Name: Pomiar obciążenia bakteryjnego i odpowiedzi immunologicznej u myszy zakażonych Listeria monocytogenes (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Poznaj metodę pomiaru obciążenia bakteryjnego i analizy odpowiedzi immunologicznej u myszy zakażonych Listeria monocytogenes. Technika umożliwia charakterystykę różnic między szczepami wrażliwymi i odpornymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Annie Walduck, Christinie Cheers, Stuartowi Berzinsowi, Dale'owi Godfreyowi, Yifan Zhan i Jonathanowi Wilkschowi za rady oraz odczynniki. Niniejsza praca była finansowana przez Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2008-602) oraz Australijną Krajową Radę Badawczą w dziedzinie Zdrowia i Medycyny (575552). NW otrzymuje wsparcie w ramach Australian Postgraduate Award. OW otrzymuje wsparcie z fellowship R.D. Wright przyznanego przez Australijną Krajową Radę Badawczą w dziedzinie Zdrowia i Medycyny.

<ol><li>Wing, E. J., Gregory, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+clinical+and+experimental+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: clinical and experimental update.</a> J Infect Dis. 185, Suppl 1. S18-S24 (2002).</li>
<li>Conlan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+host-pathogen+interactions+in+the+liver+and+spleen+during+systemic+murine+listeriosis%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Early host-pathogen interactions in the liver and spleen during systemic murine listeriosis: an overview.</a> Immunobiology. 201, 178-187 (1999).</li>
<li>Neuenhahn, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+functions+of+splenic+CD8alpha%2B+dendritic+cells+during+infection+with+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Unique functions of splenic CD8alpha+ dendritic cells during infection with intracellular pathogens.</a> Immunol Lett. 114, 66-72 (2007).</li>
<li>Cousens, L. P., Wing, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+defenses+in+the+liver+during+Listeria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Innate defenses in the liver during Listeria infection.</a> Immunol Rev. 174, 150-159 (2000).</li>
<li>Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+a+multifaceted+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: a multifaceted model.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).</li>
<li>Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune responses to Listeria monocytogenes.</a> Nat Rev Immunol. 4, 812-823 (2004).</li>
<li>Cheers, C., McKenzie, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+and+susceptibility+of+mice+to+bacterial+infection%3A+genetics+of+listeriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Resistance and susceptibility of mice to bacterial infection: genetics of listeriosis.</a> Infect Immun. 19, 755-762 (1978).</li>
<li>Garifulin, O., Boyartchuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+as+a+probe+of+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes as a probe of immune function.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 4, 258-269 (2005).</li>
<li>Gervais, F., Stevenson, M., Skamene, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+resistance+to+Listeria+monocytogenes%3A+regulation+of+leukocyte+inflammatory+responses+by+the+Hc+locus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of resistance to Listeria monocytogenes: regulation of leukocyte inflammatory responses by the Hc locus.</a> J Immunol. 132, 2078-2083 (1984).</li>
<li>Gervais, F., Desforges, C., Skamene, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C5-sufficient+A%2FJ+congenic+mouse+strain.+Inflammatory+response+and+resistance+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The C5-sufficient A/J congenic mouse strain. Inflammatory response and resistance to Listeria monocytogenes.</a> J Immunol. 142, 2057-2060 (1989).</li>
<li>Boyartchuk, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigenic+control+of+Listeria+monocytogenes+susceptibility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Multigenic control of Listeria monocytogenes susceptibility in mice.</a> Nat Genet. 27, 259-260 (2001).</li>
