Test angiogenezy w krezoni szczura

Witamy w Zakładzie Patologii w szpitalu uniwersyteckim GaN w Guttenburgu w Szwecji. Jestem dr Klaus Norby, a metoda, którą zaraz Państwo zobaczą, została opracowana w moim laboratorium. Angiogeneza istotna klinicznie, która występuje w związku z hipoksją, guzami litymi lub jakąkolwiek inną chorobą angiogenną, zachodzi niemal wyłącznie w tkance naturalnie unaczynionej. U dorosłych małych gryzoni krezka, która łączy jelito cienkie z tylną ścianą ciała, zawiera szereg cienkich części błoniastych. U szczurów znajduje się od 40 do 50 takich okien krezkowych. Są one praktycznie przezroczyste i dla gołego oka przypominają okna; u dorosłych samców szczurów każde okno jest otoczone tkanką tłuszczową.

Okna krezkowe są naturalnie unaczynione i nie wykazują mierzalnej fizjologicznej angiogenezy. Stwarzają one zatem możliwość badania angiogenezy de novo w unaczynionej tkance ssaków u osobników dorosłych. Chodzi o zainicjowanie pełnej odpowiedzi angiogennej od podstaw, przy pokonaniu inhibitorów angiogenezy działających endogennie w badanej tkance, jak w przypadku wszystkich normalnych tkanek u myszy; w wielu oknach brak jest natywnych mikronaczyń, które mogłyby pełnić rolę naczyń macierzystych, co niestety sprawia, że test w formie natywnej jest u myszy nieprzewidywalny.

Okna krezkowe u szczurów u osobników dorosłych zawierają zazwyczaj stosunkowo niewielką liczbę małych naczyń krwionośnych zlokalizowanych na obwodzie. Okna krezkowe te mają naturalnie grubość od 5 do 10 µm. Pozwala to na rozłożenie nienaruszonej tkanki na szkiełkach i obserwację mikroskopową, co umożliwia obejrzenie wszystkich naczyń w każdym oknie i nadaje im w zasadzie dwuwymiarowy charakter.

Metoda ta oferuje niezrównaną możliwość dokonywania pomiarów ilościowych w zakresie rozległości przestrzennej, gęstości, formowania wzorców oraz rozmiaru mikroznaczyni krwionośnych. Miejsce podskórne jest popularne w badaniach nad angiogenezą, jednak ze względu na heterogenność komórek śródbłonkowych i specyficzne właściwości tkanek, kontrola angiogenezy w tkankach podskórnych oraz w rosnących podskórnie guzach może nie być miarodajna dla kontroli angiogenezy i przerzutów w narządach trzewnych, takich jak płuca, wątroba, kości i mózg. Jest to istotne, ponieważ przerzuty trzewne są zazwyczaj ostatecznie odpowiedzialne za śmiertelność nowotworów.

Fakt, że okno krezkowe ma charakter trzewny, powinien być w tym względzie korzystny. Celem naszego projektu jest ilościowe badanie aspektów angiogenezy de novo. W związku z tym wstrzykujemy do jamy otrzewnej znany czynnik proangiogenny lub substancję testową.

Zazwyczaj wstrzykujemy pięć mililitrów jednorazowo dorosłym szczurom niepoddanym anestezji. Taka objętość szybko wystawia całą krezkę na działanie wstrzykniętego płynu. Każdy roztwór wstrzykiwany do jamy brzusznej, pod warunkiem że jego objętość nie jest zbyt mała, powinien oddziaływać na wszystkie komórki w badanej tkance, zwłaszcza że warstwa komórek mezotelialnych pokrywająca niezwykle cienkie okno krezkowe jest wysoce przepuszczalna dla substancji rozpuszczonych. Ponieważ nie przeprowadza się zabiegu chirurgicznego, angiogeneza badana w oknie krezkowym nie jest wpływana przez angiogenezę indukowaną gojeniem rany, dlatego leczenie angiogenne podaje się w formie wstrzykiwań do jamy brzusznej.

