Name: Ex vivo Obrazowanie limfocytów T w wycinkach mysich węzłów chłonnych za pomocą mikroskopu szerokokątnego i konfokalnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę obrazowania limfocytów T w wycinkach węzłów chłonnych myszy za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej. Technika umożliwia analizę migracji komórek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr. Alainowi Trautmannowi, który zachęcił nas do wykonania przekrojów węzłów chłonnych. Praca ta była częściowo finansowana z grantów przyznanych przez Ligue Nationale Contre le Cancer, Fondation pour la Recherche Médicale en France oraz Association pour la recherche sur le Cancer.

1. Przygotowanie skrawków z węzłów chłonnych
<ol>
 <li>Przygotować 4% roztwór niskotopliwej agarozy do zatapiania. Rozpuścić agarozę w PBS i podgrzać roztwór w kuchence mikrofalowej. Po całkowitym rozpuszczeniu agarozy utrzymywać roztwór w temperaturze 37°C do momentu użycia.</li>
 <li>Przygotować 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej. Do każdej dołki dodać 1,1 ml kompletnej pożywki RPMI i włożyć wkład do hodowli organotypowej. Płytkę 6-dołkową przechowywać w temperaturze 4°C do czasu przeniesienia skrawków.</li>
 <li>Umieścić stalowe podkładki o średnicy wewnętrznej 4 mm w plastikowym naczyniu wypełnionym kompletną pożywką RPMI. Podkładki posłużą w dalszej kolejności do zagęszczenia komórek na skrawku wyciętym w wibrotomie.</li>
 <li>Uśmiercić mysz zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Ostrożnie usunąć obwodowe węzły chłonne z otaczających tkanek i umieścić je w plastikowym naczyniu zawierającym lodowaty PBS. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić struktury węzła chłonnego, ponieważ organy te są bardzo miękkie.</li>
 <li>Wlać 4% żel agarozowy do 35-milimetrowego plastikowego naczynia i delikatnie przenieść węzły do żelu. Pozostawić żel agarozowy na lodzie przez 5 min w celu jego stwardnienia.</li>
 <li>Wyjąć blok z naczynia i przyciąć agar tak, aby wokół każdego węzła chłonnego pozostało 3-5 mm żelu.</li>
 <li>Przymocować zatopione węzły do dysku na próbki wibrotomie za pomocą nietoksycznego kleju tkankowego. Zamontować dysk w tacku wypełnionym lodowatym PBS.</li>
 <li>Wyciąć skrawki tkanki zatopionej w agarze o grubości 320 μm, ustawiając prędkość wibrotomu na zakres niski (0,3 mm/s) oraz częstotliwość wibracji na zakres średni (1,5 mm).</li>
 <li>Ostrożnie przenosić skrawki węzła chłonnego bezpośrednio po wycięciu na wkładki do hodowli organotypowej za pomocą precyzyjnej pincety. Na każdą wkładkę położyć 3 skrawki. Należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ skrawki mogą zostać łatwo uszkodzone. Typowy obwodowy węzeł chłonny daje 5 skrawków przy cięciu o grubości 320 μm. Odrzucić pierwszy i ostatni skrawki, ponieważ zawierają one jedynie tkankę powierzchniową.</li>
 <li>Na każdym pojedynczym skrawku umieścić stalową podkładkę. Upewnić się, że podkładki są dobrze rozmieszczone na agarozie otaczającej tkankę.</li>
 <li>Inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37°C w wilgotnej inkubatorze z 5% CO2 do momentu wysiania limfocytów T.</li>
</ol>
2. Izolowanie limfocytów T z węzłów chłonnych myszy
<ol>
<li>Wyizoluj limfocyty T zgodnie z wcześniej opublikowanym artykułem JoVE 3.</li>
<li>Należy niezwłocznie wykorzystać limfocyty T i przejść do następnej sekcji. W przeciwnym razie limfocyty można hodować przez noc w pełnej pożywce RPMI uzupełnionej o 10 ng/ml IL-7. </li>
</ol>
3. Znakowanie wyizolowanych limfocytów T
<ol>
<li>Przemyć komórki w HBSS. Resuspendować je w tym samym buforze w stężeniu 10 x 106 na ml.</li>
