Name: Test angiogenezy krezki szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: Poznaj metodę testowania angiogenezy w krezkach szczura, umożliwiającą ilościową analizę tworzenia naczyń krwionośnych. Technika ta pozwala badaczom oceniać wpływ czynników proangiogennych w modelu naczyniowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe dla większości badań zostało zapewnione przez Szwedzką Radę Badań Medycznych (grant 5942).

1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Jako modele zwierzęce wykorzystywano małe gryzonie, takie jak szczury, myszy i świnki morskie. Niestety, u dorosłych myszy (oceniano wiele szczepów) często brakuje lub występuje bardzo mała liczba potencjalnych naczyń macierzystych (z których może rozpocząć się angiogeneza) w obrębie okna krezkowego, co sprawia, że badania z wykorzystaniem myszy są niewiarygodne. Dlatego test ten opracowano przede wszystkim dla szczurów.</li>
	<li>Szczury, które po dostarczeniu od hodowcy są aklimatyzowane w standardowym środowisku przez co najmniej 7 dni, zazwyczaj przebywają w parach w standardowych klatkach w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności z wolnym dostępem do wody i paszy granulowanej. Każde zwierzę jest oznakowane. Stosujemy głównie młode dorosłe szczury (zazwyczaj w wieku 7–10 tygodni, różnych szczepów, ale najczęściej samce szczurów Sprague-Dawley; u szczurów młodszych niż 5–6 tygodni liczba naturalnych mikronaczyń ma tendencję do bycia niską) pozyskane od różnych hodowców. W okresie poprzedzającym eksperyment oraz w jego trakcie zwierzęta są ważone co drugi dzień, a zawsze również w dniu utylizacji. W przypadku jednoczesnego podawania preparatów i.p. (w celu indukcji angiogenezy, patrz niżej) oraz s.c., i.v. lub p.o., zwierzęta są ważone codziennie. Umożliwia to utworzenie grup eksperymentalnych i kontrolnych o równej masie ciała na początku eksperymentu oraz pozwala na monitorowanie wpływu leczenia na przyrost masy ciała w trakcie trwania badania. Ponieważ dorosłe samce szczurów rozwijają się fizjologicznie w sposób dynamiczny (przybierając około 40–60 g na tydzień w zależności od szczepu), zahamowanie przyrostu masy ciała jest czułym markerem zastępczym toksyczności, ogólnego stanu zdrowia, anoreksji oraz zahamowania wzrostu.</li>
</ol>
Pracujemy w wysokostandardowym ośrodku opieki nad zwierzętami i dokładamy wszelkich starań, aby zminimalizować poziom stresu doświadczanego przez zwierzęta. Obowiązujące wytyczne etyczne są zgodne z zasadami opracowanymi przez Workman P. et al. (Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research. Br. J. Cancer 102, 1555-77, 2010). Badania te zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Zwierząt Uniwersytetu w Göteborgurgu.

