Mikroskopia immunofluorescencyjna do analizy pęknięć dwuniciowych DNA

Aby zobrazować specyficzne białka odpowiedzi na uszkodzenia DNA w miejscach pęknięcia podwójnej nici DNA, DSB, za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, zacznij od szkiełek mikroskopowych zawierających monowarstwy ludzkich komórek jednojądrzastych z DSB. Napraw komórki za pomocą paraformaldehydu.

Potraktuj niejonowym detergentem, przepuszczalnymi membranami, aby uzyskać dostęp do celów wewnątrzkomórkowych. Dodaj roztwór blokujący zawierający białko, blokujący niespecyficzne miejsca wiązania komórek. Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami, które wiążą się z białkami odpowiedzi docelowej.

Potraktuj wtórną mieszaniną przeciwciał oznaczonych różnymi fluoroforami, aby związać się specyficznie z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi przyłączonymi do białek. Barwienie DNA za pomocą DAPI. Dodaj medium montażowe; Zamontuj szkiełko nakrywkowe.

Podczas mikroskopii fluorescencyjnej padająca wiązka światła dociera do filtra wzbudzenia, przepuszczając światło o określonej długości fali wzbudzenia. Po dotarciu do zwierciadła dichroicznego - rozdzielacza wiązki - światło wzbudzenia selektywnie odbija się w kierunku soczewki obiektywu, która skupia światło na próbce.

Padające świa