<li>Dodać taką samą objętość buforu HBSS zawierającego 1 μM Cell Tracker Green CMFDA, zapewniający stężenie końcowe wynoszące 0.5 μM.</li>
<li>Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 37°C przez 5 min. Przemyć komórki dwukrotnie pełnym medium RPMI. </li>
<li>Resuspendować komórki do końcowego stężenia 10 x 106 na ml w pełnym medium RPMI. Te znakowane komórki zostaną wysiane na skrawki.</li>
</ol>
Można stosować również inne barwniki fluorescencyjne niż CMFDA, jednak należy pamiętać, że cząsteczki te mogą być toksyczne powyżej określonych stężeń.
4. Wysiewanie znakowanych limfocytów T na plastry węzłów chłonnych
<ol>
<li>Za pomocą pipety usuń nadmiar pożywki znajdującej się w wewnętrznej części przemywacza. Nie dopuść do wyschnięcia tkanki; wykonaj ten krok szybko.</li>
<li>Ostrożnie nanieś do wewnętrznej części przemywacza od 10 do 20 μl zawiesiny oznakowanych limfocytów T, co odpowiada 1 do 2 x 105 komórek. Należy uważać, aby końcówka pipety nie dotknęła tkanki. Upewnij się, że kropla zawiesiny komórkowej pozostała na swoim miejscu.</li>
<li>Umieść skrawki z komórkami w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2 na co najmniej 30 min, aby umożliwić migrację limfocytów do tkanki.</li>
</ol>
5. Obrazowanie limfocytów T w przekrojach węzłów chłonnych
W niniejszym artykule wideo obrazujemy fluorescencyjne limfocyty T w przekrojach węzłów chłonnych, korzystając z odwróconego mikroskopu szerokopolowego oraz pionowego mikroskopu konfokalnego.
<ol>
 <li>Ustaw temperaturę na 37°C. Nasze mikroskopy są wyposażone w komory z kontrolą temperatury. </li>
 <li>Zainstaluj system perfuzyjny umożliwiający ciągłą perfuzję skrawka węzła chłonnego natlenionym (5% CO2, 95 % O2) ośrodkiem RPMI bez czerwieni fenolowej. W naszym systemie perfundowane medium wpływa do komory obrazowania z jednej strony siłą grawitacji. Medium jest odsysane pompą podłączoną do kolby na odpady. Ustaw szybkość przepływu medium na 1 ml/min.</li>
 <li>Za pomocą precyzyjnej pęsety delikatnie wyjmij skrawek z płytki 6-dołkowej i zanurz preparat na kilka sekund w ogrzanym, natlenionym ośrodku RPMI, aby usunąć komórki fluorescencyjne, które nie przeniknęły do tkanki.</li>
</ol> 
Obrazowanie limfocytów T przy użyciu odwróconego mikroskopu w polu szerokim
<ol start="4"> 
<li>Umieść skrawek odwrócony do góry dnem w specjalnie wykonanej komorze obrazującej, która składa się z nici nylonowych przyklejonych do wewnętrznej części naczynia z szklanym dnem. W tej komorze nici nylonowe unoszą skrawek nad szkło i umożliwiają dyfuzję natlenionego roztworu do tkanki. Jest to niezbędne, ponieważ migracja limfocytów T w węzłach chłonnych jest silnie zależna od tlenu. Zabeziecz skrawek, nakładając na niego stalową podkładkę. W takich warunkach skrawek znajduje się kilka mikronów nad dnem naczynia, co ułatwia wymianę roztworu perfuzyjnego.</li>
<li>Aby uchwycić szerokie pole widzenia (80 x 80 μm, co stanowi około jednej trzeciej powierzchni skrawka węzła), wykonaj obrazy przy użyciu suchego obiektywu 10x. Ustaliliśmy, że obiektyw 10x Nikon S fluor 0.5 NA był najbardziej odpowiedni dla naszych analiz.</li>
</ol>
Typowy eksperyment obrazowania time-lapse obejmuje rejestrację 5 płaszczyzn optycznych, które w wymiarze osiowym (z) pokrywają łącznie głębokość 50 μm. Fluorescencyjne limfocyty T są zazwyczaj obrazowane w odstępach od 10 do 30 sekund w ciągu 10 do 20 min.
Obrazowanie limfocytów T za pomocą konfokalnego mikroskopu pionowego
Mikroskop konfokalny wykorzystany w tym protokole to Leica SP5 wyposażony w obiektyw imersyjny wodny 20x (Olympus, 20x/0.95 NA). 
<ol start="6">