2. Proangiogenne leczenie doprzewnowe
<ol>
 <li>Kandydat na czynnik proangiogenny do przetestowania zostaje rozpuszczony i rozcieńczony w soli fizjologicznej wolnej od endotoksyn, stosowanej do infuzji u pacjentów (nawet w skrajnie niskich stężeniach endotoksyna wykazuje działanie proangiogenne). Wszystkie roztwory są przygotowywane na świeżo w dniu wstrzykiwania, filtrowane sterylnie (filtr Millipore 0,22-μm), sprawdzane pod kątem neutralnego pH (7,1-7,3) i podawane w temperaturze pokojowej. 
 Substancja testowa jest wstrzykiwana w niskich lub bardzo niskich stężeniach. Na przykład szczurzy rVEGF164 (564-RV/CF; R&amp;D Systems Europe, Ltd., Oxon, UK), który jest dominującą izoformą VEGF-A u szczurów, jest rozcieńczany do 96 pmole/ml w soli fizjologicznej wolnej od endotoksyn, zamrażany, a następnie rozmrażany, po czym objętość 5 ml jest wstrzykiwana i.p. szczurowi. Do wstrzykiwań i.p. używamy strzykawki 5-ml z igłą 0,8-mm (igła zielona, 21G). Taka terapia, stosowana dwa razy dziennie przez 4,5 dnia, t.j. od poniedziałku rano (Dzień 0) do piątku rano (Dzień 4), indukuje silną odpowiedź angiogenezy kiełkującej w testowanej tkance krezowej, osiągającą szczyt około 21. dnia. 
 Podawanie roztworu i.p. zapewnia dostarczenie całej objętości do jamy otrzewnej (a nie do jelit, pęcherza czy jakiegokolwiek innego narządu). Szybkie wstrzyknięcie 5 ml pozwala operatorowi taktylnie potwierdzić, że strumień cieczy przeszedł przez ścianę brzuszną do jamy brzusznej. 
 Następnie, przed lub równocześnie z proangiogenną terapią i.p., można systemicznie podać dowolną wybraną substancję testową.
 </li>
</ol>
3. Systemiczne podawanie czynników modulujących angiogenezę
<ol>
	<li>Można zastosować każdą inną drogę podania niż droga dosytnynowa (i.p.), ponieważ leczenie i.p. może wpływać na przebieg reakcji angiogennej poprzez indukcję stanu zapalnego lub potencjalną aktywację komórek tucznych w badanej tkance, co może prowadzić do silnej odpowiedzi proangiogennej. Oprócz podawania doustnego lub pojedynczego wstrzyknięcia podskórnie (s.c.) lub dożylnie (i.v.), często stosujemy podawanie s.c. za pomocą osmotycznych minipomp (jednej lub większej liczby pomp, o różnych objętościach i czasach pompowania), aby dostarczać roztwór ze stałą prędkością przez okres do dwóch lub kilku tygodni.</li>
	<li>Ciągła infuzja podskórna substancji badanych 
	Napełnianie i implantacja osmotycznych minipomp 
	Zazwyczaj w 5. dniu, t.j. jeden dzień po zakończeniu leczenia i.p. VEGF, osmotyczne minipompy (na przykład model 2ML2, o stałej prędkości pompowania 5,0 μl/h przez 14-15 dni; Alzet Osmotic Pumps, Mountain View, CA, USA) są napełniane w warunkach sterylnych substancją badaną lub odpowiednim nośnikiem. Po przechowywaniu w sterylnym 0,9% (w/v) NaCl przez noc w temperaturze 37°C, pompę(pompy) implantuje się chirurgicznie s.c. na grzbietach (przy kręgosłupie w okolicy łopatek) szczurów znieczulonych izofluranem (Isoba vet; Schering-Plough Animal Health, Merck &amp; Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, USA), początkowo w szczelnej przezroczystej komorze, a następnie za pomocą maski (aby zminimalizować stres u kolejnego zwierzęcia, komorę przepłukuje się powietrzem przed ponownym użyciem). Cięcie skóry wykonane w celu implantacji pompy zostaje zaszyte nicią jedwabną natychmiast po implantacji. 
	Ponieważ zwierzęta fizjologicznie przybierają na wadze w okresie eksperymentalnym, a substancje badane są podawane ze stałą prędkością, faktyczna dawka leku badanego wybrana na kg masy ciała jest wyższa niż średnia dawka na początku okresu infuzji i niższa niż średnia dawka na koniec okresu infuzji. Ciągła infuzja, opisana w niniejszym protokole, może być postrzegana jako rozszerzona forma leczenia metronomicznego.
	</li>
</ol>
 4. Zakończenie eksperymentu
 <ol>
 <li>Jedno zwierzę na raz umieszcza się w przezroczystej szczelnej komorze, którą przepłukuje się gazem CO2, co prowadzi do szybkiej śmierci zwierzęcia. Przed ponownym użyciem komorę przepłukuje się powietrzem.</li>
</ol>
5. Pobieranie próbek tkanki
<ol>
 <li>Zgodnie z materiałem na DVD, należy otworzyć ścianę brzuszną i zidentyfikować krezkę jelita cienkiego, w tym jej najbardziej dystalną część sięgającą zastawki krzyliczo-kątniczej (miejsca połączenia jelita cienkiego z jelitem grubym). Cztery (lub więcej) najbardziej dystalnie położonych „okien” krezki należy ponumerować i rozprowadzić na standardowych, nieobrobionych szkiełkach obiektowych Superfrost Plus (DAKO Denmark A/S, Glostrup, Dania). Należy w miarę możliwości unikać zanieczyszczenia próbek krwią, treścią jelitową lub innymi płynami ustrojowymi, ponieważ materiały te mogą ulec nieswoistemu barwieniu, choć nie unieważnia to późniejszej wizualizacji immunohistochemicznej mikro naczyń.</li>
 <li>Każdy preparat okna krezki z przytwierdzonym segmentem jelita cienkiego należy rozprowadzić na szkiełku i suszyć w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie odcina się kikut jelita, a nienaruszone preparaty błoniaste krezki przechowuje w temperaturze -20°C przez dłuższy czas. Jest to pokazane na DVD.</li> 
</ol>
Należy wspomnieć, że tkankę oraz drożne naczynia krwionośne można zwizualizować przed pobraniem za pomocą intravitalnej mikroskopii w świetle przechodzącym.
6. Protokół barwienia immunohistochemicznego mikronaczyń
<ol>
	<li>Dzień 0 
	Próbki rozmraża się z -20°C do temperatury pokojowej, suszy w szafce w temperaturze 60°C przez 1 h, a następnie pozostawia w temperaturze pokojowej na noc.
	</li>
	<li>Dzień 1 
	PrzeszkCia umieszcza się w uchwytach do barwienia (w co drugim rowku) w naczyniu do barwienia i płucze dwukrotnie w TBS (pH 7.8) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór jest odrzucany i zastępowany kolejnym roztworem, analogicznie w każdym z następujących kroków.</li>