<li>Boyartchuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+resistance+locus+sst1+controls+innate+immunity+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The host resistance locus sst1 controls innate immunity to Listeria monocytogenes infection in immunodeficient mice.</a> J Immunol. 173, 5112-5120 (2004).</li>
<li>Pan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipr1+gene+mediates+innate+immunity+to+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ipr1 gene mediates innate immunity to tuberculosis.</a> Nature. 434, 767-772 (2005).</li>
<li>Garifulin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irf3+polymorphism+alters+induction+of+interferon+beta+in+response+to+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Irf3 polymorphism alters induction of interferon beta in response to Listeria monocytogenes infection.</a> PLoS Genet. 3, 1587-1597 (2007).</li>
<li>Hof, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+different+strains+of+Listeria+monocytogenes+serovar+1%2F2a%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Microbiol+Immunol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Virulence of different strains of Listeria monocytogenes serovar 1/2a.</a> Med Microbiol Immunol (Berl. 173, 207-218 (1984).</li>
<li>Wollert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+host+range+of+Listeria+monocytogenes+by+rational+protein+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design.</a> Cell. 129, 891-902 (2007).</li>
<li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+model+for+listeriosis%3A+role+of+internalin+in+crossing+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier.</a> Science. 292, 1722-1725 (2001).</li>
<li>Marco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+Listeria+monocytogenes+in+mice+infected+by+the+oral+route%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Penetration of Listeria monocytogenes in mice infected by the oral route.</a> Microb Pathog. 23, 255-263 (1997).</li>
<li>Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+infection+with+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Animal model for infection with Listeria monocytogenes.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter. 19, 19-19 (2001).</li>
<li>Neuenhahn, M., Schiemann, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+in+mouse+models+of+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DCs in mouse models of intracellular bacterial infection.</a> Methods Mol Biol. 595, 319-329 (2010).</li>
<li>Conlan, J. W., North, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+essential+for+early+anti-Listeria+defense+in+the+liver%2C+but+not+in+the+spleen+or+peritoneal+cavity%2C+as+revealed+by+a+granulocyte-depleting+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are essential for early anti-Listeria defense in the liver, but not in the spleen or peritoneal cavity, as revealed by a granulocyte-depleting monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 179, 259-268 (1994).</li>
<li>Czuprynski, C. J., Brown, J. F., Wagner, R. D., Steinberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+antigranulocyte+monoclonal+antibody+RB6-8C5+prevents+expression+of+acquired+resistance+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+previously+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Administration of antigranulocyte monoclonal antibody RB6-8C5 prevents expression of acquired resistance to Listeria monocytogenes infection in previously immunized mice.</a> Infect Immun. 62, 5161-5163 (1994).