<li>Przymocuj skrawek do stolika obrazującego mikroskopu. Uwaga: Zazwyczaj kładziemy na preparacie podkładkę, aby go unieruchomić.</li>
<li>Ustaw sesję obrazowania, zbierając serię obrazów wzdłuż osi z. Aby obrazować limfocyty T w nienaruszonej strukturze tkanki, pozycję początkową zazwyczaj ustawia się od 5 do 10 μm poniżej pierwszego oznakowanego limfocytu T.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Postępując zgodnie z tym protokołem wideo, należy spodziewać się wizualizacji licznej grupy fluorescencyjnych limfocytów T nagromadzonych w strefie T węzła, co jest zjawiskiem występującym normalnie w tym konkretnym środowisku in vivo (Rycina 1). W szczególności limfocyty T powinny być wykluczone ze stref limfocytów B, które zazwyczaj znajdują się bezpośrednio pod torebką. Pomyślny eksperyment doprowadzi również do rekrutacji limfocytów T do tkanki (Rycina 2), wykazujących wysoką ruchomość (Rycina 3), co jest zgodne z opublikowanymi wynikami uzyskanymi w nienaruszonych węzłach chłonnych 4. Średnio średnia prędkość poszczególnych limfocytów T w obrębie skrawków powinna wynosić blisko 10 μm/min (Rycina 4). 
<img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig1.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające struktury komórkowe; góra, fluorescencja zielona; dół, niebarwione." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rycina 1. Akumulacja limfocytów T w przekroju węzła chłonnego. Do plastra węzła chłonnego dodano znakowane fluorescencyjnie limfocyty T (CMFDA, zielony) na 30 minut przed akwizycją obrazu (zdjęcie górne). Obraz stanowi projekcję maksymalną 5 obrazów obejmujących 50 μm w kierunku osi z. Obraz w jasnym polu przedstawiono na dole. Obrazy zarejestrowano przy użyciu mikroskopu szerokopolowego. 
<img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig2.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające rozkład cząstek przy głębokościach ogniskowania 0 μm i -40 μm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rycina 2. Limfocyty T są rekrutowane do przekroju węzła chłonnego. T-limfocyty znakowane fluorescencyjnie (CMFDA, zielony) dodano do przekroju węzła chłonnego 30 minut przed wykonaniem obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego. Obrazy zarejestrowano na powierzchni cięcia (górne zdjęcie) oraz 40 μm poniżej (dolne zdjęcie). 
<img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig3.jpg" alt="Schemat śledzenia cząstek; fluorescencyjne trajektorie w strefie B; pasek skali 50 μm, długość ścieżki zakodowana kolorystycznie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rycina 3. Limfocyty T wykazują wysoką ruchliwość w przekroju węzła chłonnego. Przez 12 min obrazowano znakowane fluorescencyjnie limfocyty T przy użyciu mikroskopu szerokopolowego. Trajektorie poszczególnych limfocytów T przedstawiono jako ścieżki zakodowane kolorystycznie, gdzie przejście od koloru niebieskiego (komórki o niskiej ruchliwości) do czerwonego (komórki o wysokiej ruchliwości) reprezentuje zwiększone przemieszczenie. Ścieżki obliczono przy użyciu oprogramowania Imaris. Biała linia wyznacza krawędź węzła, natomiast przerywany owal odgranicza domniemaną strefę limfocytów B. 
<img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig4.jpg" alt="Wykres rozkładu prędkości limfocytów T; średnia 8,9 µm/min; analiza ruchliwości komórek odpornościowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rycina 4. W obrębie przekroju węzła chłonnego prędkość limfocytów T jest bliska 10 μm/minPrędkości obliczono za pomocą oprogramowania Imaris na podstawie ścieżek przedstawionych na rysunku 3.