	<li>Obróbka trypsyną 
	Naczynie do barwienia, w którym znajduje się uchwyt do szkiełek, napełnia się roztworem trypsyny (25°C przez 20 minut). Roztwór odrzuca się i dwukrotnie inkubuje w 2,5% roztworze sacharozy (temperatura pokojowa po 10 minut za każdym razem). Roztwór odrzuca się i kilka razy płucze w aqua dest (temperatura pokojowa przez kilka minut za każdym razem).
	</li>
	<li>Blokowanie 
	Naczynie do barwienia, w którym znajduje się uchwyt do szkiełek, napełnia się 0,5% H2O2 w metanolu (temperatura pokojowa przez 30 minut). Roztwór odrzuca się i płucze w aqua dest (temperatura pokojowa przez kilka minut). Roztwór odrzuca się i płucze dwukrotnie w TBS (pH 7.4) (temperatura pokojowa po 8 minut za każdym razem).
	</li>
	<li>
	Inkubacja 
	Wszystkie inkubacje przeprowadzane są w komorze nawilżanej w temperaturze pokojowej. Na każde szkiełko nanosi się około 150 μl każdego z wymienionych poniżej roztworów. Szkiełka umieszcza się w komorze nawilżanej, a roztwory nanosi pipetą na próbki (części niebłoniaste nie muszą być pokryte roztworami). 
	Przed dodaniem kolejnego roztworu, w każdym z poniższych kroków, należy ostrożnie wstrząsnąć szkiełko, aby usunąć cały poprzedni roztwór.
		<ol>
			<li>Inkubacja z normalnym serum blokującym (końskie) (zestaw ABC)
			3 krople żółtego roztworu/10 ml buforu do rozcieńczania przez 20 minut.
			</li>
			<li>Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym ARU0181, które znakuje naczyniowe komórki śródbłonka szczura. Przeciwciało rozcieńcza się 1:600 w buforze do rozcieńczania (Biosource) (100 μl rozcieńczone 40-krotnie [zamrożone] plus 900 μl buforu do rozcieńczania); inkubacja odbywa się przez noc w 4°C.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2 
	Szkiełka wyjmuje się z komory nawilżanej, usuwa przeciwciało pierwszorzędowe, a następnie umieszcza szkiełka w uchwycie do barwienia, który zanurza się w naczyniu do barwienia i płucze dwukrotnie w TBS (pH 7.8) przez 8 minut.
		<ol>
			<li>Inkubacja z przeciwciałem biotynylowanym (zestaw ABC) 
			Szkiełka układa się poziomo w komorze nawilżanej i inkubuje z 1 kroplą niebieskiego roztworu/10 ml buforu do rozcieńczania przez 30 minut. Roztwór odrzuca się, a szkiełka umieszcza w uchwycie w naczyniu do barwienia i płucze dwukrotnie w TBS (pH 7.4) przez 8 minut.
			</li><li> Inkubacja z odczynnikiem ABC 
Szkiełka ponownie układa się poziomo w komorze nawilżanej i nanosi pipetą na części błoniaste próbek następujące roztwory: 2 krople pomarańczowego roztworu plus 2 krople brązowego roztworu/10 ml TBS (pH 7.4) przez 30 minut. Wymieszać dokładnie 30 minut przed użyciem! Roztwór odrzuca się, a szkiełka umieszcza w uchwycie w naczyniu do barwienia i płucze dwukrotnie w TBS (pH 7.4) przez 8 minut.
</li>
</ol>
</li>
<li>
Barwienie DAB (0,05%) 
Ten etap musi być wykonany w wentylowanej komorze chemicznej! 
Szkiełka przygotowuje się i nanosi pipetą roztwór 3,3-diaminobenzydyny (DAB; Sigma-Aldrich): 0,1% roztwór DAB w TBS (pH 7.4) [zamrożony] rozcieńcza się 1:1 z mieszaniną 10 μl H2O2 i 7,5 ml TBS (pH 7.4). Roztwór ten filtruje się sterylnie bezpośrednio przed użyciem (aby usunąć wszelkie cząsteczki, które mogłyby zaburzyć obraz mikroskopowy). Próbki barwi się przez 8 minut. Roztwór odrzuca się, a szkiełka umieszcza w uchwycie w naczyniu do barwienia. Płucze się pod bieżącą wodą z kranu, a następnie w aqua dest przez kilka minut.
</li>
<li>Odwodnienie 
Szkiełka pozostają w uchwycie do barwienia. Płukanie odbywa się poprzez odlewanie i ponowne napełnianie naczynia do barwienia zawierającego aqua dest/etanol: aqua dest, 70% alkohol, 95% alkohol, alkohol absolutny, po 2 minuty w każdym roztworze.</li>
</ol>
7. Obrazowanie i ocena sieci mikro naczyniowej w każdym preparacie okna krezowego po barwieniu immunohistochemicznym komórek śródbłonka naczyniowego
Jak pokazano w filmie, mikronaczynia są wizualizowane mikroskopowo in situ w nienaruszonym tkance.
<ol>
	<li>Najpierw, używając mikroskopu rysunkowego z zakresem powiększenia od 14 do 34 (Leica Wild M 3Z), odrysowujemy ołówkiem na białej kartce cały obszar okna, a także cały obszar unaczyniony (VA) w obrębie okna krezowego. VA, jako procent całego obszaru, można łatwo zmierzyć za pomocą planimetrii komputerowej lub niekomputerowej (lub po prostu poprzez wycięcie i zważenie obrazu całego okna oraz obrazów wszystkich jego unaczynionych części).</li>
	<li>Używając innego mikroskopu rysunkowego, poszczególne profile mikronaczyni, które są łatwo identyfikowalne, rysuje się czarnym tuszem na białej kartce przy powiększeniu 80 w losowo wybranych polach. Jest to punkt wyjścia do późniejszej komputerowej oceny morfometrycznej długości mikronaczyni (MVL), która w zasadzie jest pomiarem gęstości mikronaczyni.</li>
	<li>Opcjonalnie można wyznaczyć zmienne związane z formowaniem wzorca mikronaczyni oraz zmienne służące do oceny liczby pączków mikronaczyniowych oraz długości poszczególnych pączków mikronaczyniowych (odpowiednio No. SP i Le. SP). Optymalny kontrast między przedstawionymi czarnymi strukturami naczyń a białym tłem ułatwia szczegółową analizę obrazów w większości komercyjnych komputerowych programów morfometrycznych.</li>
	<li>W większości przypadków głównymi zmiennymi są VA i MVL, których iloczyn daje całkowitą długość mikronaczyni (TMVL).</li>
</ol> 
8. Analiza statystyczna
Zazwyczaj do analizy obserwacji nieparowanych (obustronnych) stosujemy standardowy nieparametryczny test U Mann-Whitney'a. Jako niezależny punkt danych dla każdej zmiennej okna krezkowego przyjmuje się średnią z czterech okien krezkowych na zwierzę. Kryterium istotności statystycznej wynosi P ≤ 0,05.

