Charakterystyka mechanizmów odporności na roślinożerców: przykład pluskwiaków piankowych na gatunkach Brachiaria

Witam, nazywam się Ush Bara i jestem entomologiem w Międzynarodowym Centrum Rolnictwa Tropikalnego (International Center for Tropical Agriculture). Ogólnym celem jest zaprezentowanie w formie wideo metody charakteryzacji mechanizmów odporności roślin żywicielskich na szkodniki, co ma wesprzeć wspólne wysiłki w ramach naszej inicjatywy hodowlanej mającej na celu zwiększenie odporności na pluskwiaki. Jako przykład posłużą trawy z rodzaju Aria.

Pluskwiaki plujące są poważnymi szkodnikami wielu ekonomicznie istotnych traw, w tym traw pastwiskowych w strefie tropikalnej, trzciny cukrowej oraz kukurydzy. W tropikach amerykańskich najważniejszym gospodarzem są pastwiska należące do rodzaju bacteria. Roślina może przeciwstawić się uszkodzeniom spowodowanym przez roślinożerców za pomocą trzech głównych mechanizmów.

Antiozis, nietolerancja, czasami nazywana brakiem preferencji, to stopień, w jakim roślina jest unikana w sytuacjach, gdy roślinożerca może wybierać rośliny. Antiozis jest zazwyczaj wykrywany w testach wyboru, w których roślinożercy mają dostęp do więcej niż jednego genotypu. Antibiosis to stopień, w jakim roślina wpływa na kondycję roślinożercy nią żywiącego się.

Wreszcie, tolerancja to stopień, w jakim roślina może znosić lub naprawiać uszkodzenia spowodowane przez HBO bez upośledzenia wzrostu i reprodukcji HBO. Zarówno antybioza, jak i tolerancja są najlepiej wykrywane w testach bez wyboru, w których hbo są ograniczone i tym samym zmuszone do żerowania na jednej roślinie. Nasze wideo zaprezentuje test bez wyboru zaprojektowany w celu oszacowania nietolerancji antybiotycznej, spit bug IV. W przypadku traw gospodarzy odporność roślin jest kluczową taktyką zarządzania populacją spit bug.

Jednakże odporność oparta na silnych antybiotykach mogłaby wywołać presję selekcyjną prowadzącą do powstania bardziej zjadliwych biotypów szkodników. Z drugiej strony, odporność oparta na tolerancji pozwoliłaby populacjom spit dog na dalszy wzrost, aż liczba osobników przerosłaby możliwości rośliny. Trwała odporność może zatem wymagać pewnego poziomu zarówno antybiotyków, jak i tolerancji.

Niniejszy protokół zademonstruje, jak oszacować względny wkład każdego z nich w odporność na pluskwiaki plujki. Genotypy Aria Aria pochodzą z banku plazmy zarodkowej Międzynarodowego Centrum Rolnictwa Tropikalnego. Rośliny są rozmnażane wegetatywnie z pojedynczych sadzonek łodyg pobranych z dojrzałych roślin wykorzystywanych jako jednostki eksperymentalne.

Sadzonki przycina się do 10 centymetrów, aby zapewnić jednolitość materiału roślinnego i zapobiec zanieczyszczeniu patogenami roślinnymi. Sadzonki myje się w 3% roztworze podchlorynu sodu przez dwie minuty, a następnie dokładnie płucze wodą z kranu. Każdą sadzonkę sadzi się w około 36 gramach sterylnej gleby w rurce PVC uszczelnionej od dołu fragmentem kubka styropianowego i zamkniętej tuleją PVC.

Sadzonka jest utrzymywana w miejscu za pomocą pierścienia z pianki umieszczonego w centralnym otworze tulei. Rośliny są nawożone i wymagają podlewania w celu utrzymania odpowiedniej wilgotności gleby. Rośliny rosną przez jeden miesiąc przed wystawieniem na działanie owadów, co pozwala na rozwój korzeni powierzchniowych, które służą jako miejsca żerowania dla organizmów żywiących się korzeniami.

