Mikroskopia immunofluorescencyjna do analizy pęknięć dwuniciowych DNA

Aby zobrazować specyficzne białka odpowiedzi na uszkodzenia DNA w miejscach pęknięcia podwójnej nici DNA, DSB, za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, zacznij od szkiełek mikroskopowych zawierających monowarstwy ludzkich komórek jednojądrzastych z DSB. Napraw komórki za pomocą paraformaldehydu.

Potraktuj niejonowym detergentem, przepuszczalnymi membranami, aby uzyskać dostęp do celów wewnątrzkomórkowych. Dodaj roztwór blokujący zawierający białko, blokujący niespecyficzne miejsca wiązania komórek. Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami, które wiążą się z białkami odpowiedzi docelowej.

Potraktuj wtórną mieszaniną przeciwciał oznaczonych różnymi fluoroforami, aby związać się specyficznie z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi przyłączonymi do białek. Barwienie DNA za pomocą DAPI. Dodaj medium montażowe; Zamontuj szkiełko nakrywkowe.

Podczas mikroskopii fluorescencyjnej padająca wiązka światła dociera do filtra wzbudzenia, przepuszczając światło o określonej długości fali wzbudzenia. Po dotarciu do zwierciadła dichroicznego - rozdzielacza wiązki - światło wzbudzenia selektywnie odbija się w kierunku soczewki obiektywu, która skupia światło na próbce.

Padające światło wzbudzenia wzbudza elektrony fluoroforu do wyższego stanu energetycznego. Po powrocie do stanu podstawowego elektrony emitują światło o większej długości fali, zbierane przez soczewkę obiektywu i przekazywane z powrotem do zwierciadła dichroicznego.

Lustro przepuszcza emitowane światło fluorescencyjne przez filtr emisyjny, dzięki czemu do detektora dociera tylko pożądane światło fluorescencyjne. Przetwórz obrazy. Przeanalizuj różnokolorowe ogniska fluorescencyjne, aby uwidocznić kolokalizację białek odpowiedzi na uszkodzenie DNA w miejscu DSB.

Przygotować dwie cytospiny z komórkami jednojądrzastymi próbek pacjenta przez odwirowanie 1 x 10⁵ komórek dla każdego preparatu. Napraw komórki za pomocą 200 mikrolitrów 4% PFA przez 10 minut.

Po utrwaleniu delikatnie przemyj komórki trzy razy 30 mililitrami PBS przez pięć minut każdy na shakerze. Następnie przepuszczaj komórki za pomocą 200 mikrolitrów 0,1% Octoxinol-9 przez 10 minut. Delikatnie umyj komórki trzy razy 30 mililitrami 5% roztworu blokującego przez pięć minut każdy na wytrząsarce laboratoryjnej. Zablokuj komórki w 30 mililitrach świeżego 5% roztworu blokującego na jedną godzinę.

Utrwalenie i przepuszczalność komórek za pomocą 4% paraformaldehydu i 0,1% oktoksynolu-9 wyraźnie zachowało ogniska gamma H2AX i 53BP1.

Inkubować jeden preparat komórek z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-gamma H2AX, a drugi preparat komórek z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-gamma H2AX i poliklonalnym przeciwciałem królika anty-53BP1 przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Zdecydowanie zaleca się stosowanie sprawdzonych przeciwciał anty-gamma H2AX i anty-53BP1.

Po inkubacji delikatnie umyj komórki trzy razy 30 mililitrami 2% roztworu blokującego na każde pięć minut na wytrząsarce laboratoryjnej.

Następnie inkubuj pierwsze przygotowanie komórek z sprzężonym z Alexa488 kozim przeciwciałem wtórnym przeciwko myszy, rozcieńczonym 1 na 500 w 2% roztworze blokującym. Inkubować drugi preparat komórek z sprzężonym z Alexa488 kozim przeciwciałem drugorzędowym przeciwko mysom i sprzężonym z Alexa555 drugorzędowym przeciwciałem anty-króliczym osła, rozcieńczonym 1 na 500 w 2% roztworze blokującym.

Delikatnie umyj komórki trzy razy 30 mililitrami PBS na wytrząsarce laboratoryjnej. Wyjmij PBS i zamontuj ogniwa za pomocą nośnika montażowego. Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe na podłoże montażowe, aby nie osadzały się pęcherzyki powietrza. Odczekaj co najmniej trzy godziny, aż podłoże montażowe stwardnieje przed analizą komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Na koniec przeanalizuj ogniska gamma H2AX i 53BP1 w jądrach komórkowych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry dla DAPI, Alexa488 i Cy3 podczas obrazowania przy 100-krotnym powiększeniu obiektywu.