<ol><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+models+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo models of angiogenesis.</a> J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+testing+with+angiogenesis+models%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">Drug testing with angiogenesis models.</a> Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).</li>
<li>Norrby, K., Jakobsson, A., Sorbo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast-cell-mediated+angiogenesis%3A+a+novel+experimental+model+using+the+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch.+B+Cell.+Pathol.+Incl.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mast-cell-mediated angiogenesis: a novel experimental model using the rat mesentery.</a> Virchows Arch. B Cell. Pathol. Incl. Mol. Pathol. 52, 195-206 (1986).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Mast cells and angiogenesis.</a> APMIS. 110, 355-371 (2002).</li>
<li>Albertsson, P., Lennernas, B., Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+meteronomic+chemotherapy%3A+modulation+of+angiogenesis+mediated+by+VEGF-A%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">On meteronomic chemotherapy: modulation of angiogenesis mediated by VEGF-A.</a> Acta Oncol. 45, 144-155 (2006).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+apo-lactoferrin+enhances+angiogenesis+mediated+by+vascular+endothelial+growth+factor+A+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Human apo-lactoferrin enhances angiogenesis mediated by vascular endothelial growth factor A in vivo.</a> J. Vasc. Res. 41, 293-304 (2004).</li>
<li>Norrby, K., Mattsby-Baltzer, I., Innocenti, M., &amp, T. uneberg, S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orally+administered+bovine+lactoferrin+systemically+inhibits+VEGF%28165%29-mediated+angiogenesis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Orally administered bovine lactoferrin systemically inhibits VEGF(165)-mediated angiogenesis in the rat.</a> Int. J. Cancer. 91, 236-240 (2001).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-molecular-weight+heparins+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Low-molecular-weight heparins and angiogenesis.</a> APMIS. 114, 79-102 (2006).</li>
<li>Norrby, K., Nordenhem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dalteparin%2C+a+low-molecular-weight+heparin%2C+promotes+angiogenesis+mediated+by+heparin-binding+VEGF-A+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Dalteparin, a low-molecular-weight heparin, promotes angiogenesis mediated by heparin-binding VEGF-A in vivo.</a> APMIS. 118, 949-957 (2010).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res.%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res.. 48, 96-113 (1994).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 51, 153-163 (1996).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+density+in+terms+of+number+and+length+of+microvessel+segments+per+unit+tissue+volume+in+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular density in terms of number and length of microvessel segments per unit tissue volume in mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 55, 43-53 (1998).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Test wprowadzono w 1986 roku3, a następnie sukcesywnie rozwijano i udoskonalano w naszym laboratorium7,10-12. Jak omówiono w artykułach przeglądowych (zaproszonych)1, 2, metoda ta wypada korzystnie w porównaniu z innymi testami angiogenezy in vivo u ssaków, szczególnie w odniesieniu do kluczowych cech, takich jak: zastosowanie tkanki testowej u osobników dorosłych, która jest naturalnie unaczyniona i nie wykazuje fizjologicznej angiogenezy; minimalny stopień urazu tkanki (jeśli taki występuje); pomiar rzeczywistych zmiennych ilościowych, co umożliwia rzetelną analizę statystyczną w badaniach zależności dawka-odpowiedź oraz aktywności molekularnej; występowanie angiogenezy pączkującej, która dominuje w tkankach prawidłowych i nowotworach; oraz łatwość gromadzenia danych o toksyczności u szczurów, które wykazują prawidłowy, silny wzrost w wieku dorosłym. Do wad metody może należeć fakt, że test jest stosunkowo czasochłonny, zwłaszcza przy ocenie liczby i długości poszczególnych segmentów mikronaczyń oraz pączków mikronaczyniowych; brak możliwości obserwacji w czasie rzeczywistym lub obserwacji seryjnych; a także niska przydatność w przypadku myszy, ponieważ wiele okien krezkowych u myszy nie posiada potencjalnych naczynia macierzystego, z którego mogłyby powstać nowe kapilary.
Obserwacje w czasie rzeczywistym są jednak możliwe dzięki mikroskopii intravitalnej, w której eksternalizowane, ale nienaruszone okna krezkowe są rozłożone na stole mikroskopu podczas znieczulenia zwierzęcia, jak omówiono w1.
W ciągu ostatnich dziesięcioleci, dzięki zastosowaniu takich modeli jak mikrokieszonki rogówkowe, błona sieciowato-owocznia kurczaka oraz testy z zatyczkami z Matrigelu podskórnie, osiągnięto znaczące postępy w badaniach nad angiogenezą; są to narzędzia użyteczne, lecz w ostateczności ograniczone. Przyszłe zastosowania kliniczne terapii antyangiogennych i proangiogennych wymagają opracowania i walidacji bardziej czułych, biologicznie istotnych i w pełni ilościowych modeli przedklinicznych, takich jak model opisany w niniejszym raporcie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Bufor i odczynniki</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;roztwór zasadniczy 0,5 M Tris-HCl (pH 7,8)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;Tris(hydroksymetyl)aminometan (60,57 g) rozpuszcza się w ok. 900 ml &lt;em&gt;woda destylowana&lt;/em&gt; i dodaje się ok. 45 ml 25% HCl (stężonego) w celu uzyskania pH 7,8, a następnie rozcieńcza do 1 litra za pomocą &lt;em&gt;woda destylowana&lt;/em&gt;.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Bufor solno-trisowy (TBS; pH 7,8) &lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;Do 200 ml roztworu stokowego dodaje się 18 g NaCl rozpuszczonych w ok. 1800 ml &lt;em&gt;woda destylowana&lt;/em&gt; z dostosowaniem pH do wartości 7,8 przy użyciu roztworu zapasowego, a następnie rozcieńczeniem do 2 litrów za pomocą &lt;em&gt;woda destylowana&lt;/em&gt;.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;TBS (pH 7,4)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;Do 200 ml roztworu zapasu dodaje się 18 g NaCl rozpuszczonych w ok. 1800 ml &lt;em&gt;woda destylowana&lt;/em&gt; z dopasowaniem pH do 7,4 przy użyciu roztworu zapasowego, a następnie rozcieńczeniem do 2 litrów za pomocą &lt;em&gt;woda destylowana&lt;/em&gt;.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Roztwór trypsyny (0,05% trypsyny, 0,1% CaCl2)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;Zawiera 0,1 g trypsyny i 0,2 g CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; w 200 ml buforu TBS (pH 7,8).</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Roztwór sacharozy 2,5%&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;Zawiera 5 g sacharozy w 200 ml buforu TBS (pH 7,8).</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Roztwór stokowy 1% azotku sodu w buforze TBS (pH 7,4)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;Zawiera 1 g azotku sodu w 100 ml buforu TBS (pH 7,4).</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Bufor rozcieńczający: 0,1% BSA, 0,01% azotku sodu&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;(Stosowany do rozcieńczania przeciwciał w zestawie Vectastain ABC). Zawiera 0,1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz 1 ml 1% azotku sodu, rozcieńczone do 100 ml buforem TBS (pH 7,4).</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Zestaw ABC Vectastain PK 4002, peroksydaza ABC przeciwciała IgG mysie&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;Normalny surowica konia; surowica blokująca; &lt;em&gt;żółty roztwór&lt;/em&gt;: 3 krople/10 ml buforu do rozcieńczania.&lt;br/&gt;Przeciwciało biotynilowane; przeciwciało przeciwko IgG mysiem; &lt;em&gt;niebieski roztwór&lt;/em&gt;: 1 kropla/10 ml buforu do rozcieńczania.&lt;br/&gt;Odczynnik ABC: &lt;em&gt;pomarańczowy roztwór&lt;/em&gt;, 2 krople oraz &lt;em&gt;brązowy roztwór&lt;/em&gt; 2 krople/10 ml TBS (pH 7,4). </td></tr><tr><td colspan="4">Mieszaj te roztwory przez 20 minut &lt;strong&gt;przed&lt;/strong&gt; użyć!</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Przeciwciało mysie (monoklonalne) przeciwko śródbłonkowi szczura&lt;/strong&gt;(Biosource International, Camarillo, CA, USA)</td></tr><tr><td colspan="4">Przeciwciało to jest skierowane przeciwko wszystkim komórkom śródbłonka naczyniowego u szczura, z wyjątkiem komórek znajdujących się w mózgu.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Zestaw Vectastain do kompleksu awidyna-biotyna (ABC) z peroksydazą&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;Zestaw zawiera przeciwciało pierwotne, biotynilowane przeciwciało wtórne, kompleks enzymatyczny awidyna-biotyna (ABC) oraz substrat enzymatyczny. Patrz &lt;a href=&quot;http://www.vectorlabs.com/&quot;&gt;www.vectorlabs.com&lt;/a&gt; lub &lt;a href=&quot;http://www.immunkemi.se/&quot;&gt;www.immunkemi.se&lt;/a&gt; do protokołów.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Albumin surowicy bydlęcej&lt;/strong&gt;(BSA) (Sigma-Aldrich, nr katalogowy A-4503).&lt;br/&gt;&lt;strong&gt;DAB&lt;/strong&gt;= 3,3&amp;rsquo;-Diaminobencydyna Isopac (Sigma-Aldrich, nr katalogowy D 9015).&lt;br/&gt;&lt;strong&gt;Trypsyna&lt;/strong&gt;z trzustki bydlęcej (Sigma-Aldrich, nr katalogowy T 4665).&lt;br/&gt;&lt;strong&gt;Zestaw Vectastain peroxidase ABC&lt;/strong&gt;, IgG mysie (Immunkemi F &amp;amp; D AB, Jarfalla, Szwecja)</td></tr></tbody></table>

test angiogenezy w krezoni szczura

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

Test angiogenezy w oknie krezkowym dorosłego szczura jest biologicznie odpowiedni i wyjątkowo dobrze nadaje się do badania angiogenezy kiełkującej in vivo [patrz prace przeglądowe], która jest dominującą formą angiogenezy w ludzkich nowotworach i tkankach pozanowotworowych, jak omówiono w zaproszonych pracach przeglądowych1,2. Angiogenezę indukowaną w błonistych częściach krezki poprzez podanie dootrzewnowe (i.p.) czynnika proangiogennego można modulować za pomocą podania podskórnego (s.c.), dożylnego (i.v.) lub doustnego (p.o.) wybranych czynników modyfikujących. Każda błonista część krezki jest półprzezroczysta i obramowana tkanką tłuszczową, co nadaje jej wygląd przypominający okno.
Test ten posiada następujące zalety: (i) badana tkanka jest naturalnie unaczyniona, choć w niewielkim stopniu, a ze względu na to, że jest niezwykle cienka, sieć mikronaczyniowa jest praktycznie dwuwymiarowa, co pozwala na mikroskopową ocenę całej sieci in situ; (ii) u dorosłych szczurów badana tkanka nie wykazuje znaczącej fizjologicznej angiogenezy, która charakteryzuje większość normalnych tkanek dorosłych ssaków; stopień naturalnego unaczynienia jest jednak skorelowany z wiekiem, co omówiono w1; (iii) pomijalny poziom angiogenezy indukowanej urazem zapewnia wysoką czułość; (iv) test odzwierciedla sytuację kliniczną, ponieważ badane leki modulujące angiogenezę są podawane systemowo, a obserwowane odpowiedzi odzwierciedlają efekt netto wszystkich zmian metabolicznych, komórkowych i molekularnych wywołanych leczeniem; (v) test umożliwia obiektywną, ilościową i bezstronną ocenę zmiennych dotyczących przestrzennego zasięgu mikronaczyniowego, gęstości i formowania wzorca sieci, a także kiełkowania naczyń włosowatych, co pozwala na rzetelną analizę statystyczną zależności dawka-efekt oraz struktura molekularna-aktywność; oraz (vi) test z wysoką czułością ujawnia toksyczne lub szkodliwe efekty leczenia w postaci obniżonego tempa fizjologicznego przyrostu masy ciała, ponieważ dorosłe szczury rozwijają się dynamicznie.
Angiogeneza indukowana przez komórki tuczne została po raz pierwszy wykazana przy użyciu tego testu3,4. Model ten wykazuje wysoki stopień rozróżnienia w odniesieniu do zależności dawka-efekt oraz mierzalnych efektów systemicznie podawanych leków i białek blisko spokrewnionych chemicznie lub funkcjonalnie, w tym: (i) standardowych chemioterapeutyków podawanych metronomicznie w niskich dawkach, które wywołują zróżnicowane, specyficzne dla danego leku efekty (t.j. działanie hamujące angiogenezę, neutralne lub stymulujące angiogenezę5); (ii) naturalnej, nienasyconej żelazem ludzkiej laktoferyny, która stymuluje angiogenezę zależną od VEGF-A6, oraz naturalnej, nienasyconej żelazem bydlęcej laktoferyny, która hamuje angiogenezę zależną od VEGF-A7; oraz (iii) frakcji heparyny o niskiej masie cząsteczkowej otrzymywanych różnymi metodami8,9. Ponadto test ten jest wysoce odpowiedni do badań nad skumulowanym efektem na angiogenezę substancji podawanych systemicznie w sposób jednoczesny lub sekwencyjny.
Pomysł stworzenia tego filmu pojawił się u zmarłego dr. Judaha Folkmana, gdy odwiedził nasze laboratorium i zapoznał się z prezentowaną metodologią.
Artykuły przeglądowe (zaproszone), omawiające i oceniające analizę
Norrby, K. In vivo modele angiogenezy. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Badania nad lekami z wykorzystaniem modeli angiogenezy. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normalna unaczyniona tkanka ssaka dorosłego, w której nie zachodzi fizjologiczna angiogeneza i która nie była poddana interwencji chirurgicznej, jest wykorzystywana do badania: (i) inicjacji i rozwoju angiogenezy po podaniu środków testowych do jamy otrzewnej; oraz (ii) modyfikacji angiogenezy po systemowym podaniu wybranych środków testowych.

