Test wiązania aneksyny V: technika oparta na fluorescencji do identyfikacji erytrocytów apoptotycznych poprzez znakowanie fosfatydyloseryną

W pewnych stanach patologicznych erytrocyty lub czerwone krwinki ulegają kurczeniu się komórek, czemu towarzyszy translokacja fosfolipidu błonowego - fosfatydyloseryny - z wewnętrznej do zewnętrznej błony błonowej, co prowadzi do zaprogramowanej śmierci komórki, eryptozy, wywołując fagocytozę komórkową za pośrednictwem makrofagów.

Aby zmierzyć eryptozę wywołaną jonoforem w izolowanej ludzkiej populacji erytrocytów za pomocą testu wiązania aneksyny V, należy rozpocząć od erytrocytów zawieszonych w buforze wolnym od glukozy.

Niedobór glukozy indukuje stres komórkowy, aktywując cytozolową kinazę białkową C, która następnie aktywuje kanały wapniowe i powoduje napływ jonów wapnia. Ponadto aktywowane są kanały potasowe, powodując wypływ potasu i kurczenie się komórek.

Następnie dodaj jonofor wapnia, który tworzy stabilny kompleks z zewnątrzkomórkowymi jonami wapnia. Kompleks ułatwia cytozolowe wnikanie jonów wapnia przez błonę komórkową, dodatkowo zwiększając wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia. To z kolei aktywuje scramblase - dwukierunkowy transporter fosfolipidów - który pomaga w translokacji fosfatydyloseryny z wewnętrznej do zewnętrznej błony komórkowej, zmniejszając asymetrię błony i wywołując eryptozę.

Odwirować erytrocyty poddane działaniu jonoforu. Ponownie zawiesić komórki w buforze wiążącym zawierającym wapń. Dodać roztwór aneksyny V sprzężony z barwnikiem fluorescencyjnym.

Zależne od wapnia białko wiążące fosfolipidy, aneksyna V, o wysokim powinowactwie do fosfatydyloseryny, wiąże się z odsłoniętymi resztami fosfatydyloseryny na zewnętrznej ulotce błony komórkowej.

Stosując sortowanie komórek aktywowane fluorescencyjnie, oddziel populację erytrocytów na podstawie intensywności fluorescencji aneksyny V. Erytrocyty eryptotyczne wykazują wyższą intensywność fluorescencji aneksyny V niż zdrowe erytrocyty.

Rozcieńczyć 2 mililitry buforu wiążącego 5X Aneksyna V w 8 mililitrach PBS, aby uzyskać bufor wiążący 1X. Ponownie zawiesić osady komórkowe traktowane jonomycyną i nietraktowane w 1 mililitrze buforu wiążącego 1X.

Weź 235 mikrolitrów zawiesin komórkowych w buforze wiążącym i dodaj 15 mikrolitrów koniugatu Annexin V-Alexa Fluor 488 w probówce do mikrowirówki. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemnym miejscu.

Wirować przy 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant. Przemyj komórki dwukrotnie buforem wiążącym 1X, zawieszając osad komórkowy w 1,5 mililitra buforu wiążącego i odwirowując przy 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osady komórek w 250 mikrolitrach buforu wiążącego 1X do pomiarów cytometrii przepływowej. Teraz przenieś 200 mikrolitrów erytrocytów barwionych aneksyną V do 1-mililitrowych okrągłodennych probówek polistyrenowych kompatybilnych z cytometrią przepływową.

Zaloguj się do oprogramowania do cytometrii przepływowej i kliknij przycisk "Nowy eksperyment". Kliknij przycisk "Nowa probówka", wybierz "Arkusz globalny" i wybierz "Zastosuj analizę", aby zmierzyć intensywność fluorescencji o długości fali wzbudzenia 488 nanometrów i długości fali emisji 530 nanometrów.

Ustaw liczbę komórek na 20 000, które mają zostać pobrane do analizy sortowania komórek aktywowanych fluorescencją. Wybierz żądaną rurę i kliknij przycisk "Załaduj". Kliknij przycisk "Nagraj", aby uzyskać pomiary rozproszenia do przodu i z boku. Powtórzyć te czynności dla wszystkich próbek.

Kliknij prawym przyciskiem myszy przycisk "Próbka" i kliknij "Zastosuj analizę wsadową", aby wygenerować plik wynikowy. Kliknij prawym przyciskiem myszy przycisk "Próbka" i kliknij "Generuj pliki FSC".