Test obrazowania za pomocą sondy fluorescencyjnej: technika wizualizacji stresu oksydacyjnego w reaktywnych formach tlenu Hodowane komórki organoidów jelitowych poddane działaniu induktora

0 wyświetleń3:28 min • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy jelitowe podsumowują przypominającą jelita organizację krypty i kosmków z centralnym światłem składającym się z martwych komórek i szczątków. Światło jest wyściełane komórkami przypominającymi kosmki i pączkującymi, przypominającymi krypty wypukłościami, w których znajdują się komórki macierzyste.

Różne komórki organoidowe wytwarzają różne poziomy reaktywnych form tlenu, ROS - produktów ubocznych aktywności metabolicznej, których akumulacja prowadzi do stresu oksydacyjnego.

Aby zobrazować stres oksydacyjny w różnych komórkach, zacznij od pobrania wielodołkowej płytki zawierającej hodowane organoidy 3D w macierzy podstawnej. Organoidalne komórki macierzyste wyrażają białko zielonej fluorescencji lub białko znakowane GFP, które pomaga je odróżnić podczas obrazowania.

Uzupełnij studzienki wodoronadtlenkiem tert-butylu - induktorem ROS - i inkubuj. Induktor aktywuje oksydazę NADPH związaną z błoną i stymuluje produkcję ROS wewnątrz komórek. Komórki macierzyste, będąc aktywnymi metabolicznie, wytwarzają więcej ROS niż komórki zróżnicowane.

Dodaj sondy fluorogeniczne wrażliwe na ROS. Te lipofilowe sondy szybko wnikają do komórek i reagują z ROS, wytwarzając czerwoną fluorescencję. Potraktuj organoidy barwnikiem Hoechst, który selektywnie barwi żywe jądra komórkowe. Zobrazuj organoidy za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Komórki organoidowe na obrzeżach z barwionymi jądrami wykazują różny stopień czerwonej fluorescencji, która jest wysoka w komórkach macierzystych wykazujących ekspresję GFP i niska w komórkach zróżnicowanych. Martwe komórki z z natury wysokimi poziomami ROS wykazują czerwoną fluorescencję w świetle.

Intensywność czerwonej fluorescencji koreluje ze zmiennymi poziomami stresu oksydacyjnego w różnych typach komórek.

Aby zobrazować stres oksydacyjny za pomocą mikroskopii konfokalnej, dodaj 1 mikrolitr roztworu podstawowego N-acetylocysteiny do odpowiednich dołków ośmiodołkowej komory mikroszkiełkowej pokrytej organoidami.

Po 1-godzinnej inkubacji dodać 1 mikrolitr roztworu podstawowego wodoronadtlenku tert-butylu do odpowiednich studzienek i inkubować przez kolejne 30 minut. Następnie dodaj 1 mikrolitr 1,25 milimolowego rozcieńczenia sondy fluorogenicznej na studzienkę, a następnie 1 mikrolitr 1,25 miligrama na mililitr roztworu Hoechsta.

Po kolejnej 30-minutowej inkubacji usuń pożywkę bez naruszania BMM i delikatnie dodaj 250 mikrolitrów ciepłego DMEM bez czerwieni fenolowej.

Zobrazuj organoidy za pomocą mikroskopu konfokalnego, wyposażonego w komorę termiczną i dopływ gazu, który wykrywa sondę fluorogenną.

Korzystając z kontroli dodatniej, ustaw intensywność lasera i czas ekspozycji na sygnał ROS i sprawdź, czy ten sygnał jest niższy w kontroli ujemnej. Następnie, za pomocą okularu, przesiewaj szkiełko, aby zidentyfikować organoidy wyrażające GFP i dostosuj intensywność lasera.

Ustaw stos z 25 mikrometrów i zdefiniuj pozycje, aby uzyskać zszyty obraz całego organoidu, aby uzyskać sekcję organoidów pokazującą jedną warstwę komórek.

08:23

Test komety jako pośrednia miara ogólnoustrojowego stresu oksydacyjnego

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

12:59

Ocena uszkodzeń oksydacyjnych w pierwotnych komórkach powierzchni oka/komórkach macierzystych myszy w odpowiedzi na uszkodzenie ultrafioletem-C (UV-C)

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

04:53

Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

03:29

Test cytometrii przepływowej do ilościowego określania stresu oksydacyjnego: Test do ilościowego określania reaktywnych form tlenu w organoidach jelitowych za pomocą sond fluorogennych

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

08:16

Metoda oceny wpływu zakresu długości fal i natężeń terapii światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni na stres oksydacyjny in vitro

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

11:37

Profilowanie redoks komórkowe przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

09:33

Obrazowe podejścia do oceny toksykologicznego stresu oksydacyjnego przy użyciu genetycznie kodowanych czujników fluorogennych

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

10:12

Test oparty na fluorescencji do charakterystyki i kwantyfikacji tworzenia kropelek lipidów w organoidach jelitowych człowieka

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

06:10

Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

09:31

Analiza stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych myszy przy użyciu reaktywnej sondy fluorogenicznej wrażliwej na gatunki tlenu

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

Ostatnia aktualizacja: 1 sierpnia 2026