Test angiogenezy w krezoni szczura

Test angiogenezy w oknie krezowym dorosłego szczura jest odpowiedni biologicznie i wyjątkowo dobrze nadaje się do badania angiogenezy kiełkującej w...

Witamy w Zakładzie Patologii w szpitalu uniwersyteckim GaN w Guttenburgu w Szwecji. Jestem dr Klaus Norby, a metoda, którą zaraz Państwo zobaczą, została opracowana w moim laboratorium. Angiogeneza istotna klinicznie, która występuje w związku z hipoksją, guzami litymi lub jakąkolwiek inną chorobą angiogenną, zachodzi niemal wyłącznie w tkance naturalnie unaczynionej. U dorosłych małych gryzoni krezka, która łączy jelito cienkie z tylną ścianą ciała, zawiera szereg cienkich części błoniastych. U szczurów znajduje się od 40 do 50 takich okien krezkowych. Są one praktycznie przezroczyste i dla gołego oka przypominają okna; u dorosłych samców szczurów każde okno jest otoczone tkanką tłuszczową.Okna krezkowe są naturalnie unaczynione i nie wykazują mierzalnej fizjologicznej angiogenezy. Stwarzają one zatem możliwość badania angiogenezy de novo w unaczynionej tkance ssaków u osobników dorosłych. Chodzi o zainicjowanie pełnej odpowiedzi angiogennej od podstaw, przy pokonaniu inhibitorów angiogenezy działających endogennie w badanej tkance, jak w przypadku wszystkich normalnych tkanek u myszy; w wielu oknach brak jest natywnych mikronaczyń, które mogłyby pełnić rolę naczyń macierzystych, co niestety sprawia, że test w formie natywnej jest u myszy nieprzewidywalny.Okna krezkowe u szczurów u osobników dorosłych zawierają zazwyczaj stosunkowo niewielką liczbę małych naczyń krwionośnych zlokalizowanych na obwodzie. Okna krezkowe te mają naturalnie grubość od 5 do 10 µm. Pozwala to na rozłożenie nienaruszonej tkanki na szkiełkach i obserwację mikroskopową, co umożliwia obejrzenie wszystkich naczyń w każdym oknie i nadaje im w zasadzie dwuwymiarowy charakter.Metoda ta oferuje niezrównaną możliwość dokonywania pomiarów ilościowych w zakresie rozległości przestrzennej, gęstości, formowania wzorców oraz rozmiaru mikroznaczyni krwionośnych. Miejsce podskórne jest popularne w badaniach nad angiogenezą, jednak ze względu na heterogenność komórek śródbłonkowych i specyficzne właściwości tkanek, kontrola angiogenezy w tkankach podskórnych oraz w rosnących podskórnie guzach może nie być miarodajna dla kontroli angiogenezy i przerzutów w narządach trzewnych, takich jak płuca, wątroba, kości i mózg. Jest to istotne, ponieważ przerzuty trzewne są zazwyczaj ostatecznie odpowiedzialne za śmiertelność nowotworów.Fakt, że okno krezkowe ma charakter trzewny, powinien być w tym względzie korzystny. Celem naszego projektu jest ilościowe badanie aspektów angiogenezy de novo. W związku z tym wstrzykujemy do jamy otrzewnej znany czynnik proangiogenny lub substancję testową.Zazwyczaj wstrzykujemy pięć mililitrów jednorazowo dorosłym szczurom niepoddanym anestezji. Taka objętość szybko wystawia całą krezkę na działanie wstrzykniętego płynu. Każdy roztwór wstrzykiwany do jamy brzusznej, pod warunkiem że jego objętość nie jest zbyt mała, powinien oddziaływać na wszystkie komórki w badanej tkance, zwłaszcza że warstwa komórek mezotelialnych pokrywająca niezwykle cienkie okno krezkowe jest wysoce przepuszczalna dla substancji rozpuszczonych. Ponieważ nie przeprowadza się zabiegu chirurgicznego, angiogeneza badana w oknie krezkowym nie jest wpływana przez angiogenezę indukowaną gojeniem rany, dlatego leczenie angiogenne podaje się w formie wstrzykiwań do jamy brzusznej.Ze względów praktycznych stosujemy protokół terapeutyczny obejmujący dwa codzienne wstrzyknięcia w okresie pięciu dni, od poniedziałku rano do piątku rano, co jest standardem przy badaniu efektów angiogennych określonych białek, takich jak na przykład VEGF 1 65, 1 64 i podstawowy FGF. Zazwyczaj jako nośnik stosuje się roztwór do infuzji firmy Pharmacia. Liczba zabiegów może wydawać się duża, jednak wykazano, że nie zawsze możliwe jest wywołanie statystycznie istotnej angiogenezy, nawet przy użyciu tak silnych czynników proangiogennych jak VEGF i podstawowy FGF, gdy są one podawane w pojedynczej dawce lub w kilku dawkach w odstępach czasu w stężeniach zbliżonych do fizjologicznych; należy pamiętać, że w tkankach działają silne endogenne inhibitory angiogenezy.Podawanie terapeutycznych metod modulujących angiogenezę naśladuje sytuację kliniczną. Jeden lub więcej czynników modulujących angiogenezę może być podawany ogólnoustrojowo, podskórnie, dożylnie lub doustnie. Na przykład.Naśladuje to sytuację leczenia klinicznego, w której można badać wpływ nie tylko cząsteczki macierzystej, ale także jej metabolitów. System ten pozwala na pewien stopień kontroli toksycznych efektów ogólnoustrojowo podawanych czynników modulujących angiogenezę. Ponieważ dorosłe szczury rosną fizjologicznie i mogą zwiększyć masę ciała o około 40% podczas eksperymentu trwającego dwa lub trzy tygodnie, możliwe jest poprzez ważenie zwierząt określenie stopnia, w jakim leczenie spowolniło przyrost masy ciała, co można uznać za przejaw efektów toksycznych.Umożliwia to unikanie stosowania toksycznych dawek substancji w testach modulujących angiogenezę. Jest to istotna korzyść, ponieważ interpretacja wyników pod kątem specyficznych efektów antyangiogennych mogłaby być niemożliwa. Jeżeli wystąpił efekt toksyczny, należy pamiętać, że dorosłe szczury rosną znacznie szybciej niż dorosłe myszy, zatem wpływ czynników toksycznych na przyrost masy ciała powinien być u szczurów bardziej czułym wskaźnikiem ogólnych efektów toksycznych niż u myszy.Pragniemy teraz zaprezentować sposób przygotowania preparatów okna krezkowego. Zwierzęta zostały uśmiercone za pomocą CO2. Okna krezkowe rozmieszczono na standardowych szkiełkach przedmiotowych o wymiarach 3x1 cal, zaczynając od dystalnych części krezki.Angiogenezy nie można zaobserwować gołym okiem w oknie krezkowym, zaczynając od zastawki ileocekalnej i przesuwając się w kierunku wstecznym. Wykorzystuje się cztery okna pobrane z najbardziej dystalnej części krezki. Preparat na szkiełku osuszono w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Odcinamy kikut jelita. Próbki są następnie przechowywane w zamrażarce w temperaturze -20 °C. W ten sposób próbki mogą być przechowywane przez kilka miesięcy, a nawet lat, bez żadnego wyraźnego pogorszenia jakości.Barwienie wykonuje się przy użyciu przeciwciała monoklonalnego przeciwko śródbłonkowi szczura. Należy pozostawić preparat do wyschnięcia na powietrzu; nie stosować szkiełka zakryjącego. Ilościowe określanie występowania naczyń krwionośnych w poszczególnych oknach krezkowych przeprowadza się za pomocą komputerowej mikroskopii morfometrycznej, wykorzystując mikroskop rysunkowy z całkowitym powiększeniem optycznym od 14 do 34. Wizualizacji poddawane jest