JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 5:00 min. • July 8th, 2025
Neuroprzekaźniki monoaminowe, endogenni przekaźniki chemiczne, przekazują sygnały przez synapsę, punkt styku między neuronami. Ściśle regulowany system neuroprzekaźników monoaminowych jest niezbędny do prawidłowego funkcjonowania neuronów.
W celu zbadania wpływu badanego leku na uwalnianie monoamin ex vivo, należy uzyskać wycinki tkanki mózgowej szczura zawierające obszar zainteresowania w schłodzonym, natlenionym buforze, zachowując żywotność tkanek.
Przenieść wycinki tkanki do studzienek na płytce wielodołkowej, z porowatymi wkładami filtracyjnymi podłączonymi do dopływu mieszaniny gazowej i zawierającymi natleniony sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy, aCSF, uzupełniony inhibitorami monoaminooksydazy. Inkubować.
Inhibitory dyfundują do komórek i dezaktywują enzymy monoaminooksydazy, zapobiegając degradacji monoamin i zwiększając ich stężenie dostępne do przechowywania i uwalniania.
Przenieść wkładki zawierające tkanki do studzienek zawierających natleniony aCSF i badany lek. Inkubować. Lek może stymulować układ neuroprzekaźników monoaminowych, zwiększając stężenie monoamin w przestrzeni pozaneuronalnej, prowadząc do ich uwolnienia z tkanki mózgowej do roztworu.
Uwolnione monoaminy przechodzą przez porowate wkładki do studzienek, oddzielając się od tkanki.
Po inkubacji usunąć wstawki zawierające plasterki tkanki. Zebrać roztwór monoaminy w probówce zawierającej rozpuszczalnik zgodny z wysokosprawną chromatografią cieczową (HPLC). Przenieś zawartość probówki do wstępnie zmontowanych jednostek filtrujących. Wirować, usuwając główne zanieczyszczenia.
Załadować otrzymany filtrat do kolumny HPLC i przeprowadzić chromatografię w celu określenia stężenia monoamin, wskazującego na wpływ badanego leku na uwalnianie monoamin.
Aby wywołać uwalnianie monoamin, przenieś próbki tkanek do każdej studzienki w specjalnie wykonanej 48-dołkowej komorze wypływowej, zawierającej od 0,5 do 1 mililitra buforu wypływu na studzienkę ze stałym, delikatnym bulgotaniem i pozwól próbkom odzyskać przez 30 do 50 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Pod koniec okresu równowagi przenieść uchwyt tkanki z tkanką mózgową do studzienek zawierających 500 mikrolitrów natlenionego buforu wypływowego ze środkiem farmakologicznym lub bez, stukając uchwytem w krawędź studzienki, aby zapobiec minimalnemu przenoszeniu buforu między studzienkami, na 20-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Pod koniec inkubacji przenieść posiadacza do nowego zestawu studzienek zawierających 500 mikrolitrów buforu wypływowego z lekiem lub bez niego i zwrócić płytkę do inkubatora hodowli komórkowych na dodatkowe 20 minut.
Podczas drugiej inkubacji przenieś roztwór z dołków z pierwszej inkubacji do probówek mikrowirówek zawierających 50 mikrolitrów 1 N kwasu nadchlorowego lub fosforowego na lodzie i oznacz probówki #1.
Pod koniec drugiej inkubacji przenieść uchwyt na tkanki do pustych studzienek z płytką na lodzie i przenieść supernatanty z drugiej inkubacji do nowych probówek do mikrowirówek zawierających 50 mikrolitrów 1 N kwasu nadchlorowego lub fosforowego na lodzie. Oznacz te rurki #2.
Po przeniesieniu wszystkich supernatantów dodaj 1 mililitr lodowatego buforu do rozwarstwiania do każdej studzienki tkanki i użyj małej pęsety, aby przenieść każdą próbkę tkanki do nowej probówki do mikrowirówki. Usunąć bufor z probówek z próbkami i przechowywać tkanki w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Następnie przenieś zebrane roztwory inkubacyjne do probówek filtracyjnych mikrowirówek w celu odwirowania i umieść filtrat na lodzie, aż do analizy HPLC.