<ol><li>Asperti-Boursin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner.</a> J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).</li>
<li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1869 (2002).</li>
<li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-986 (2009).</li>
<li>Gollmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL21+mediates+CD4%2B+T-cell+costimulation+via+a+DOCK2%2FRac-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway.</a> Blood. 114, 580-580 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Opisaliśmy prostą, szybką i niezawodną technikę przygotowywania przekrojów węzłów chłonnych, które są wykorzystywane do badania zachowania wprowadzonych limfocytów T. W ostatnich latach metoda ta była z sukcesem stosowana w przypadku przekrojów grasicy i węzłów chłonnych w celu zidentyfikowania czynników zewnątrzkomórkowych kontrolujących pozycjonowanie i ruchliwość limfocytów T 1,5. Wykorzystywano ją również do pomiaru odpowiedzi Ca2+ w tymocytach podczas selekcji pozytywnej oraz w limfocytach T po rozpoznaniu antygenu 2,6. Test z nałożonymi przekrojami (overlay slice assay) wykazuje zalety i ograniczenia, które zasługują na omówienie. Warto zauważyć, że system ten umożliwia dostęp do tkanki, co jest przydatne w przypadku konieczności farmakologicznego manipulowania przekrojami w celu ingerencji w molekularną kontrolę migracji komórek. Po obrazowaniu przekroje mogą zostać poddane immunohistochemii, aby zebrać dalsze informacje o obrazowanych strukturach. Ponadto obserwacje można prowadzić przy użyciu tradycyjnego fluorescencyjnego mikroskopu szerokopolowego. Chociaż rozdzielczość nie jest tak dobra jak w przypadku mikroskopu konfokalnego lub dwufotonowego, a fototoksyczność jest w zasadzie silniejsza w mikroskopii jednofotonowej niż dwufotonowej, metoda ta ma zalety w postaci prostoty, niższych kosztów i szerszego wyboru długości fal wzbudzenia.
Obrazowanie limfocytów T w nienaruszonym węźle chłonnym wymaga dożylnego wstrzyknięcia znakowanych limfocytów, które następnie migrują do organów limfatycznych. Jak wykazaliśmy wcześniej 1, metoda analizy na skrawkach (slice assay) jest w pełni kompatybilna z eksperymentami z transferem adoptywnym. Jednak czas potrzebny na migrację limfocytów T do węzłów chłonnych może utrudnić stosowanie barwników fluorescencyjnych, które mają tendencję do wyciekania z komórek wraz z upływem czasu. Dotyczy to przypadku barwnika Ca2+ fura-2. Dzięki szybkiej rekrutacji (&lt; 30 min) limfocytów T do tkanki, analiza na skrawkach stwarza możliwość wykorzystania takich barwników. Wreszcie, metoda ta ma ogromną zaletę w postaci możliwości analizy funkcji limfocytów T w kilku utrzymanych przy życiu tkankach ludzkich.
Niniejszy system eksperymentalny posiada również ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę. Uszkodzenia związane z krojeniem mogą wpływać na funkcjonowanie limfocytów T, zwłaszcza w obszarze powierzchownym tkanki, w pobliżu powierzchni cięcia. Aby ocenić śmierć komórek wewnątrz skrawka, zastosowano fluorescencyjny barwnik SYTOX green, który przenika do komórek z uszkodzoną błoną plazmatyczną. Nasze eksperymenty wykazały, że około 20% wszystkich komórek węzła, zlokalizowanych głównie w powierzchownym obszarze tkanki, zostało znakowanych tym barwnikiem jądrowym. Inną potencjalną kwestią w tym badaniu jest zdolność skrawków do zatrzymywania istotnych czynników rozpuszczalnych, w tym chemokin. Chociaż nie mamy przesłanek, aby dane zostały w ten sposób zaburzone, ponieważ limfocyty T wykazują dobrą ruchliwość wewnątrz skrawka, chcielibyśmy podkreślić znaczenie obrazowania limfocytów T w zdrowych obszarach położonych kilkadziesiąt mikronów od powierzchni cięcia. O ile można to wykonać za pomocą tradycyjnych mikroskopów (pola szerokiego lub konfokalnych), jak w niniejszym protokole, prawdopodobne jest, że przygotowanie skrawka węzła chłonnego w połączeniu z obrazowaniem dwufotonowym zwiększy rozdzielczość przestrzenną w głąb i zmniejszy fototoksyczność.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop konfokalny </td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Wibratom </td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta precyzyjna </td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14142</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki hodowlane 30 mm </td><td>EMD Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>RPMI </td><td>Invitrogen</td><td>61870010</td><td>Pełne medium RPMI przygotowuje się poprzez dodanie 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy cielęcej oraz penicyliny i streptomycyny.</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Zrównoważony roztwór soli (HBSS) </td><td>Invitrogen</td><td>14170088</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze żelowania, typ VII-A </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylan butylu, Vetbond</td><td>3M</td><td>1469</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki ze stali nierdzewnej, średnica wewnętrzna 4 mm </td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker green CMFDA </td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie ex vivo limfocytów t w przekrojach węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem mikroskopii szerokopolowej i konfokalnej

