JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:52 min. • July 8th, 2025
Estrogeny to hormony steroidowe, które działają jako cząsteczki sygnalizacji endokrynnej i wiążą się z receptorami jądrowymi - receptorami estrogenowymi beta, tworząc kompleksy receptorów estrogen-beta.
Te kompleksy ligand-receptor dimeryzują i tworzą homodimery w cytoplazmie komórki. Powstały w ten sposób homodimer dostaje się do jądra, wiąże się z elementem odpowiedzi estrogenowej, ERE – specyficzną sekwencją DNA w promotorze docelowego genu – i inicjuje transkrypcję.
Aby określić aktywność estrogenową fitoestrogenów – metabolitów wtórnych pochodzenia roślinnego, które naśladują funkcję estrogenu – należy rozpocząć od wielodołkowej płytki zawierającej komórki reporterowe zawieszone w odpowiednim podłożu.
Komórki reporterowe są zaprojektowane tak, aby wykazywały nadekspresję receptorów estrogenowych beta i transfekowały genem lucyferazy połączonym z promotorem URE. Dodać roztwór próbki zawierający fitoestrogeny i inkubować.
Podczas inkubacji fitoestrogen wiąże się z receptorami estrogenowymi, beta — ulegającymi ekspresji w komórkach reporterowych. Po związaniu kompleksy fitoestrogen-receptor dimeryzują i przemieszczają się do jądra.
Wewnątrz jądra dimeryzowany kompleks wiąże się z ERE. Wiązanie inicjuje transkrypcję genu lucyferazy, wytwarzając enzym lucyferazy. Następnie usuń pożywkę i dodaj odczynnik zawierający substrat dla lucyferazy. Inkubować, aby umożliwić ekspresji enzymu lucyferazy utlenienie substratu i wytworzenie luminescencji.
Zmierz luminescencję, która potwierdza aktywność estrogenową związku w próbce.
Odwiruj próbki. Następnie dodaj 4 mikrolitry każdej próbki do 496 mikrolitrów pożywki do przesiewania związków, aby uzyskać 0,8% roztwór DMSO.
Zdezynfekuj zewnętrzną powierzchnię wstępnie podgrzanej probówki z pożywką do odzyskiwania komórek 70% etanolem i przenieś 10 mililitrów pożywki do probówki z zamrożonymi komórkami reporterowymi w celu ich rozmrożenia. Zamknij probówkę komórek reporterowych i umieść ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 5 do 10 minut.
Po pobraniu komórek z łaźni wodnej należy delikatnie odwrócić rurkę kilka razy, aby rozbić agregaty komórek i wytworzyć jednorodną zawiesinę. Następnie oczyść powierzchnię rurki 70% etanolem.
Za pomocą pipety wielokanałowej dozuj 100 mikrolitrów zawiesiny komórki reporterowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Następnie należy wlać 100 mikrolitrów próbek w trzech egzemplarzach do odpowiednich studzienek. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 22 do 24 godzin.
Tuż przed zakończeniem inkubacji na płytce należy wyjąć z lodówki substrat detekcyjny i bufor detekcyjny i umieścić je w miejscu o słabym oświetleniu, aż osiągną równowagę z temperaturą pokojową. Następnie delikatnie odwróć każdą probówkę, aby wymieszać roztwory.
Bezpośrednio przed zakończeniem inkubacji płytki wlej całą zawartość buforu detekcyjnego do probówki z substratem do detekcji, aby utworzyć odczynnik do wykrywania lucyferazy. Delikatnie wymieszaj tubkę, aby nie wytworzyć piany.
Wyrzuć zawartość płytki z próbką do odpowiedniego pojemnika na odpady i delikatnie postukaj nią w czysty, chłonny ręcznik papierowy, aby usunąć ostatnie kropelki z dołków. Dodać 100 mikrolitrów odczynnika do wykrywania lucyferazy do każdej studzienki i pozostawić płytkę testową w temperaturze pokojowej na 15 minut. Następnie określ ilościowo luminescencję za pomocą luminometru z 96-dołkowym odczytem płytki.