Ze względów praktycznych stosujemy protokół terapeutyczny obejmujący dwa codzienne wstrzyknięcia w okresie pięciu dni, od poniedziałku rano do piątku rano, co jest standardem przy badaniu efektów angiogennych określonych białek, takich jak na przykład VEGF 1 65, 1 64 i podstawowy FGF. Zazwyczaj jako nośnik stosuje się roztwór do infuzji firmy Pharmacia. Liczba zabiegów może wydawać się duża, jednak wykazano, że nie zawsze możliwe jest wywołanie statystycznie istotnej angiogenezy, nawet przy użyciu tak silnych czynników proangiogennych jak VEGF i podstawowy FGF, gdy są one podawane w pojedynczej dawce lub w kilku dawkach w odstępach czasu w stężeniach zbliżonych do fizjologicznych; należy pamiętać, że w tkankach działają silne endogenne inhibitory angiogenezy.

Podawanie terapeutycznych metod modulujących angiogenezę naśladuje sytuację kliniczną. Jeden lub więcej czynników modulujących angiogenezę może być podawany ogólnoustrojowo, podskórnie, dożylnie lub doustnie. Na przykład.

Naśladuje to sytuację leczenia klinicznego, w której można badać wpływ nie tylko cząsteczki macierzystej, ale także jej metabolitów. System ten pozwala na pewien stopień kontroli toksycznych efektów ogólnoustrojowo podawanych czynników modulujących angiogenezę. Ponieważ dorosłe szczury rosną fizjologicznie i mogą zwiększyć masę ciała o około 40% podczas eksperymentu trwającego dwa lub trzy tygodnie, możliwe jest poprzez ważenie zwierząt określenie stopnia, w jakim leczenie spowolniło przyrost masy ciała, co można uznać za przejaw efektów toksycznych.

Umożliwia to unikanie stosowania toksycznych dawek substancji w testach modulujących angiogenezę. Jest to istotna korzyść, ponieważ interpretacja wyników pod kątem specyficznych efektów antyangiogennych mogłaby być niemożliwa. Jeżeli wystąpił efekt toksyczny, należy pamiętać, że dorosłe szczury rosną znacznie szybciej niż dorosłe myszy, zatem wpływ czynników toksycznych na przyrost masy ciała powinien być u szczurów bardziej czułym wskaźnikiem ogólnych efektów toksycznych niż u myszy.

Pragniemy teraz zaprezentować sposób przygotowania preparatów okna krezkowego. Zwierzęta zostały uśmiercone za pomocą CO2. Okna krezkowe rozmieszczono na standardowych szkiełkach przedmiotowych o wymiarach 3x1 cal, zaczynając od dystalnych części krezki.

Angiogenezy nie można zaobserwować gołym okiem w oknie krezkowym, zaczynając od zastawki ileocekalnej i przesuwając się w kierunku wstecznym. Wykorzystuje się cztery okna pobrane z najbardziej dystalnej części krezki. Preparat na szkiełku osuszono w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Odcinamy kikut jelita. Próbki są następnie przechowywane w zamrażarce w temperaturze -20 °C. W ten sposób próbki mogą być przechowywane przez kilka miesięcy, a nawet lat, bez żadnego wyraźnego pogorszenia jakości.

Barwienie wykonuje się przy użyciu przeciwciała monoklonalnego przeciwko śródbłonkowi szczura. Należy pozostawić preparat do wyschnięcia na powietrzu; nie stosować szkiełka zakryjącego. Ilościowe określanie występowania naczyń krwionośnych w poszczególnych oknach krezkowych przeprowadza się za pomocą komputerowej mikroskopii morfometrycznej, wykorzystując mikroskop rysunkowy z całkowitym powiększeniem optycznym od 14 do 34. Wizualizacji poddawane jest całe okno krezkowe.

Powiększenie dobiera się w stałych krokach w taki sposób, aby preparat pokrywał jak największą część pola widzenia. Cały obszar okna jest łatwo do przedstawienia, ponieważ granica między oknem a otaczającą tkanką tłuszczową jest wyraźna. Następnie wszystkie części unaczynione są rysowane zgodnie z dokładnie określonymi kryteriami.

Można wyraźnie dostrzec nawet najmniejsze nowo powstałe naczynia krwionośne, których średnica przy dużych powiększeniach wynosi około 2,5 do 3,0 micrometers. Fakt, że średnia średnica erytrocytów szczura wynosi 6,3 micrometers lub więcej, pokazuje, jak małe są te naczynia. Obszar wszystkich unaczynionych części w oknie, wyrażony jako procent powierzchni całego okna, określa się jako względny obszar unaczynienia va.

W praktyce jest to pomiar rozciągłości przestrzennej naczyń, które posiadają w zasadzie rozszerzenie dwuwymiarowe; VA można łatwo zmierzyć na przykład za pomocą telemetrii wspomaganej komputerowo. Kolejny krok polega na zarejestrowaniu gęstości mikronaczyń i wzorów ich formowania w trzech centralnych częściach obszarów unaczynionych każdego okna. Części te są wybierane systematycznie w sposób losowy przy powiększeniu optycznym 80.

Każde naczynie jest wizualizowane jako pojedyncza linia przy użyciu mikroskopu rysunkowego. Obraz każdego pola widzenia jest przekazywany do obrazu cyfrowego oraz analizatora obrazu, a następnie każde naczynie na obrazie cyfrowym zostaje zredukowane do grubości jednego piksela. Następnie urządzenie mierzy liczbę pikseli reprezentujących naczynia, co jest wyrażone jako ułamek wszystkich pikseli w polu widzenia.

Ta wartość procentowa, długość mikronaczyniowa lub MVL, reprezentuje długość mikronaczyni w każdej jednostce obszaru unaczynionego i stanowi złożony pomiar gęstości mikronaczyni. Poprzez pomnożenie średniej wartości VA z czterech okien na zwierzę przez średnią MVL dla odpowiadającej grupy badawczej, oblicza się całkowitą długość mikronaczyniową na zwierzę, czyli TMVL. Opracowaliśmy ponadto techniki szczegółowej analizy ilościowej gęstości i składu mikronaczyni z wykorzystaniem analizy obrazu.

Obejmują one pomiar rzeczywistej odległości między dwoma kolejnymi mikronaczyniami, punktami rozgałęzień, czyli długości pojedynczych mikronaczyni i segmentów LEMS, liczby mikronaczyni i segmentów na jednostkę objętości tkanki, NOMS, oraz liczby punktów rozgałęzień mikronaczyni na jednostkę objętości tkanki, NOBP. Stopień krętości mikronaczyni MVT jest określany przez różnicę między najkrótszą a rzeczywistą odległością między dwoma kolejnymi punktami rozgałęzień, występowanie krzyżowania się mikronaczyni określone jako indeks przecięcia INIS, oraz tworzenie się pętli łączących. Indeks tworzenia pętli INLF można również dokładnie zmierzyć, stosując podobne techniki na obrzeżach sieci mikronaczyni.

Jesteśmy również w stanie określić ilościowo odpowiadające im zmienne dla wypustek, w tym długość wypustek, LESP oraz liczbę wypustek na jednostkę objętości tkanki, NOSP, projektując próby w taki sposób, aby uwzględnić znaczące różnice, które mogą występować między zwierzętami w tej samej grupie badawczej, a nawet między oknami krezkowymi u tego samego zwierzęcia. Ustaliliśmy, że praktycznym może okazać się następujący schemat: liczba zwierząt w grupie badawczej w czasie obserwacji od 8 do 12, liczba okien na zwierzę analizowanych pod kątem VA, liczba pól widzenia dla każdego okna analizowanego pod kątem długości mikronaczyniowej, MVL, długość segmentów mikronaczyniowych, LEMS, liczba segmentów mikronaczyniowych NOMS, liczba punktów rozgałęzień mikronaczyniowych, NOBP, krętość mikronaczyniowa M VT, indeks przecięć I, indeks tworzenia pętli INF; jako kontrolę wykorzystuje się trzy zwierzęta traktowane placebo. Test angiogenezy w oknie krezkowym jest odpowiedni do badań zależności dawka-efekt oraz do analiz kinetyki angiogenezy.

