JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:04 min • July 8th, 2025
W tkankach glukoza zewnątrzkomórkowa dostaje się do komórek poprzez ułatwioną dyfuzję przez specyficzne transportery glukozy.
Glukoza jest rozkładana do pirogronianu w cytoplazmie komórki poprzez glikolizę, szlak metaboliczny, wytwarzający energię w postaci trifosforanu adenozyny lub ATP dla komórkowych procesów metabolicznych.
Aby zmierzyć wychwyt glukozy ex vivo, zacznij od świeżo pobranej tkanki wątroby myszy o małych rozmiarach. Dodać odpowiedni bufor w celu utrzymania warunków fizjologicznych.
Następnie przenieś tkankę na wielodołkową płytkę zawierającą pożywkę bezglukozową. Następnie należy przeprowadzić inkubację w pożywkach bezglukozowych uzupełnionych deoksyglukozą, fluorescencyjnie znakowanym analogiem glukozy. Mały rozmiar tkanki umożliwia wnikanie deoksyglukozy.
Deoksyglukoza dostaje się do komórek przez transportery glukozy, przy braku glukozy. W komórkach deoksyglukoza ulega fosforylacji, ale nie jest dalej metabolizowana, co prowadzi do jej akumulacji.
Zebrać pożywki zawierające niewykorzystaną, znakowaną fluorescencyjnie deoksyglukozę w żądanych punktach czasowych. Za pomocą czytnika mikropłytek zmierz fluorescencję zewnątrzkomórkowej deoksyglukozy, która może być skorelowana z wewnątrzkomórkowym wychwytem deoksyglukozy przez tkanki.
Pobrane tkanki lub narządy inkubować na 6-dołkowej płytce zawierającej PBS przez jedną minutę. Z każdą tkanką lub narządem należy obchodzić się w osobnym dołku. Po minucie umieść każdą chusteczkę na sterylnym ręczniku papierowym, aby wchłonąć PBS.
Przenieś tkanki lub narządy na oddzielną 6-dołkową płytkę zawierającą 4 000 mikrolitrów bezglukozowego DMEM i inkubuj przez dwie minuty. Po dwóch minutach wyjmij i przenieś tkanki do studzienek 6-dołkowej płytki zawierającej 0,29 milimolowego roztworu roboczego FD-glukozy. Inkubować 6-dołkowe płytki zawierające tkanki w roztworze roboczym FD-glukozy w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Zbierz 100 mikrolitrów roztworu roboczego FD-glukozy z każdej studzienki po 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minutach inkubacji i przenieś zebrane 100 mikrolitrów roztworu roboczego FD-glukozy na 96-dołkowe płytki, aby przeanalizować kinetykę zewnątrzkomórkowego wyczerpania glukozy FD. Wstrząsnąć przed i po pobraniu.
Zmierz fluorescencję przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 485 i 535 nanometrów za pomocą czytnika mikropłytek.