Test zubożenia glukozy in vitro: oparta na fluorescencji metoda ilościowego określania wychwytu glukozy w komórkach za pomocą zewnątrzkomórkowego pomiaru wyczerpania glukozy

Glukoza, podstawowe źródło energii komórkowej, dostaje się do komórek przez białka transportujące glukozę w błonie komórkowej. Glukoza jest rozkładana w cytoplazmie komórki do pirogronianu poprzez szlak glikoliczny, generując energię przez trifosforan adenozyny lub ATP dla metabolizmu komórkowego.

Aby zmierzyć wewnątrzkomórkowy wychwyt glukozy, zacznij od przylegającej hodowli fibroblastów na płytce wielodołkowej. Zastąp pożywkę pożywką bezglukozową i inkubuj. Komórki metabolizują dostępną glukozę w celu wytworzenia energii, osiągając stan niedoboru glukozy.

Zastąp pożywkę w jednym zestawie studzienek pożywką bezglukozową zawierającą insulinę, stymulator wychwytu glukozy i fluorescencyjną deoksyglukozę, analog glukozy. Potraktuj inny zestaw studzienek pożywką bezglukozową zawierającą fluorescencyjną deoksyglukozę.

Podczas inkubacji insulina stymuluje translokację dodatkowych transporterów glukozy do błony komórkowej, ułatwiając zwiększony wychwyt fluorescencyjnej deoksyglukozy przy braku glukozy.

Deoksyglukoza jest fosforylowana i nie jest dalej metabolizowana przez komórki. Jednocześnie zmniejsza się zewnątrzkomórkowe stężenie fluorescencyjnej deoksyglukozy.

Po inkubacji zebrać pożywki zawierające niewykorzystaną fluorescencyjną deoksyglukozę. Potraktuj komórki buforem do lizy. Detergent w buforze tworzy micele i rozpuszcza błony komórkowe, powodując uwalnianie treści wewnątrzkomórkowej.

Za pomocą czytnika mikropłytek zmierz fluorescencję homogenatu komórkowego zawierającego wewnątrzkomórkową fluorescencyjną deoksyglukozę i pożywki zawierające niewykorzystaną zewnątrzkomórkową fluorescencyjną deoksyglukozę.

Fibroblasty stymulowane insuliną wykazują zwiększony wewnątrzkomórkowy fluorescencyjny wychwyt deoksyglukozy i odpowiadający mu zmniejszony zewnątrzkomórkowy fluorescencyjny deoksyglukoza w porównaniu z komórkami niestymulowanymi.

Użyj 8 powtórzeń dla każdego warunku symulacji. Dlatego przygotuj 1 mililitr dla każdego warunku symulacji.

Użyj 7 warunków symulacyjnych bez insuliny: FD-glukoza 2,5 mikrograma na mililitr, 1 mikrogram na mililitr, 0,5 mikrograma na mililitr, 0,2 mikrograma na mililitr, 0,1 mikrograma na mililitr, 0,05 mikrograma na mililitr i 0 miligrama na mililitr w jednej 96-dołkowej płytce.

Użyj 7 warunków stymulacji insuliną: FD-glukoza 2,5 mikrograma na mililitr, 1 mikrogram na mililitr, 0,5 mikrograma na mililitr, 0,2 mikrograma na mililitr, 0,1 mikrograma na mililitr, 0,05 mikrograma na mililitr i 0 mikrograma na mililitr w innej 96-dołkowej płytce.

Aby przygotować warunki stymulacji, rozcieńczyć 1 mikrolitr 5 miligramów na mililitr roztworu roboczego FD-glukozy i 999 mikrolitrów DMEM bez glukozy, aby uzyskać 1 mililitr roboczego roztworu podstawowego.

Korzystając z tego roboczego roztworu podstawowego, przygotuj 1:2000, 1:5000, 1:10000, 1:25000, 1:50000 i 1:100,000 rozcieńczenia FD-glukozy, aby uzyskać 2,5 mikrograma na mililitr, 1 mikrogram na mililitr, 0,5 mikrograma na mililitr, 0,2 mikrograma na mililitr, 0,1 mikrograma na mililitr, 0,05 mikrograma na mililitr w probówkach 2-mililitrowych bezpośrednio przed eksperymentami w komorze bezpieczeństwa biologicznego bez świateł. Dodaj 1 mikrolitr insuliny do każdego z tych warunków.

Po 40 minutach inkubacji zdekantować wolny od glukozy DMEM z każdej studzienki na 96-dołkowe płytki i wchłonąć pozostały płyn sterylnymi ręcznikami papierowymi. Dodaj po 100 mikrolitrów z różnych warunków uzdatniania opisanych wcześniej do studzienek wzdłuż jednej kolumny i 100 mikrolitrów z tych samych warunków uzdatniania do studzienek wzdłuż rzędu na obu płytkach 96-dołkowych. Oznacz płytki, na których wykorzystano warunki, z insuliną i bez insuliny.

Dodaj sam DMEM bez glukozy do studzienek kontrolnych. Inkubować płytkę przez 40 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych w ciemności.

Po stymulacji komórek przez 40 minut, przenieś pożywkę stymulacyjną z obu płytek na nowe płytki 96-dołkowe, zachowując ten sam układ eksperymentalny. Umyj komórki PBS. Usuń PBS i zdekantuj pozostały roztwór na sterylnych ręcznikach papierowych.

Dodać inhibitor proteazy do buforu testu radioimmunoprecypitacyjnego w celu ochrony białek. Umieścić płytki zawierające test radioimmunoprecypitacyjny w wytrząsarce na 30 minut.

Za pomocą czytnika mikropłytek zmierz fluorescencję przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 485 i 535 nanometrów, najpierw w pożywce zawierającej zewnątrzkomórkową FD-glukozę, a następnie na płytce z komórkami poddanymi lizie testu radioimmunoprecypitacji pod koniec 30-minutowej inkubacji.