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Listeria jest jednym z najczęściej wykorzystywanych organizmów do charakteryzacji odpowiedzi odpornościowych gospodarza na bakterie wewnątrzkomórkowe6. Przedstawiony tutaj protokół umożliwia pomiar ładunku bakteryjnego oraz odpowiedzi komórek odpornościowych w obrębie tej samej tkanki u danej myszy. Taki podwójny pomiar w konkretnej tkance dla każdej zainfekowanej myszy pozwala na bardziej wiarygodne porównania w obrębie i pomiędzy kohortami myszy (reprezentującymi różne szczepy myszy lub punkty czasowe po infekcji). Choć do badania odpowiedzi odpornościowych u myszy można by wykorzystać infekcję Listeria drogą doustną, często stosuje się wstrzyknięcia dożylne, ponieważ: 1) zapewnia to szybkie i skuteczne dostarczenie patogenu do krwiobiegu; 2) skutkuje to zsynchronizowaną i spójną infekcją systemową; oraz 3) gatunek Mus posiada mutację w genie kodującym receptor E-kadheryna, co ogranicza infekcję Listeria drogą doustną (mutacja ta wpływa na zdolność Listeria do wiązania się z mysim receptorem E-kadheryny i do efektywnego pokonywania nabłonka przewodu pokarmowego)16-18.
W niniejszym protokole istnieje kilka krytycznych etapów. Po pierwsze, zapas inokulum Listeria należy przygotować ze świeżej, hodowanej przez noc kultury na agarze krwi konika (HBA), aby zapewnić żywotność i wirulencję. Po drugie, ważne jest dokładne określenie stężenia CFU inokulum przed i po wstrzyknięciu wszystkim myszom, aby upewnić się, że stężenie CFU nie różni się znacząco pomiędzy pierwszą a ostatnią wstrzykniętą myszą. Po trzecie, wstrzykiwanie Listeria do żyły ogonowej musi być wykonywane w sposób spójny dla wszystkich myszy. Na koniec konieczne jest przeprowadzenie perfuzji wątroby w celu usunięcia leukocytów nierezydentnych, co zapewni dokładny pomiar komórek odpornościowych wewnątrz wątroby, a nie leukocytów przepływających w krwi obwodowej. Niezastosowanie się do któregokolwiek z tych kroków może skutkować niepożądaną zmiennością obciążenia bakteryjnego i/lub odpowiedzi odpornościowych pomiędzy poszczególnymi myszami zakażonymi Listeria.
Dwie ograniczenia tego protokołu to umiejętności badacza w zakresie zakażania myszy poprzez wstrzyknięcie dożylne oraz wykrywanie ładunku bakteryjnego w tkankach. Jeśli jedna osoba wstrzykuje preparat dużej liczbie myszy, żywotność Listeria (tj. stężenie CFU) może z czasem spaść po rozmrożeniu mrożonego inokulum (np. &gt;2 godziny między zakażeniem pierwszej a ostatniej myszy). Badacz musi samodzielnie określić, ile myszy jest w stanie zakażyć, zanim inokulum ulegnie pogorszeniu. Kolejnym ograniczeniem tej metody jest fakt, że ładunek Listeria nie może być dokładnie zmierzony poniżej 100CFU/organ z powodu stosunkowo niewielkich ilości hodowanego homogenatu tkankowego (np. Rysunek 3 wskazuje, że 100CFU/organ jest granicą detekcji). Aby dokładniej zmierzyć niższe wartości CFU/organ, można wyhodować większą ilość homogenatu tkankowego (do 0,5mL na płytkę, można użyć wielu płytek), tak aby do detekcji Listeria pobrano większą część tkanki. Jeśli Stomacher nie jest dostępny, w krokach 7.1-7.2 można zamiast niego zastosować alternatywne metody homogenizacji tkanki, takie jak użycie homogenizatora tkankowego. W kwestiach praktycznych, jeśli miejsce w inkubatorze 37°C do hodowli próbek tkanek z zakażonych myszy jest ograniczone, płytki z kulturą HBA można inkubować w temperaturze pokojowej przez 2-3 dni (kolonie będą rosnąć wolniej w temperaturze pokojowej). Jednak temperatury pokojowej nie należy stosować podczas hodowli kultur do przygotowania mrożonych zapasów Listeria.
Niniejszy protokół przedstawia podstawowe podejście do charakterystyki zakażenia Listeria u myszy i może być stosowany w przypadku innych szczepów Listeria poza EGD. Oprócz wątroby i śledziony można również przygotować zawiesiny pojedynczych komórek z węzłów chłonnych. W obu przypadkach zawiesiny pojedynczych komórek mogą być wykorzystane do różnorodnych analiz, w tym do pomiaru subpopulacji komórek odpornościowych oraz stymulacji in vitro posortowanych komórek odpornościowych. Po opanowaniu podstawowych technik protokół ten można zmodyfikować w celu izolacji limfocytów T specyficznych dla Listeria19, charakterystyki komórek dendrytycznych20 lub przeprowadzenia deplekcji komórek odpornościowych w określonych punktach czasowych po zakażeniu21,22, aby dokładniej scharakteryzować odpowiedź immunologiczną u myszy zakażonych Listeria.

<table><tbody><tr><td>Podłoże agarowe z krwią konia nr 2</td><td>Oxford Labware</td><td>CM0271</td><td>Przygotowanie podłoża agarowego dla płytek HBA</td></tr><tr><td>Krew konia (defibrynowana)</td><td>Oxford Labware</td><td>HB1000</td><td>Dodać 5-10% do podłoża agarowego</td></tr><tr><td>Bulion Brain Heart Infusion (BHI) (10 mL)</td><td>Oxford Labware</td><td>TM456</td><td></td></tr><tr><td>Odżywka Brain Heart Infusion w proszku</td><td>Oxford Labware</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa z płaskim dnem</td><td>BD Biosciences</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek 70 &amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Mała szalka Petriego</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>System laboratoryjny Stomacher 80 biomaster</td><td>Seward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe worki do Stomachera</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>86 9924 530</td><td></td></tr><tr><td>Seryjne albuminy wołowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3912</td><td></td></tr><tr><td>Bufor FACS</td><td></td><td></td><td>0,1% (w/v) seryjnych albumin wołowych w PBS</td></tr><tr><td>Izotoniczny Percoll (33,75% Percoll w PBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td>33,75mL Percoll, 3,75mL 10x PBS, 62,5mL 1x PBS daje 100mL izotonicznego Percollu</td></tr><tr><td>Bufor TAC</td><td></td><td></td><td>17mM Tris, 140mM chlorku amonu w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Bufor FCS/EDTA</td><td></td><td></td><td>Płydka surowica cielęca z 10mM EDTA</td></tr><tr><td>Bufor FACS/EDTA</td><td></td><td></td><td>Bufor FACS + 5mM EDTA</td></tr><tr><td>Błękit trypanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>0,4% (w/v) w PBS, sterylizowany przez filtr</td></tr><tr><td>Krioprobetka 2mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>121263</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa 27G/1mL</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>SS10M2713</td><td></td></tr><tr><td>Igła</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in)</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>SS-01T (1mL), SS-053 (5mL), SS-10S (10mL)</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar ładunku bakteryjnego i odpowiedzi immunologicznych u myszy zainfekowanych listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) jest Gram-dodatnim, fakultatywnym patogenem wewnątrzkomórkowym1W badaniach na myszach zazwyczaj stosuje się iniekcję dożylną Listeriaco prowadzi do zakażenia systemowego2Po wstrzyknięciu Listeria szybko rozprzestrzenia się do śledziony i wątroby w wyniku wychwytu przez komórki CD8α+ komórki dendrytyczne i komórki Kupffera3,4Po fagocytozie różne białka bakteryjne umożliwiają Listeria aby wydostać się z fagosomu, przeżyć w cytosolu i zainfekować sąsiednie komórki5Podczas pierwszych trzech dni infekcji różne komórki odporności nieswoistej (np. monocyty, neutrofile, komórki NK, komórki dendrytyczne) pośredniczą w mechanizmach bakteriobójczych, które minimalizują Listeria proliferacja. CD8+ Następnie rekrutowane są limfocyty T, które odpowiadają za ostateczne usunięcie Listeria z organizmu gospodarza, zazwyczaj w ciągu 10 dni od zakażenia6.
Skuteczne usunięcie Listeria z organizmu zakażonych myszy zależy od odpowiedniego momentu uruchomienia odpowiedzi immunologicznej gospodarza6. Wśród wchłoniętych szczepów myszy występuje szeroki zakres wrażliwości7,8. Zazwyczaj myszy o zwiększonej podatności na zakażenie Listeria słabiej kontrolują proliferację bakteryjną, co objawia się zwiększonym mianem bakterii i/lub opóźnionym usuwaniem patogenu w porównaniu z myszami odpornymi. Badania genetyczne, w tym analizy sprzężeń oraz zastosowanie szczepów myszy z nokautem, pozwoliły zidentyfikować różne geny, których wariancja sekwencji wpływa na odpowiedź gospodarza na zakażenie Listeria6,8-14. Wyznaczenie i porównanie kinetyki zakażenia pomiędzy różnymi szczepami myszy jest zatem istotną metodą identyfikacji genetycznych czynników gospodarza, które przyczyniają się do odpowiedzi immunologicznej przeciwko Listeria. Porównanie odpowiedzi gospodarza na różne szczepy Listeria jest również skutecznym sposobem identyfikacji bakteryjnych czynników wirulencji, które mogą służyć jako potencjalne cele dla antybiotykoterapii lub projektowania szczepionek.
Opisujemy tutaj prostą metodę pomiaru ładunku bakteryjnego (jednostek tworzących kolonie [CFU] na tkankę) oraz przygotowania zawiesin pojedynczych komórek wątroby i śledziony do analizy FACS odpowiedzi immunologicznych u myszy zainfekowanych Listeria. Metoda ta jest szczególnie użyteczna przy wstępnej charakterystyce infekcji Listeria w nowych szczepach myszy, a także przy porównywaniu odpowiedzi immunologicznych między różnymi szczepami myszy zainfekowanymi Listeria. Wykorzystujemy szczep Listeria monocytogenes EGD15, który po wysianiu na agar krwi wykazuje charakterystyczną strefę halo wokół każdej kolonii z powodu β-hemolizy1 (Rycina 1). Ładunek bakteryjny i odpowiedzi immunologiczne można oznaczyć w dowolnym punkcie czasowym po infekcji, hodując homogenat tkankowy na płytkach z agarem krwi i przygotowując zawiesiny komórek tkankowych do analizy FACS zgodnie z opisanymi poniżej protokołami. Zaznaczamy, że osoby z niedoborem odporności lub kobiety w ciąży nie powinny pracować z Listeria, a przed rozpoczęciem prac należy skonsultować się z odpowiednią instytucjonalną komisją ds. bezpieczeństwa biologicznego oraz kierownictwem weterynarium.

Listeria monocytogenes jest organizmem modelowym do badania odpowiedzi immunologicznych i genetycznej podatności myszy na bakterie wewnątrzkomórkowe. Metoda ta umożliwia pomiar ładunku bakteryjnego oraz przygotowanie jednokomórkowych zawiesin wątroby i śledziony myszy do analizy FACS w celu określenia zmian w komórkach odpornościowych wywołanych zakażeniem Listeria.

Pomiar ładunku bakteryjnego i odpowiedzi immunologicznych u myszy zainfekowanych Listeria monocytogenes

*Listeria monocytogenes* (Listeria) jest Gram-dodatnim, fakultatywnym patogenem wewnątrzkomórkowym1. W badaniach na myszach zazwyczaj stosuje się wstrzyknięcia dożylne...

W niniejszym filmie zaprezentowano metodę pomiaru ładunku bakteryjnego oraz przygotowania i analizy zawiesin pojedynczych komórek z wątroby i śledziony myszy. W pierwszej kolejności przygotowywany jest inokulum listerii, który następnie wstrzykuje się myszom dożylnie. Po eutanazji myszy w wybranych punktach czasowych pobierane są próbki krwi, wątroby oraz śledziony.Zawiesiny pojedynczych komórek przygotowuje się z pobranych tkanek oraz homogenatów tkankowych hodowanych na płytkach z agarem z krwią konia. Otrzymane zawiesiny komórkowe można następnie poddać analizie pod kątem żywotności i zawartości komórek odpornościowych za pomocą analizy FACS, natomiast ładunek bakteryjny określa się na podstawie jednostek tworzących kolonie. Metoda ta pozwala na charakterystykę odpowiedzi immunologicznej na zakażenie steroidowe, na przykład różnic między szczepami mal podatnymi a opornymi, przy jednoczesnym oznaczaniu ilości bakterii w zakażonych narządach.Procedurę należy rozpocząć od przygotowania inokulum listeria do pożądanego stężenia; instrukcje dotyczące hodowli, przechowywania i przygotowania listeria znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym. Po przygotowaniu inokulum należy przenieść dwie alikwoty po 100 µL do sterylnych probówek mikrowirówkowych zawierających 900 µL PBS w celu wykonania rozcieńczenia 1:10, a następnie przenieść 100 µL każdego rozcieńczenia na płytki z agarem z krwią konia HBA i dokładnie rozprowadzić sterylnym rozpylaczem w celu wykonania obliczeń jednostek tworzących kolonie CFU, po czym inkubować płytki odwrócone do góry dnem w temperaturze 37 °C przez noc. Następnie należy przenieść myszy do czystej klatki.Umieść klatkę 50 centymetrów pod lampą podczerwieni o mocy 250 watów na pięć minut, aby zapewnić rozszerzenie żyły ogonowej. Pozwala to na lepszą wizualizację podczas wstrzykiwania. Tutaj, szczep myszy odporny na listeriozę, C 57 black six, oraz szczep myszy podatny na listeriozę, BALB/c, zostaną poddane iniekcji. Delikatnie wymieszaj zawiesinę listeria, kilkakrotnie odwracając probówkę.Następnie nabierz do strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 27 G dawkę 200 µL na mysz. Przed wstrzyknięciem należy upewnić się, że z igły usunięto wszystkie pęcherzyki powietrza. Umieść mysz w urządzeniu do unieruchamiania.Następnie zlokalizuj boczną żyłę ogonową myszy, najpierw identyfikując tętnicę ogonową, która znajduje się na środku strony grzbietowej. Następnie lekko obróć ogon w stronę boczną, aby zidentyfikować żyłę. Delikatnie przetrzyj ogon gazikiem nasączonym 70% etanolem, a następnie wykonaj wstrzyknięcie po wycofaniu strzykawki.Krótko uciśnij miejsce wkłucia za pomocą jałowego gazika. Należy zauważyć, że u myszy o czarnym umaszczeniu identyfikacja żyły ogonowej po wykonaniu iniekcji jest znacznie trudniejsza. Po zaszczepieniu wszystkich myszy z grupy, zwróć zwierzę do klatki, a pozostałą zawiesinę inokulatu inkubuj w celu oznaczenia liczby jednostek tworzących kolonie.Podobnie jak poprzedniego dnia, należy policzyć liczbę kolonii i określić stężenia inokulum listeria przed oraz po iniekcji. Charakterystyczna otoczka wokół poszczególnych kolonii, widoczna tutaj, jest wynikiem beta-hemolizy. Po ustaleniu liczb kolonii przed i po iniekcji należy obliczyć średnią liczbę jednostek tworzących kolonie, sumując liczby jednostek tworzących kolonie przed i po iniekcji, a następnie dzieląc wynik przez dwa.Na koniec, w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu, pobierz krew oraz wyizoluj wątrobę i śledzionę od uśpionych myszy. Jeśli planowana jest analiza fax, wątroba musi zostać przepłukana przed usunięciem w celu usunięcia krwi; należy przeprowadzić pobranie krwi z serca bezpośrednio po eutanazji i zebrać jak największą ilość krwi do odpowiedniej probówki. Aby przepłukać wątrobę, należy najpierw otworzyć jamę brzuszną, a następnie usunąć i odrzucić pęcherzyk żółciowy.Żyła główna dolna to żyła biegnąca równolegle do kręgosłupa, która transportuje krew z dolnej części ciała, w tym z wątroby, do serca. Za pomocą nożyczek przetnij żyłę tuż poniżej serca, aby stworzyć ujście dla wypływającego płynu perfuzyjnego. Następnie odchyl płaty wątroby w stronę głowy i odsuń jelita w prawo, aby odsłonić żyłę wrotną wątroby, która wpada do dolnej części wątroby.Z dolnej prawej strony wprowadź zagiętą igłę 26G o długości pół cala do żyły wrotnej i wstrzyknij 10 ml PBS. Po wstrzyknięciu od jednego do dwóch ml PBS wątroba zmieni kolor z ciemnoczerwonego na jasnobrązowy. Wstrzyknięty roztwór wypłynie przez przeciętą żyłę główną dolną. Perfuzja wątroby zapewnia, że pobrane komórki pochodzą z wątroby, a nie z krwi krążącej.Następnie należy wyjąć perfundowaną wątrobę z jamy brzusznej myszy i zanurzyć ją w probówce z buforem FACTS w lodzie. Następnie należy wyjąć śledzionę i umieścić ją w lodzie w celu przetworzenia w sposób podobny do opisanego w następnej sekcji. Aby przygotować zawiesiny pojedynczych komórek wątroby, należy przenieść perfundowaną wątrobę z buforu FACS na sitko komórkowe o rozmiarze 70 µm umieszczone w 60 mm szalce Petriego.Używając tłoka strzykawki o pojemności pięciu litrów, przepchnij tkankę przez sitko do komórek do szalki Petriego. Przenieś zawiesinę pojedynczych komórek do stożkowej probówki z zakrętką o pojemności 50 mililitrów i uzupełnij całkowitą objętość do 40 mililitrów zimnym buforem fax.Wymieszaj zawiesinę komórkową w wirówce vortex. Następnie odstaw alikwot o objętości 1 ml do oznaczenia ładunku bakteryjnego. W późniejszym etapie procedury umieść probówkę o pojemności 50 ml w wirówce i zwirował komórki z prędkością 500 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.Po odlaniu nadsączu powtórz ten etap płukania, resuspendując osad w 40 mililitrach zimnego buforu fax i wirując. Ponownie resuspenduj osad w 20 mililitrach izotonicznego roztworu w temperaturze pokojowej, a następnie wiruj zawiesinę komórkową z prędkością 700 ×g przez 12 minut w temperaturze pokojowej.Po wirowaniu na powierzchni perolu uniesie się dyskowata warstwa hepatocytów, a leukocyty zostaną ponownie osadzone na dnie probówki; należy usunąć warstwę hepatocytów oraz perol, wlewając je do pojemnika na odpady. Następnie osad zawierający leukocyty należy resuspender w 4 mL buforu TAC w celu lizy erytrocytów i inkubować komórki w temperaturze pokojowej do 10 minut, często odwracając probówkę. Po inkubacji zawiesinę komórkową należy przefiltrować przez nylonową membranę o oczkach 100 µm do nowej probówki wirówkowej o pojemności 10 mL.Pod warstwę przefiltrowanej zawiesiny komórek należy dodać jeden mililitr buforu FACS EDTA, jak pokazano tutaj. Następnie odwiruj próbkę z prędkością 350 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu wypłucz osad pięcioma mililitrami buforu FACS EDTA, a następnie ponownie odwiruj i resuspenduj osad w 0,5 do 3 mililitrach buforu FACS EDTA, w zależności od wielkości osadu. Określ liczbę żywych leukocytów wątrobowych za pomocą hemocytometru, stosując metodę wykluczania barwnika trypanu w wątrobie.Suspensje pojedynczych komórek można następnie znakować przeciwciałami specyficznymi dla wybranych markerów powierzchniowych komórek i analizować metodą FACS. Po przygotowaniu suspensji pojedynczych komórek z tkanki wątroby i śledziony, w określonych etapach procedury zostanie określona liczba bakterii. Do homogenizacji tkanki, przy zamkniętym worku homogenizacyjnym w celu zapobieżenia wyciekowi, zostanie użyty homogenizator typu Stomacher.Zacznij od położenia go płasko na czystym blacie. Przetaczaj gruby okrągły długopis po tkance, aż zostanie ona rozgnieciona wewnątrz woreczka. Do każdego woreczka z żołądkiem zawierającego rozgniecioną tkankę dodaj 5 mL PBS.Umieść żołądek lub worki w homogenizatorze tkanek (stomach machine) i uruchom go z dużą prędkością na 10 minut. Urządzenie posiada dwa łopatki, które zgniatają żołądek lub worki z określoną prędkością, mieszając zawartość w jednorodny homogenat i zapobiegając uwalnianiu aerozoli; za pomocą pipety wymieszaj homogenat w worku. Następnie przenieś 300 µL w dwóch powtórzeniach do płytki 96-dołkowej z płaskim dnem.W dołkach płytki 96-dołkowej wykonaj rozcieńczenia seryjne 1:10 aż do uzyskania rozcieńczenia 10⁻⁵. Dla każdej próbki homogenatu tkankowego ostrożnie nanieś za pomocą sterylnego rozpylacza 0,1 milliliters każdego rozcieńczenia na uprzednio osuszoną płytkę HBA. Inkubuj płytki w temperaturze 37 degrees Celsius przez noc.Następnego dnia należy policzyć liczbę jednostek tworzących kolonie dla każdego rozcieńczenia i obliczyć liczbę jednostek tworzących kolonie na tkankę, uwzględniając część tkanki, czynniki rozcieńczenia oraz objętość homogenatu. Sprawdzono, czy myszy C 57 black six zostały zainfekowane około 2000 jednostkami tworzącymi kolonie listerii; w trzecim i siódmym dniu po infekcji myszy zostały uśmiercone, a wątroba poddana perfuzji i pobrana wraz z śledzioną. Rozcieńczenia homogenatu śledziony lub zawiesiny pojedynczych komórek wątroby inkubowano na płytkach HBA w celu oznaczenia ładunku bakteryjnego.Na przedstawionych tutaj wynikach linia przerywana oznacza granicę wykrywalności wynoszącą 100 jednostek tworzących kolonie na organ. Należy zauważyć, że obciążenie listerią jest wyższe w dniu trzecim niż w dniu siódmym. Wynika to z faktu, że do dnia siódmego różne komórki odpornościowe prowadzą do eliminacji listerii.W tych dwóch tkankach, śledzionie i wątrobie, zawiesiny pojedynczych komórek zabarwiono błękitem trypanu i naniesiono na cytometr hematologiczny. Policzone zostaną komórki znajdujące się w obszarze zliczania wskazanym w czerwonej ramce. Komórki nieżywe pochłoną błękit trypanu i przybiorą niebieski kolor, natomiast komórki żywe pozostaną niezabarwione.Jak pokazano tutaj, liczba żywych komórek w śledzionie (widoczna po lewej stronie) oraz liczba żywych leukocytów w wątrobie (widoczna po prawej stronie) wzrasta w przebiegu infekcji. Wzrost ten wynika z obecności komórek odpornościowych, w tym neutrofili i limfocytów, które ulegają aktywacji, proliferują i migrują do tych dwóch miejsc zakażenia. Jako przykład poziomu komórek odpornościowych w przebiegu infekcji listeria przedstawiono tutaj reprezentatywne wykresy FACS oraz liczbę limfocytów T CD8 dodatnich.Liczba komórek T CD8+ przejściowo spada z powodu limfopenii w śledzionie w drugim i trzecim dniu, a następnie wyraźnie wzrasta od piątego dnia po infekcji zarówno w śledzionie, jak i w wątrobie. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak oscylacja androgenów, analiza specyficznych dla antygenu komórek T oraz testy funkcjonalne posortowanych komórek odpornościowych, aby dalej scharakteryzować odpowiedzi immunologiczne na infekcję listeria.

measuring-bacterial-load-immune-responses-mice-infected-with-listeria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Pomiar liczby bakterii i odpowiedzi immunologicznych u myszy zakażonych Listeria monocytogenes

Źródło: Lo, B. C. i in. Przewlekła infekcja salmonellą wywołana włóknieniem jelit. J. Vis. Exp. (2019)Film demonstruje ilościowe określenie obciążenia bakteryjnego w mysiim modelu przewlekłej infekcji streptomycynowooporną Salmonella typhimurium. Po eutanazji i sterylnej sekcji pobierane są tkanki cekalne i śledzionowe, ujednolicane stalowymi kulkami w celu uwalniania bakterii i seryjne rozcieńczane. Rozcieńczenia nakładane są na selektywnym agarze, a widoczne kolonie są liczone w celu...

Ilościowa ilościowa ilość obciążenia bakteryjnego tkanki w modelu myszy przewlekłej infekcji jelit

Źródło: McMullen, P. D., Freitag, N. E. Ocena inwazji bakterii na komórki serca w hodowli i kolonizacji serca u zakażonych myszy z użyciem Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje wstrzyknięcie Listeria monocytogenes do żyły ogonowej myszy w celu wywołania infekcji ogólnoustrojowej. Pokazuje krążenie bakteryjne, kolonizację narządów oraz ilościowe określenie obciążenia bakteryjnego w sercu poprzez homogenizację tkanek, wykonywanie seryjnego rozcieńczania i płyty płytowe.

Ilościowe określenie obciążenia bakteryjnego w sercu myszy po wstrzyknięciu Listeria monocytogenes do żyły ogonowo-ogonowocznej

Source: Ahn, J. J., et al. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates bacterial load measurement in spleen and liver tissues isolated from mice infected with an intracellular bacterial pathogen. Bacteria, accumulated within tissue-resident phagocytes during systemic infection, are released using detergent-based lysis and mechanical disruption. Serial dilutions of the homogenates are plated on...

Quantification of Bacterial Load in Mouse Spleen and Liver After Systemic Infection

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

Ten film pokazuje ilościowe określenie obciążenia bakteryjnego z perfundowanego mózgu myszy zakażonego Listeria monocytogenes.

Ocena kolonizacji bakteryjnej w mózgu myszy po zakażeniu Listeria monocytogenes

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę doustnego zakażenia myszy za pomocą żywności skażonej Listeria monocytogenes. Protokół można łatwo dostosować do stosowania z innymi patogenami bakteryjnymi przenoszonymi przez żywność.

Przenoszenie Listeria monocytogenes drogą pokarmową drogą pokarmową u myszy

Listeria monocytogenes powoduje infekcje płodu u kobiet w ciąży i zapalenie opon mózgowych w populacjach podatnych.  Subpopulacje bakterii mogą kolonizować tkankę serca, powodując zapalenie mięśnia sercowego u pacjentów i zwierząt laboratoryjnych.  W tym miejscu przedstawiamy protokół, który opisuje, jak ocenić inwazję komórek serca L. monocytogenes in vitro i kolonizację serca u zakażonych zwierząt.

Ocena inwazji bakteryjnej komórek serca w hodowli i kolonizacji serca u zakażonych myszy przy użyciu Listeria monocytogenes

Ten protokół opisuje, jak zaszczepić myszy C57BL/6J szczepem EGD Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) i zmierzyć odpowiedzi interferonu γ (IFN-γ) przez komórki NK (natural killer), limfocyty T (NKT) i adaptacyjne limfocyty T po zakażeniu. Protokół ten opisuje również, w jaki sposób przeprowadzać badania przeżycia u myszy po zakażeniu zmodyfikowaną dawką LD50 patogenu.

Eksperymentalne zakażenie Listeria monocytogenes jako model do badania odpowiedzi na interferon-γ gospodarza

Podczas infekcji, Listeria monocytogenes jest zdolna do przekraczania bariery krew-mózg w celu kolonizacji mózgu. W tym protokole pokazujemy, jak ocenić kolonizację bakteryjną narządów po zakażeniu myszy. Przewidziana jest procedura wykonywania perfuzji całego narządu w celu specyficznego określenia liczby bakterii w miąższu mózgu.

Listeria monocytogenes (Listeria monocytogenes) Zakażenie mózgu

Opisujemy zarówno testy infekcji in vitro, jak i in vivo, które mogą być użyte do analizy aktywności czynników kodujących gospodarza.

Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Tutaj prezentujemy elegancki protokół do oceny in vivo skuteczności szczepionki i odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Protokół ten można dostosować do modeli szczepionek, które badają patogeny wirusowe, bakteryjne lub pasożytnicze.

Ocena odpowiedzi gospodarz-patogen i skuteczności szczepionki u myszy

Poznaj metodę pomiaru obciążenia bakteryjnego i analizy odpowiedzi immunologicznej u myszy zakażonych Listeria monocytogenes. Technika umożliwia charakterystykę różnic między szczepami wrażliwymi i odpornymi.

Pomiar ładunku bakteryjnego i odpowiedzi immunologicznych u myszy zainfekowanych Listeria monocytogenes

Przeglądaj więcej filmów