Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego: wysokoprzepustowa technika identyfikacji wewnątrzkomórkowych białek wiążących drugi przekaźnik nukleotydu bakteryjnego
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:38 min. • July 8th, 2025
Bakterie wytwarzają nukleotydowe przekaźniki sekundowe, NSM - wewnątrzkomórkowe cząsteczki sygnałowe - w odpowiedzi na odpowiednie bodźce. Cząsteczki te wiążą się z białkami docelowymi i regulują funkcje bakterii.
Aby zidentyfikować te białka docelowe za pomocą różnicowego promienistego działania kapilarnego testu ligandowego, należy pobrać płytkę wielodołkową z lizatem komórek bakteryjnych zawierającym rozpuszczalne białka. Białka te pochodzą z różnych klonów bakteryjnych wykazujących ekspresję poszczególnych ORF - otwartych ramek odczytu - w genomie, dzięki czemu każda studzienka ma odrębne białko.
Dodać mieszaninę tetra- i pentafosforanów guanozyny - NSM znakowanych radioaktywnym fosforem. Cząsteczki te wiążą się z białkami docelowymi w lizacie. Za pomocą narzędzia do szpilek zbierz równą ilość płynu z każdej studzienki. Umieść narzędzie na membranie nitrocelulozowej, aby osadzić ciecz w postaci plam.
Białka docelowe wiążą się z błoną poprzez oddziaływania niekowalencyjne, zapobiegając ich dyfuzji. To sekwestruje związane znakowane radioaktywnie NSM w centralnym punkcie aplikacji. Wolne NSM dyfundują promieniowo wraz z fazą ciekłą poprzez działanie kapilarne.
Użyj obrazowania lu
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych