JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:38 min. • July 8th, 2025
Bakterie wytwarzają nukleotydowe przekaźniki sekundowe, NSM - wewnątrzkomórkowe cząsteczki sygnałowe - w odpowiedzi na odpowiednie bodźce. Cząsteczki te wiążą się z białkami docelowymi i regulują funkcje bakterii.
Aby zidentyfikować te białka docelowe za pomocą różnicowego promienistego działania kapilarnego testu ligandowego, należy pobrać płytkę wielodołkową z lizatem komórek bakteryjnych zawierającym rozpuszczalne białka. Białka te pochodzą z różnych klonów bakteryjnych wykazujących ekspresję poszczególnych ORF - otwartych ramek odczytu - w genomie, dzięki czemu każda studzienka ma odrębne białko.
Dodać mieszaninę tetra- i pentafosforanów guanozyny - NSM znakowanych radioaktywnym fosforem. Cząsteczki te wiążą się z białkami docelowymi w lizacie. Za pomocą narzędzia do szpilek zbierz równą ilość płynu z każdej studzienki. Umieść narzędzie na membranie nitrocelulozowej, aby osadzić ciecz w postaci plam.
Białka docelowe wiążą się z błoną poprzez oddziaływania niekowalencyjne, zapobiegając ich dyfuzji. To sekwestruje związane znakowane radioaktywnie NSM w centralnym punkcie aplikacji. Wolne NSM dyfundują promieniowo wraz z fazą ciekłą poprzez działanie kapilarne.
Użyj obrazowania luminoforowego, aby wykryć sygnały radioaktywne i uzyskać cyfrowy obraz plam. Nakreśl punkty za pomocą dwóch okręgów. Zewnętrzna przedstawia obrzeża rozproszonych NSM. Wewnętrzny okrąg reprezentuje sekwestrowane NSM.
Oblicz frakcję wiążącą - intensywność promieniotwórczości wykrytej z wewnętrznego okręgu w stosunku do całkowitej radioaktywności rozproszonej plamki. Zlokalizuj miejsca o wysokich frakcjach wiążących, aby zidentyfikować dołki z białkami docelowymi związanymi z NSM.
W celu przeprowadzenia badań przesiewowych białek docelowych metodą DRaCALA należy dodać 20 mikrolitrów rozmrożonych lizatów całokomórkowych do poszczególnych dołków 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej z dnem w kształcie litery V i dodać 2,5 jednostki endonukleazy Serratia marcescens do każdej studzienki. Po 15 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza umieść lizaty na lodzie na 20 minut.
Następnie wymieszaj równe objętości pięciofosforanu guanozyny znakowanego fosforem 32 i tetrafosforanu guanozyny i dodaj 1x bufor do lizy #1 do mieszaniny, aby uzyskać czteronanomolowy roztwór pentafosforanu guanozyny.
Za pomocą pipety wielokanałowej i przefiltrowanych końcówek pipet wymieszać 10 mikrolitrów mieszaniny pentafosforanu guanozyny z lizatem komórkowym przez pięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji umyj trzykrotnie narzędzie do szpilek 96X w 0,01% roztworze niejonowego detergentu przez 30 sekund, a następnie 30 sekund suszenia na ręczniku papierowym na pranie, przed umieszczeniem narzędzia do szpilek w 96-dołkowej płytce próbki. Po 30 sekundach podnieś szpilkę prosto do góry i umieść ją prosto w dół na membranie nitrocelulozowej na 30 sekund.
Po pięciu minutach suszenia umieść membranę nitrocelulozową w przezroczystym plastikowym folderze do przechowywania, naświetlenia ekranu luminoforowego i wizualizacji za pomocą obrazowania luminoforowego, jak pokazano.
Aby określić ilościowo i zidentyfikować potencjalne białka docelowe w oprogramowaniu analitycznym powiązanym z obrazownikiem luminoforowym, otwórz plik .gel z wizualizowanymi płytkami.
Aby zdefiniować miejsca do analizy, użyj funkcji "Analiza tablicowa", aby skonfigurować siatkę 12 kolumn na 8 wierszy. Aby oznaczyć zewnętrzną krawędź całych plam, nakreśl duże okręgi. Wyeksportuj "Volumn+Background" i "Area" zdefiniowanych dużych okręgów do arkusza kalkulacyjnego, aby opisać małe wewnętrzne kropki. Zmniejsz rozmiar zdefiniowanych okręgów.
Wyeksportuj "Objętość + Tło" i "Obszar" zdefiniowanych małych okręgów i zapisz wszystkie dane w arkuszu kalkulacyjnym. W razie potrzeby ustaw okręgi tak, aby nakładały się na plamy, zmieniając ich rozmiar na nieco większy niż rzeczywiste plamki.
Użyj równania, aby obliczyć ułamki wiążące w arkuszu kalkulacyjnym i wykreślić dane. Następnie zidentyfikuj potencjalne białka wiążące w studzienkach, które wykazują wysokie frakcje wiążące w porównaniu z większością innych studzienek.