całe okno krezkowe.Powiększenie dobiera się w stałych krokach w taki sposób, aby preparat pokrywał jak największą część pola widzenia. Cały obszar okna jest łatwo do przedstawienia, ponieważ granica między oknem a otaczającą tkanką tłuszczową jest wyraźna. Następnie wszystkie części unaczynione są rysowane zgodnie z dokładnie określonymi kryteriami.Można wyraźnie dostrzec nawet najmniejsze nowo powstałe naczynia krwionośne, których średnica przy dużych powiększeniach wynosi około 2,5 do 3,0 micrometers. Fakt, że średnia średnica erytrocytów szczura wynosi 6,3 micrometers lub więcej, pokazuje, jak małe są te naczynia. Obszar wszystkich unaczynionych części w oknie, wyrażony jako procent powierzchni całego okna, określa się jako względny obszar unaczynienia va.W praktyce jest to pomiar rozciągłości przestrzennej naczyń, które posiadają w zasadzie rozszerzenie dwuwymiarowe; VA można łatwo zmierzyć na przykład za pomocą telemetrii wspomaganej komputerowo. Kolejny krok polega na zarejestrowaniu gęstości mikronaczyń i wzorów ich formowania w trzech centralnych częściach obszarów unaczynionych każdego okna. Części te są wybierane systematycznie w sposób losowy przy powiększeniu optycznym 80.Każde naczynie jest wizualizowane jako pojedyncza linia przy użyciu mikroskopu rysunkowego. Obraz każdego pola widzenia jest przekazywany do obrazu cyfrowego oraz analizatora obrazu, a następnie każde naczynie na obrazie cyfrowym zostaje zredukowane do grubości jednego piksela. Następnie urządzenie mierzy liczbę pikseli reprezentujących naczynia, co jest wyrażone jako ułamek wszystkich pikseli w polu widzenia.Ta wartość procentowa, długość mikronaczyniowa lub MVL, reprezentuje długość mikronaczyni w każdej jednostce obszaru unaczynionego i stanowi złożony pomiar gęstości mikronaczyni. Poprzez pomnożenie średniej wartości VA z czterech okien na zwierzę przez średnią MVL dla odpowiadającej grupy badawczej, oblicza się całkowitą długość mikronaczyniową na zwierzę, czyli TMVL. Opracowaliśmy ponadto techniki szczegółowej analizy ilościowej gęstości i składu mikronaczyni z wykorzystaniem analizy obrazu.Obejmują one pomiar rzeczywistej odległości między dwoma kolejnymi mikronaczyniami, punktami rozgałęzień, czyli długości pojedynczych mikronaczyni i segmentów LEMS, liczby mikronaczyni i segmentów na jednostkę objętości tkanki, NOMS, oraz liczby punktów rozgałęzień mikronaczyni na jednostkę objętości tkanki, NOBP. Stopień krętości mikronaczyni MVT jest określany przez różnicę między najkrótszą a rzeczywistą odległością między dwoma kolejnymi punktami rozgałęzień, występowanie krzyżowania się mikronaczyni określone jako indeks przecięcia INIS, oraz tworzenie się pętli łączących. Indeks tworzenia pętli INLF można również dokładnie zmierzyć, stosując podobne techniki na obrzeżach sieci mikronaczyni.Jesteśmy również w stanie określić ilościowo odpowiadające im zmienne dla wypustek, w tym długość wypustek, LESP oraz liczbę wypustek na jednostkę objętości tkanki, NOSP, projektując próby w taki sposób, aby uwzględnić znaczące różnice, które mogą występować między zwierzętami w tej samej grupie badawczej, a nawet między oknami krezkowymi u tego samego zwierzęcia. Ustaliliśmy, że praktycznym może okazać się następujący schemat: liczba zwierząt w grupie badawczej w czasie obserwacji od 8 do 12, liczba okien na zwierzę analizowanych pod kątem VA, liczba pól widzenia dla każdego okna analizowanego pod kątem długości mikronaczyniowej, MVL, długość segmentów mikronaczyniowych, LEMS, liczba segmentów mikronaczyniowych NOMS, liczba punktów rozgałęzień mikronaczyniowych, NOBP, krętość mikronaczyniowa M VT, indeks przecięć I, indeks tworzenia pętli INF; jako kontrolę wykorzystuje się trzy zwierzęta traktowane placebo. Test angiogenezy w oknie krezkowym jest odpowiedni do badań zależności dawka-efekt oraz do analiz kinetyki angiogenezy.Można to osiągnąć poprzez podawanie grupom zwierząt różnych dawek czynnika proangiogennego i uśmiercanie tych zwierząt w różnych punktach czasowych w trakcie odpowiedzi angiogennej. W ten sposób można ilościowo wyróżnić fazę ekspansywną, szczyt oraz następującą po nim fazę angioregresyjną. Badania tego rodzaju wykazały, że odpowiedź angiogenna de novo na każdy przetestowany czynnik wzrostu z grupy cytokin jest ściśle zależna od dawki pod względem prędkości, siły działania i czasu trwania.Co więcej, wzorzec nowych naczyń pod kątem rozszerzenia przestrzennego i zmian w gęstości mikronaczyń jest często wyraźnie zależny od dawki i czasu w porównaniu z angiogenezą indukowaną przez VEGF lub podstawowy FGF w dawkach zbliżonych do fizjologicznych. Angiogeneza pośredniczona przez komórki tuczne, MCMA, wywołana poprzez selektywną aktywację komórek tucznych in situ, charakteryzuje się znacznie wyższą skutecznością i zauważalnie dłuższym czasem trwania. W rzeczywistości angiogeneza pośredniczona przez komórki tuczne została po raz pierwszy opisana przy użyciu tego testu ze względu na możliwość ilościowego określenia obiektywnych zmiennych angiogenezy, wysoką relewantność biologiczną układu oraz możliwość sprawdzenia toksyczności stosowanego leczenia.Zastosowana metodologia jest wyjątkowo odpowiednia do analiz strukturalno-czynnościowych oraz analizy zależności dawka-odpowiedź. Szczur MWAA stanowi model do badania angiogenezy w dorosłej, natywnie unaczynionej tkance trzewnej, w której nie zachodzi fizjologiczna angiogeneza i która nie jest poddawana operacji, co pozwala wykluczyć jakikolwiek wpływ angiogenezy indukowanej gojeniem ran. Test ten jest w pełni ilościowy i pozwala na precyzyjną ocenę szeregu biologicznie istotnych, obiektywnych zmiennych opisujących zasięg przestrzenny, gęstość oraz sposób formowania wzorów mikronaczyń.Metoda ta jest odpowiednia do badania systemowych efektów angiogenezy, czynników modulujących, a także do badań zależności struktura-aktywność i odpowiedź na dawkę. Opisana tutaj metodologia została opracowana w laboratorium dr. Klossa Carla Norby’ego w Katedrze Patologii w Szpitalu Uniwersyteckim Reka, jute Uniwersytetu Borg w Göteborgu w Szwecji. Wszystkie badania w ramach tego projektu były wspierane przez Szwedzką Radę Badań Medycznych, numer projektu 5 9 4 2.Wyrażamy wdzięczność za fachową pomoc techniczną pani Gun Effer, która była zaangażowana w projekt od jego początku, pani Moniki Anderson (nieobecnej) oraz pani Ann Nemar Lindgren.Mam nadzieję, że ta krótka prezentacja przybliżyła Państwu potencjał tego testu. Jeśli będą Państwo stosować ten test w swoim laboratorium, z chęcią pomogę w przypadku wystąpienia jakichkolwiek problemów technicznych. Będę ponadto bardzo wdzięczny za wszelkie sugestie.Dziękujemy.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test angiogeneszy naczyń mezenterycznych szczura