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Naiwne limfocyty T stale migrują do wtórnych narządów limfatycznych, w tym do obwodowych węzłów chłonnych, w celu wykrycia rzadko ekspresywnych antygenów. Migracja limfocytów T do węzłów chłonnych jest złożonym procesem, w którym uczestniczą czynniki komórkowe i chemiczne, w tym chemokiny. W ostatnim czasie zastosowanie mikroskopii dwufotonowej umożliwiło śledzenie limfocytów T w nienaruszonych węzłach chłonnych oraz uzyskanie ilościowych informacji na temat ich zachowania i oddziaływań z innymi komórkami. Choć system in vivo oferuje oczywiste zalety, podejście to wymaga złożonej i kosztownej aparatury oraz zapewnia ograniczony dostęp do tkanki. Aby przeanalizować zachowanie limfocytów T w mysich węzłach chłonnych, opracowaliśmy test na skrawkach tkankowych 
1, pierwotnie opracowany przez neurobiologów, a niedawno zaadaptowany do badań nad mysim grasicą 2. W tej technice limfocyty T znakowane fluorescencyjnie są nakładane na świeżo przygotowany skrawek węzła chłonnego. W niniejszym artykule wideo lokalizacja i migracja limfocytów T do tkanki są analizowane w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopu szerokopolowego oraz konfokalnego. Technika ta, uzupełniająca mikroskopię dwufotonową in vivo, stanowi skuteczną metodę obrazowania limfocytów T w ich naturalnym środowisku oraz wyjaśniania mechanizmów leżących u podstaw migracji limfocytów T.

