przez 10 minut.
Usuń stabilizator, używając 100 mikrolitrów sterylnej wody, aby trzykrotnie umyć studzienki. Następnie dodaj 150 mikrolitrów 100-milimolowego buforu octanu sodu o pH 4,5 i 5 mikrolitrów po 10 jednostek na mililitr różnych roztworów endo-ksylanazy.
Umieść płytkę produktu pod płytką substratu, aby zebrać wszelkie potencjalne wycieki z płytki substratu podczas wytrząsania i inkubować reakcję w temperaturze pokojowej i 100 obr./min przez 2 godziny.
Po inkubacji umieścić płytkę zestawu do oznaczania, z płytką produktu pod nią, w wirówce i odwirowywać w dół przy 2 700 x g przez 10 minut, aby przenieść produkt reakcji do dołków płytki produktu.
Sprawdź, czy objętość cieczy w każdej studzience jest w przybliżeniu taka sama. Następnie, za pomocą czytnika płytek, odczytaj absorbancję płytki zbiorczej przy 517 nanometrach dla czerwonej słomy pszennej ICB.