JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:21 min • July 8th, 2025
W pewnych stanach patologicznych erytrocyty lub czerwone krwinki ulegają kurczeniu się komórek, czemu towarzyszy translokacja fosfolipidu błonowego - fosfatydyloseryny - z wewnętrznej do zewnętrznej błony błonowej, co prowadzi do zaprogramowanej śmierci komórki, eryptozy, wywołując fagocytozę komórkową za pośrednictwem makrofagów.
Aby zmierzyć eryptozę wywołaną jonoforem w izolowanej ludzkiej populacji erytrocytów za pomocą testu wiązania aneksyny V, należy rozpocząć od erytrocytów zawieszonych w buforze wolnym od glukozy.
Niedobór glukozy indukuje stres komórkowy, aktywując cytozolową kinazę białkową C, która następnie aktywuje kanały wapniowe i powoduje napływ jonów wapnia. Ponadto aktywowane są kanały potasowe, powodując wypływ potasu i kurczenie się komórek.
Następnie dodaj jonofor wapnia, który tworzy stabilny kompleks z zewnątrzkomórkowymi jonami wapnia. Kompleks ułatwia cytozolowe wnikanie jonów wapnia przez błonę komórkową, dodatkowo zwiększając wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia. To z kolei aktywuje scramblase - dwukierunkowy transporter fosfolipidów - który pomaga w translokacji fosfatydyloseryny z wewnętrznej do zewnętrznej błony komórkowej, zmniejszając asymetrię błony i wywołując eryptozę.
Odwirować erytrocyty poddane działaniu jonoforu. Ponownie zawiesić komórki w buforze wiążącym zawierającym wapń. Dodać roztwór aneksyny V sprzężony z barwnikiem fluorescencyjnym.
Zależne od wapnia białko wiążące fosfolipidy, aneksyna V, o wysokim powinowactwie do fosfatydyloseryny, wiąże się z odsłoniętymi resztami fosfatydyloseryny na zewnętrznej ulotce błony komórkowej.
Stosując sortowanie komórek aktywowane fluorescencyjnie, oddziel populację erytrocytów na podstawie intensywności fluorescencji aneksyny V. Erytrocyty eryptotyczne wykazują wyższą intensywność fluorescencji aneksyny V niż zdrowe erytrocyty.
Rozcieńczyć 2 mililitry buforu wiążącego 5X Aneksyna V w 8 mililitrach PBS, aby uzyskać bufor wiążący 1X. Ponownie zawiesić osady komórkowe traktowane jonomycyną i nietraktowane w 1 mililitrze buforu wiążącego 1X.
Weź 235 mikrolitrów zawiesin komórkowych w buforze wiążącym i dodaj 15 mikrolitrów koniugatu Annexin V-Alexa Fluor 488 w probówce do mikrowirówki. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemnym miejscu.
Wirować przy 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant. Przemyj komórki dwukrotnie buforem wiążącym 1X, zawieszając osad komórkowy w 1,5 mililitra buforu wiążącego i odwirowując przy 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osady komórek w 250 mikrolitrach buforu wiążącego 1X do pomiarów cytometrii przepływowej. Teraz przenieś 200 mikrolitrów erytrocytów barwionych aneksyną V do 1-mililitrowych okrągłodennych probówek polistyrenowych kompatybilnych z cytometrią przepływową.
Zaloguj się do oprogramowania do cytometrii przepływowej i kliknij przycisk "Nowy eksperyment". Kliknij przycisk "Nowa probówka", wybierz "Arkusz globalny" i wybierz "Zastosuj analizę", aby zmierzyć intensywność fluorescencji o długości fali wzbudzenia 488 nanometrów i długości fali emisji 530 nanometrów.
Ustaw liczbę komórek na 20 000, które mają zostać pobrane do analizy sortowania komórek aktywowanych fluorescencją. Wybierz żądaną rurę i kliknij przycisk "Załaduj". Kliknij przycisk "Nagraj", aby uzyskać pomiary rozproszenia do przodu i z boku. Powtórzyć te czynności dla wszystkich próbek.
Kliknij prawym przyciskiem myszy przycisk "Próbka" i kliknij "Zastosuj analizę wsadową", aby wygenerować plik wynikowy. Kliknij prawym przyciskiem myszy przycisk "Próbka" i kliknij "Generuj pliki FSC".
W niniejszym artykule omówiono proces eryptozy w erytrocytach, charakteryzujący się kurczeniem się komórki oraz translokacją fosfatydyloseryny. W badaniu przedstawiono metodę pomiaru eryptozy indukowanej jonoforami z wykorzystaniem testu wiązania Aneksyny V.
Test wiązania Aneksyny V umożliwia ilościowe wykrywanie eryptozy w erytrocytach poprzez pomiar eksternalizacji fosfatydyloseryny, która jest cechą charakterystyczną zaprogramowanej śmierci komórki. Ta technika oparta na fluorescencji zapewnia pewność prognostyczną w ocenie odpowiedzi komórkowych na stresory i wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w wczesnych etapach procesów odkrywania leków. Jej integracja z rurociągami B+R zwiększa niezawodność walidacji celów oraz przesiewów funkcjonalnych w badaniach nad hematologią i śmiercią komórek.
Ten test wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do badań przedklinicznych, wspierając zarówno studia mechanistyczne, jak i ilościowe przesiewy apoptozy erytrocytów.
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 22 sierpnia 2026