Niniejszy protokół opisuje metodę obrazowania fluorescencyjnych limfocytów T wprowadzonych do przekrojów węzła chłonnego. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T w czasie rzeczywistym przy użyciu tradycyjnych mikroskopów fluorescencyjnych w szerokim polu lub mikroskopów konfokalnych.

Obrazowanie ex vivo limfocytów T w przekrojach węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem mikroskopii szerokopolowej i konfokalnej

Naiwne limfocy T nieustannie migrują do wtórnych narządów limfatycznych, w tym do obwodowych węzłów chłonnych, aby wykrywać rzadko ekspresowane antygeny. Migracja...

Ogólnym celem tej procedury jest obrazowanie fluorescencyjnych limfocytów T w przekrojach węzła chłonnego przy użyciu mikroskopii szerokopolowej i konfokalnej. W pierwszej kolejności odbywa się to poprzez usunięcie węzła chłonnego myszy i zatopienie go w agarozie o niskiej temperaturze topnienia. Następnie węzeł jest cięty na sekcje o grubości 320 micron za pomocą wibratomu.Następnie fluorescencyjnie barwione limfocyty T nanosi się na przekrój węzła chłonnego. Na koniec limfocyty T, które zinfiltrowały przekrój, wizualizuje się za pomocą mikroskopii szerokopolowej oraz konfokalnej. W rezultacie można uzyskać obrazy statyczne i wideo, które pokazują, w jaki sposób limfocyty T są rekrutowane do węzła chłonnego oraz jaki rodzaj zachowań motorycznych wykazują w obrębie tkanki limfatycznej.Główną zaletą tych technik stosowanych w przypadku istniejącego metalu, takich jak fotomikroskopia i nienaruszone organy, jest możliwość wizualizacji limfocytów T w układzie trójwymiarowym przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu w polu jasnym. Co więcej, proste przygotowania umożliwiają dostęp do tkanki. Należy rozpocząć od przygotowania 4% roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia poprzez rozcieńczenie agarozy w PBS i podgrzanie otrzymanej mieszaniny w kuchence mikrofalowej po całkowitym rozpuszczeniu agarozy.Przechowywać roztwór w temperaturze 37 °C do momentu użycia. Następnie wypełnić plastikową szalkę pożywką RPMI Complete. Do szalki umieścić stalowe podkładki o średnicy wewnętrznej 4 mm.Napełnij kolejny pojemnik lodowatym PBS, a następnie dodaj około 1,1 ml RPMI. Uzupełnij pożywkę hodowlaną w każdej studience sześciostudzienkowej płytki do hodowli tkanek. Włóż filtr organotypowy do każdej studzienki płytki sześciostudzienkowej i umieść płytkę w temperaturze 4 °C.Ostrożnie usuń obwodowe węzły chłonne z otaczających je tkanek u uśpionej myszy. Przeprowadź sekcję węzłów chłonnych z dużą starannością, ponieważ są one bardzo miękkie. Niezwykle ważne jest usunięcie całej tkanki tłuszczowej, gdyż jest ona bardzo toksyczna dla komórek.Umieść węzły chłonne w plastikowej szalce zawierającej schłodzony na lodzie PBS. Następnie wlej 4% żel agarowy do 35-milimetrowej plastikowej szalki i delikatnie przenieś węzły do żelu. Umieść agar na lodzie na pięć minut, aby stwardniał. Po stwardnieniu agaru wyjmij blok z szalki i przytnij go, pozostawiając około 3-5 mm żelu wokół każdego węzła chłonnego.Następnie za pomocą nietoksycznego kleju przymocuj węzły zatopione w agarze do dysku z próbką w urządzeniu viome. Umieść dysk z próbką w wysuwanym podajniku urządzenia viome i wypełnij go lodowatym roztworem PBS. Ustaw prędkość urządzenia viome na niski zakres, a częstotliwość wibracji na zakres średni, i przetnij tkankę zatopioną w agarze na plastry o grubości 320 micron.Odrzuć pierwszy plaster, ponieważ zawiera on jedynie tkankę powierzchowną, a następnie za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie przenoś plastry węzła chłonnego do wkładów do hodowli organotypowej w miarę ich wycinania. Na każdym poszczególnym plastrze umieść stalowe podkładki, upewniając się, że otaczają one tkankę węzła chłonnego, a nie ją zakrywają. Następnie inkubuj płytkę hodowlaną z plastrami węzła chłonnego w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% carbon dioxide.Podczas przygotowywania limfocytów T do tego etapu, należy wykorzystać limfocyty T hodowane przez noc w obecności IL-7, które zostały wyizolowane za pomocą selekcji koralikami CD4+ przy użyciu zestawu Miltenyi Biotec MACS, zgodnie z metodą opisaną w wcześniej opublikowanym artykule JoVE autorstwa Matthew i Callaghana. Przemyć limfocyty T w HBSS przez 5 minut przy 300 ×g w temperaturze 20 °C. Resuspender je w świeżym HBSS do stężenia 10 × 10⁶ komórek/ml.Następnie do probówki z HBSS należy dodać 1 µM cell tracker green C-M-F-D-A i połączyć ten roztwór z zawiesiną komórek, aby uzyskać końcowe stężenie barwnika 0,5 µM. Zawiesinę komórek należy inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 °C. Po dwukrotnym przemyciu komórek w pełnej pożywce RPMI przez pięć minut przy 300 ×g i 20 °C, należy ponownie zawiesić oznakowane limfocyty T w końcowym stężeniu 10 × 10⁶ komórek/ml.Wyjmij plastry węzłów chłonnych z inkubatora w świeżej, kompletnej pożywce hodowlanej RPMI. Za pomocą pipety usuń nadmiar pożywki znajdujący się w centrum myjki, uważając, aby nie dotknąć tkanki. Końcówką pipety delikatnie nanieś od 10 do 20 µL oznakowanych limfocytów T do centrum myjki.Należy upewnić się, że kropla zawiesiny komórek pozostaje na swoim miejscu. Inkubować skrawki i limfocyty T przez co najmniej 30 minut, aby umożliwić migrację limfocytów do tkanki. Przed rozpoczęciem obrazowania ustawić komorę kontroli temperatury w mikroskopie na 37 °C.Napełnij system perfuzyjny, aby umożliwić ciągłą perfuzję skrawka węzła chłonnego natlenionym podłożem RPMI bez czerwieni fenolowej; w tym samym czasie napełnij i ogrzej małą plastikową szalkę natlenionym podłożem RPMI. W systemie przedstawionym na filmie perfundowane medium wpływa do komory obrazowania z jednej strony siłą grawitacji. Medium jest odsysane za pomocą pompy podłączonej do pojemnika na odpady.Za pomocą precyzyjnej pęsety wyjmij z inkubatora plastry węzłów chłonnych infiltrowanych przez limfocyty T. Ostrożnie przenieś plaster węzła chłonnego z płytki sześciodołkowej. Zanurz plaster na kilka sekund w ogrzanym i natlenionym medium RPMI, aby wypłukać komórki fluorescencyjne, które nie zinfiltrowały tkanki.Następnie ułożone świeżo wypłukane cięcie odwrócone stroną górną do dołu w komorze obrazowania. Nitki nylonowe unoszą cięcie nad szkło, umożliwiając dyfuzję natlenionego roztworu do tkanki. Jest to niezbędne, ponieważ migracja limfocytów T w węzłach chłonnych jest silnie uzależniona od tlenu.Następnie unieruchom przekrój, kładąc na nim stalową podkładkę, aby uzyskać szerokie pole widzenia. Wykonaj zdjęcia, korzystając z suchego obiektywu 10x. Przenieś świeżo wypłukany przekrój węzła chłonnego stroną górną do plastikowej szalki.Na preparacie umieść podkładkę, aby go unieruchomić. Plastry są teraz gotowe do obrazowania. Zainstaluj preparat na stoliku pionowego mikroskopu konfokalnego i ustaw ostrość za pomocą obiektywu 20x.Następnie rozpocznij sesję obrazowania i przystąp do akwizycji.C-M-F-D-A. Jak widać tutaj, znakowane na zielono limfocyty T dodano do przekroju węzła chłonnego na 30 minut przed akwizycją obrazu. Obraz ten stanowi maksymalną projekcję pięciu obrazów obejmujących 50 µm w kierunku Z, zarejestrowanych tutaj za pomocą mikroskopu szerzenia.Ten sam rysunek można zobaczyć jako obraz w polu jasnym w tym filmie. Zielone fluorescencyjne limfocyty T, które przeniknęły do przekroju węzła chłonnego, obrazowane za pomocą mikroskopu szerokopolowego przez dziewięć minut. Animacja przedstawia projekcję Z o grubości 50 micron.Zwróć uwagę na aktywną migrację limfocytów T w obrębie skrawka. Trajektorie poszczególnych limfocytów T z tego samego pola widzenia mikroskopu są tutaj przedstawione w formie kolorowych śladów, gdzie kolor reprezentuje zwiększające się przemieszczenie: od niebieskiego dla komórek o niskiej ruchliwości do czerwonego dla komórek o wysokiej ruchliwości. Ślady zostały obliczone przy użyciu programu Mars.Biała linia wskazuje krawędź węzła, natomiast przerywane owale wyznaczają domniemane strefy komórek B. W tym przypadku komórki T dodane do przekroju węzła chłonnego były obrazowane przez 10 minut za pomocą mikroskopu konfokalnego. Animacja przedstawia projekcję Z o grubości 50 mikronów.Tak, technikę tę można zaadaptować do innych rodzajów tkanek. Co ciekawe, metoda ta stanowi jedyny sposób na badanie mechanizmów leżących u podstaw migracji i lokalizacji limfocytów T w ludzkich nowotworach, na przykład.

ex-vivo-imaging-t-cells-murine-lymph-node-slices-with-widefield

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ex vivo Obrazowanie komórek T w krojach węzłów chłonnych myszy za pomocą mikroskopu szerokiego pola i mikroskopu konfokalnego

Obrazowanie dwufotonowe pozwoliło na odkrycie ruchomości limfocytów oraz oddziaływań komórkowych w obrębie węzła chłonnego w warunkach podstawowych oraz podczas odpowiedzi immunologicznej 1. W niniejszej pracy demonstrujemy adoptywny transfer limfocytów T, izolację węzłów chłonnych oraz obrazowanie ruchomości limfocytów T CD4+ w wypreparowanym węźle chłonnym.

Disekcja i obrazowanie dwufotonowe obwodowych węzłów chłonnych u myszy

Ostatnie postępy w mikroskopii dwufotonowej umożliwiły obrazowanie in situ żywych tkanek w modelach zwierzęcych w czasie rzeczywistym, co zwiększyło nasze możliwości badania zachowania komórek zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. W niniejszym materiale przedstawiamy przygotowania niezbędne do przeprowadzenia obrazowania przyżyciowego węzła chłonnego podkolanowego myszy.

Obrazowanie intravitalne węzła chłonnego podkolanowego myszy

Ten film opisuje obrazowanie rezydentów infiltrujących nowotwór limfocytów T CD8 znakowanych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w ludzkich wycinkach guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Analiza w czasie rzeczywistym migracji rezydentnych limfocytów T w różnych regionach guza przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Tutaj opisujemy podejście do mikroskopii świetlnej w celu wizualizacji nacieku leukocytów CD45+ w mysim modelu aseptycznego, piorunującego zapalenia mięśnia sercowego, które jest indukowane przez leczenie myszami CD11c.DTR toksyną dyfterytową dotchawiczą.

Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

Ten protokół opisuje metodę obrazowania rezydentnych komórek T CD8 infiltrujących nowotwór, oznaczonych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w wycinkach ludzkiego guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Obrazowanie rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej

Celem protokołu jest pokazanie podłużnego śledzenia tymocytów w czasie rzeczywistym za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej w implantach grasicy w przedniej komorze oka myszy. Przezroczystość rogówki i unaczynienie przeszczepu pozwala na ciągłe rejestrowanie rekrutacji komórek progenitorowych i wyjścia dojrzałych komórek T.

Śledzenie w czasie rzeczywistym in vivo tymocytów w przedniej komorze oka za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej

Ten protokół opisuje technikę obrazowania różnych populacji komórek w drenujących węzłach chłonnych bez zmian w strukturze narządu.

Wizualizacja struktury węzłów chłonnych i lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej ex-vivo

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Połączenie znakowania przeciwciałami, optycznego oczyszczania i zaawansowanej mikroskopii świetlnej pozwala na trójwymiarową analizę całych struktur lub organów. Opisano tutaj prostą metodę łączenia znakowania immunologicznego grubych plasterków nerki, oczyszczania optycznego za pomocą cynamonianu etylu oraz obrazowania konfokalnego, które umożliwia wizualizację i kwantyfikację trójwymiarowych struktur nerkowych.

Optyczne oczyszczanie i obrazowanie znakowanej immunologicznie tkanki nerki

Poznaj metodę obrazowania limfocytów T w wycinkach węzłów chłonnych myszy za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej. Technika umożliwia analizę migracji komórek w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie ex vivo limfocytów T w przekrojach węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem mikroskopii szerokopolowej i konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów