Bioinżynieria ludzkich sieci mikro naczyniowych u myszy z niedoborem odporności

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie sieci naczyniowej człowieka in vivo. Osiąga się to poprzez uprzednią hodowlę ludzkich komórek endotelialnych tworzących kolonie pochodzących z krwi oraz ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego. Oba typy komórek są następnie mieszane z żelem na bazie kolagenu, który jest wstrzykiwany podskórnie myszy z niedoborem odporności.

Siedem dni później implant jest pobierany i oceniany pod kątem utworzenia ludzkiej sieci naczyniowej. Ostatecznie obecność specyficznych dla człowieka mikronaczyniń wewnątrz implantów można zweryfikować za pomocą histologii i immunohistochemii. Główną zaletą tej technologii w stosunku do metod tradycyjnych, takich jak chirurgiczna implantacja konstruktu, jest to, że jest ona prosta w wykonaniu i nie wymaga interwencji chirurgicznej.

Zacznij od rozmrożenia jednej fiolki E CFCs i niezwłocznie rozcieńcz komórki w 15 mililitrowej probówce stożkowej zawierającej 10 ml DMEM. Odwiruj zawiesinę komórkową przy 1200 RPM przez pięć minut i ponownie zawieś osad komórkowy w 10 ml ocieplonej pożywki EGM two. Następnie przenieś komórki na 100 milimetrową płytkę do hodowli tkanek pokrytą 1% żelatyną i inkubuj komórki przez noc w inkubatorze z nawilżaczem.

Następnego ranka ostrożnie odessać pożywkę oraz wszystkie niezwiązane komórki. Następnie dostarczyć związanym komórkom 10 ml świeżej pożywki EGM-2. Powtarzać ten proces przez kolejne kilka dni, aż do utworzenia się konfluentnej warstwy jednowarstwowej.

Następnie przemyj komórki 10 mililitrami PBS. Zastąp PBS dwiema mililitrami trypsyny EDTA i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze na pięć minut. Po upływie pięciu minut, obserwując pod mikroskopem, delikatnie opukaj płytkę i sprawdź, czy komórki się odkleiły.

Jeśli nie, powtórzyć krótkie inkubacje przy delikatnym kołysaniu. Po całkowitym odklejeniu komórek dodać do nich osiem mililitrów medium EGM two i przenieść komórki do probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów. Policzyć komórki, a następnie odwirować je przy 1200 RPM przez pięć minut.

Następnie wysiej komórki na płytki do hodowli tkankowej pokryte 1% żelatyną z gęstością wysiewu 5 000 komórek na centymetr kwadratowy. Inkubuj komórki w pożywce EGM two i zasilaj je co dwa do trzech dni pożywką EGM two. Powtórz tę procedurę w kolejnych pasażach, od czwartego do ósmego pasażu.

Komórki E CFC będą gotowe do użycia. Niniejszy protokół może być również wykorzystany do namnażania MSC. Wystarczy zastąpić pożywkę E GM two pożywką M-S-C-G-M.

Należy użyć niepowlekanej płytki hodowlanej. Pasażowanie należy rozpocząć przy 80% konfluencji, stosując gęstość wysiewu 10 000 komórek na centymetr kwadratowy. Do tego eksperymentu wymagane jest 800 000 E CFCs oraz 1 200 000 MSCs na implant.

Zazwyczaj jednocześnie przygotowuje się pięć implantów. Aby rozpocząć, odessaj pożywkę komórkową z płytek hodowlanych i przemyj każdą płytkę z komórkami 10 ml PBS. Zastąp PBS dwiema mililitrami trypsyny EDTA i inkubuj płytki, delikatnie nimi kołysząc.

Kontroluj komórki pod mikroskopem co dwa do pięciu minut, aż wszystkie komórki odłączą się od podłoża. Następnie dodaj 8 ml DMEM i zbierz zawiesinę komórkową. W probówce stożkowej o pojemności 15 ml dokonaj zliczenia komórek, a następnie przenieś liczbę komórek wystarczającą do wykonania pięciu implantów do osobnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.

Następnie odwiruj komórki przy 1200 RPM przez pięć minut i usuń nadsącz. Ostrożnie przygotuj na lodzie mieszaninę fibrynogenu i kolagenu z fibronektyną. Następnie bardzo delikatnie resuspenduj pellet komórkowy w schłodzonej do temperatury lodu mieszaninie.

Unikając powstawania pęcherzyków powietrza, nabić zawiesinę komórek do strzykawki o pojemności 1 ml i przymocować igłę o rozmiarze 26 G z nakładką. Napełnioną strzykawkę przechowywać w lodzie do momentu wstrzyknięcia mieszaniny komórek. Znieczulić cztery sześciotygodniowe immunodeficyjne myszy athymic nude, korzystając z komory z izofluranem.

Po znieczuleniu myszy i potwierdzeniu braku reakcji na uciśnięcie palca, przystąp do iniekcji u każdej myszy. Za pomocą igły o rozmiarze 30 G wstrzyknij 50 µL roztworu trombiny podskórnie w górny obszar grzbietu. W tym samym miejscu wstrzyknij 200 µL mieszaniny komórek.

Po wstrzyknięciu makrocząsteczek za pomocą igły o rozmiarze 26 G, utworzy się żel, który stworzy niewielki, ale zauważalny guzek pod skórą. Po iniekcji umieść myszy na warstwie gazy, aby zapewnić im komfort i ciepło. Obserwuj je, dopóki nie odzyskają zdolności poruszania się.

Przez kolejne trzy dni należy codziennie obserwować ogólny stan zdrowia zwierzęcia. Tydzień po iniekcjach myszy należy poddać eutanazji za pomocą dwutlenku węgla i chirurgicznie usunąć zatyczkę żelową. Po wyjęciu należy sfotografować zatyczki żelowe obok linijki, a następnie umieścić każdą zatyczkę żelową w kasecie histologicznej i zanurzyć je w 10% neutralnym buforowanym formalinie na noc w temperaturze pokojowej.

Następnego dnia wypłukać 10% neutralny bufor formy wodą destylowaną. Przechowywać kasety w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu przeprowadzenia oceny histologicznej. Wykonać przekroje implantu zatopionego w parafinie o grubości siedmiu mikronów.

Następnie należy określić gęstość mikronaczyń w środkowej części implantów. Przy użyciu barwienia H&E należy policzyć liczbę naczyń na milimetr kwadratowy, aby wykazać ludzkie pochodzenie naczyń mikrokrażeniowych. Przetnij przekroje przeciwciałem anty-ludzkim CD 31 dostępnym w handlu w rozcieńczeniu 1:100.

Ten obraz w kontraście fazowym pokazuje charakterystyczną morfologię brukowej mozaiki komórek śródbłonka w typowej konfluencyjnej monowarstwie eCFC pochodzących z krwi pępowinowej. Ten obraz pokazuje typową wrzecionowatą morfologię MSC pochodzących z ludzkiego szpiku kostnego. Po tygodniowej inkubacji w organizmie myszy, implant zaznaczony żółtą przerywaną linią wyglądał przy większym powiększeniu zupełnie inaczej niż tkanki gospodarza.

Wykazano obecność wielu mikro naczyń krwionośnych, których struktury światła zawierają erytrocyty, co zaznaczono żółtymi grotami strzałek. Podczas badania immunohistochemicznego zatyczek, światło mikronaczyń wykazało reaktywność z przeciwciałem monoklonalnym przeciwko ludzkiemu CD 31. Jądra komórkowe przeciwbarwiono hematyną.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją zrealizować w obrębie jednej uncji.