Test obrazowania za pomocą sondy fluorescencyjnej: technika wizualizacji stresu oksydacyjnego w reaktywnych formach tlenu Hodowane komórki organoidów jelitowych poddane działaniu induktora

Organoidy jelitowe podsumowują przypominającą jelita organizację krypty i kosmków z centralnym światłem składającym się z martwych komórek i szczątków. Światło jest wyściełane komórkami przypominającymi kosmki i pączkującymi, przypominającymi krypty wypukłościami, w których znajdują się komórki macierzyste.

Różne komórki organoidowe wytwarzają różne poziomy reaktywnych form tlenu, ROS - produktów ubocznych aktywności metabolicznej, których akumulacja prowadzi do stresu oksydacyjnego.

Aby zobrazować stres oksydacyjny w różnych komórkach, zacznij od pobrania wielodołkowej płytki zawierającej hodowane organoidy 3D w macierzy podstawnej. Organoidalne komórki macierzyste wyrażają białko zielonej fluorescencji lub białko znakowane GFP, które pomaga je odróżnić podczas obrazowania.

Uzupełnij studzienki wodoronadtlenkiem tert-butylu - induktorem ROS - i inkubuj. Induktor aktywuje oksydazę NADPH związaną z błoną i stymuluje produkcję ROS wewnątrz komórek. Komórki macierzyste, będąc aktywnymi metabolicznie, wytwarzają więcej ROS niż komórki zróżnicowane.

Dodaj sondy fluorogeniczne wrażliwe na ROS. Te lipofilowe sondy szybko wnikają do komórek i reagują z ROS, wytwarzając czerwoną fluorescenc