Odwrócenie roślin w systemie NIMS w bagnie ślinowym na osiem dni przed infestacją dodatkowo stymuluje wzrost korzeni powierzchownych, częściowo niwelując wrodzone różnice w architekturze korzeni. Krok ten wymaga sztucznego źródła światła, które zapewniamy przez 24 godziny na dobę. Rośliny z niewielką ilością lub brakiem korzeni powierzchownych.

Po tej inwersji rośliny poddane działaniu są wykluczane z eksperymentu. 30 dni po posadzeniu, każda roślina jest zarażana na powierzchni gleby sześcioma dojrzałymi jajami pozyskanymi z naszych kolonii płużnikowatych. W celu założenia tych kolonii, dorosłe osobniki płużnikowatych są zbierane z pola, identyfikowane gatunkowo i wprowadzane do klatek, w których zapewnia się im liście podatnej rośliny z rodzaju Aria do żerowania. Samice składają jaja w glebie znajdującej się w płytkiej tacy, umieszczonej na dnie klatek.

Po kilku dniach glebę zawiesza się w wodzie i przeciera przez szereg sit w celu zebrania jaj. Zawieszenie przetworzonego materiału w 30% roztworze soli powoduje wypłynięcie dojrzałych jaj, podczas gdy jaja niedojrzałe pozostają na pozostałościach materii organicznej. Aby zapobiec kontaminacji patogenami owadów, jaja są dezynfekowane w 0,5% roztworze podchlorynu sodu przez pięć minut, a następnie płukane wodą destylowaną; do infestacji wybiera się wyłącznie dojrzałe jaja tuż przed wykluciem.

Można je zidentyfikować po obecności dwóch czerwonych kropek w części przedniej, odpowiadających oczom owada, różowych zaznaczeń w części tylnej, odpowiadających odwłokowi owada, oraz w pełni rozwiniętym zarodkowi. Pomyślny wylęg potwierdza się cztery dni później, w którym momencie każde niewylęgłe jajo zostaje zastąpione noworodkowym blokiem plwocin.

Z naszego testu kolonii. Rośliny są rozmieszczone w zrandomizowanym układzie bloków kompletnych z sześcioma powtórzeniami. Eksperyment jest oceniany około 30 dni po infestacji.

Ocena uszkodzeń roślin pozwala na oszacowanie tolerancji. Z kolei ocena przeżywalności owadów pozwala na oszacowanie skuteczności antybiotyków. Stopień uszkodzeń ocenia się w wizualnej skali od jednego do pięciu, gdzie jeden oznacza brak widocznych uszkodzeń, a pięć oznacza śmierć rośliny.

Z kolei przeżywalność ocenia się poprzez zliczanie owadów, które dotarły do swojego końcowego stadium larwalnego lub stadium imago. Aby skategoryzować mechanizmy oporności, użyteczne jest przedstawienie wyników na wykresie, gdzie na osi X naniesiono przeżywalność owadów, a na osi Y uszkodzenia roślin. Antybiotyczność wzrasta wraz z przesunięciem w lewo.

Z drugiej strony, tolerancja wzrasta w miarę przesuwania się z góry na dół. Rośliny uznajemy za odporne, jeśli odpowiedź na żerowanie owadów znajduje się w dolnej połowie tego wykresu. Jeśli odpowiedź ta wypada w lewym kwadrancie, dominującym mechanizmem odporności są antybiotyki.

Jeśli odpowiedź znajduje się w prawym kwadrancie, dominującym mechanizmem odporności jest tolerancja. Oto reprezentatywna próbka naszych danych z przesiewu. Punkty u góry reprezentują rośliny podatne.

Punkty w dolnym lewym kwadrancie reprezentują rośliny wykazujące odporność poprzez antybiozę. Punkty w dolnym prawym kwadrancie reprezentują rośliny wykazujące odporność poprzez tolerancję. Właśnie obejrzeliśmy demonstrację testu bez wyboru (no choice assay), służącego do oszacowania względnego udziału antybiozy oraz tolerancji w mechanizmie odporności roślin.

Jako przykład wykorzystujemy odporność na pluskwiaki plujące u Aria, jednak przedstawione zasady powinny mieć zastosowanie również do innych układów. Mamy nadzieję, że nasz film okaże się pomocny w Państwa własnych badaniach. Powodzenia.