Można to osiągnąć poprzez podawanie grupom zwierząt różnych dawek czynnika proangiogennego i uśmiercanie tych zwierząt w różnych punktach czasowych w trakcie odpowiedzi angiogennej. W ten sposób można ilościowo wyróżnić fazę ekspansywną, szczyt oraz następującą po nim fazę angioregresyjną. Badania tego rodzaju wykazały, że odpowiedź angiogenna de novo na każdy przetestowany czynnik wzrostu z grupy cytokin jest ściśle zależna od dawki pod względem prędkości, siły działania i czasu trwania.

Co więcej, wzorzec nowych naczyń pod kątem rozszerzenia przestrzennego i zmian w gęstości mikronaczyń jest często wyraźnie zależny od dawki i czasu w porównaniu z angiogenezą indukowaną przez VEGF lub podstawowy FGF w dawkach zbliżonych do fizjologicznych. Angiogeneza pośredniczona przez komórki tuczne, MCMA, wywołana poprzez selektywną aktywację komórek tucznych in situ, charakteryzuje się znacznie wyższą skutecznością i zauważalnie dłuższym czasem trwania. W rzeczywistości angiogeneza pośredniczona przez komórki tuczne została po raz pierwszy opisana przy użyciu tego testu ze względu na możliwość ilościowego określenia obiektywnych zmiennych angiogenezy, wysoką relewantność biologiczną układu oraz możliwość sprawdzenia toksyczności stosowanego leczenia.

Zastosowana metodologia jest wyjątkowo odpowiednia do analiz strukturalno-czynnościowych oraz analizy zależności dawka-odpowiedź. Szczur MWAA stanowi model do badania angiogenezy w dorosłej, natywnie unaczynionej tkance trzewnej, w której nie zachodzi fizjologiczna angiogeneza i która nie jest poddawana operacji, co pozwala wykluczyć jakikolwiek wpływ angiogenezy indukowanej gojeniem ran. Test ten jest w pełni ilościowy i pozwala na precyzyjną ocenę szeregu biologicznie istotnych, obiektywnych zmiennych opisujących zasięg przestrzenny, gęstość oraz sposób formowania wzorów mikronaczyń.

Metoda ta jest odpowiednia do badania systemowych efektów angiogenezy, czynników modulujących, a także do badań zależności struktura-aktywność i odpowiedź na dawkę. Opisana tutaj metodologia została opracowana w laboratorium dr. Klossa Carla Norby’ego w Katedrze Patologii w Szpitalu Uniwersyteckim Reka, jute Uniwersytetu Borg w Göteborgu w Szwecji. Wszystkie badania w ramach tego projektu były wspierane przez Szwedzką Radę Badań Medycznych, numer projektu 5 9 4 2.

Wyrażamy wdzięczność za fachową pomoc techniczną pani Gun Effer, która była zaangażowana w projekt od jego początku, pani Moniki Anderson (nieobecnej) oraz pani Ann Nemar Lindgren.

Mam nadzieję, że ta krótka prezentacja przybliżyła Państwu potencjał tego testu. Jeśli będą Państwo stosować ten test w swoim laboratorium, z chęcią pomogę w przypadku wystąpienia jakichkolwiek problemów technicznych. Będę ponadto bardzo wdzięczny za wszelkie sugestie.

Dziękujemy.