$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Organoidy jelitowe podsumowują przypominającą jelita organizację krypty i kosmków z centralnym światłem składającym się z martwych komórek i szczątków. Światło jest wyściełane komórkami przypominającymi kosmki i pączkującymi, przypominającymi krypty wypukłościami, w których znajdują się komórki macierzyste.
Różne komórki organoidowe wytwarzają różne poziomy reaktywnych form tlenu, ROS - produktów ubocznych aktywności metabolicznej, których akumulacja prowadzi do stresu oksydacyjnego.
Aby zobrazować stres oksydacyjny w różnych komórkach, zacznij od pobrania wielodołkowej płytki zawierającej hodowane organoidy 3D w macierzy podstawnej. Organoidalne komórki macierzyste wyrażają białko zielonej fluorescencji lub białko znakowane GFP, które pomaga je odróżnić podczas obrazowania.
Uzupełnij studzienki wodoronadtlenkiem tert-butylu - induktorem ROS - i inkubuj. Induktor aktywuje oksydazę NADPH związaną z błoną i stymuluje produkcję ROS wewnątrz komórek. Komórki macierzyste, będąc aktywnymi metabolicznie, wytwarzają więcej ROS niż komórki zróżnicowane.
Dodaj sondy fluorogeniczne wrażliwe na ROS. Te lipofilowe sondy szybko wnikają do komórek i reagują z ROS, wytwarzając czerwoną fluorescencję. Potraktuj organoidy barwnikiem Hoechst, który selektywnie barwi żywe jądra komórkowe. Zobrazuj organoidy za pomocą mikroskopu konfokalnego.
Komórki organoidowe na obrzeżach z barwionymi jądrami wykazują różny stopień czerwonej fluorescencji, która jest wysoka w komórkach macierzystych wykazujących ekspresję GFP i niska w komórkach zróżnicowanych. Martwe komórki z z natury wysokimi poziomami ROS wykazują czerwoną fluorescencję w świetle.
Intensywność czerwonej fluorescencji koreluje ze zmiennymi poziomami stresu oksydacyjnego w różnych typach komórek.
Aby zobrazować stres oksydacyjny za pomocą mikroskopii konfokalnej, dodaj 1 mikrolitr roztworu podstawowego N-acetylocysteiny do odpowiednich dołków ośmiodołkowej komory mikroszkiełkowej pokrytej organoidami.
Po 1-godzinnej inkubacji dodać 1 mikrolitr roztworu podstawowego wodoronadtlenku tert-butylu do odpowiednich studzienek i inkubować przez kolejne 30 minut. Następnie dodaj 1 mikrolitr 1,25 milimolowego rozcieńczenia sondy fluorogenicznej na studzienkę, a następnie 1 mikrolitr 1,25 miligrama na mililitr roztworu Hoechsta.
Po kolejnej 30-minutowej inkubacji usuń pożywkę bez naruszania BMM i delikatnie dodaj 250 mikrolitrów ciepłego DMEM bez czerwieni fenolowej.
Zobrazuj organoidy za pomocą mikroskopu konfokalnego, wyposażonego w komorę termiczną i dopływ gazu, który wykrywa sondę fluorogenną.
Korzystając z kontroli dodatniej, ustaw intensywność lasera i czas ekspozycji na sygnał ROS i sprawdź, czy ten sygnał jest niższy w kontroli ujemnej. Następnie, za pomocą okularu, przesiewaj szkiełko, aby zidentyfikować organoidy wyrażające GFP i dostosuj intensywność lasera.
Ustaw stos z 25 mikrometrów i zdefiniuj pozycje, aby uzyskać zszyty obraz całego organoidu, aby uzyskać sekcję organoidów pokazującą jedną warstwę komórek.