Niniejszy film przedstawia model służący do badania rozwoju hiperplazji intimy po implantacji stentu z wykorzystaniem ludzkiego naczynia (IMA) w modelu szczura z niedoborem odporności.

Przeszczepianie i stentowanie ludzkiej tętnicy piersiowej wewnętrznej (IMA): model ludzki do badania rozwoju restenozy wewnątrzstentowej

Niniejszy artykuł opisuje prosty model stymulacji angiogenezy w krezce szczura. Model ten powoduje gwałtowny wzrost pączkowania naczyń włosowatych, powierzchni naczyniowej oraz gęstości naczyń w stosunkowo krótkim czasie, w tkance umożliwiającej wizualizację en face całych sieci mikronaczyniowych aż do poziomu pojedynczej komórki.

Eksterioryzacja krezki szczura: model do badania dynamiki komórkowej zaangażowanej w angiogenezę

Ludzkie komórki szpiczaka mnogiego (MM) wymagają wspierającego mikrośrodowiska komórek mezenchymalnych i składników macierzy zewnątrzkomórkowej do przetrwania i proliferacji. Stworzyliśmy model zarodka kurczaka in vivo z wszczepionym ludzkim szpiczakiem i komórkami mezenchymalnymi, aby zbadać wpływ leków przeciwnowotworowych na wzrost, inwazję i angiogenezę guza.

Opracowanie modelu ksenoprzeszczepu szpiczaka mnogiego u kurcząt w celu zbadania wzrostu, inwazji i angiogenezy guza

Zmodyfikowana technika Landisa umożliwia sparowany pomiar przewodnictwa hydraulicznego poszczególnych mikronaczyń w krezce normalnych i genetycznie zmodyfikowanych szczurów w warunkach kontrolnych i testowych przy użyciu technik mikroperfuzji. Stanowi wygodną metodę oceny mechanizmów regulujących przepuszczalność mikronaczyń i wymianę transnaczyniową w warunkach fizjologicznych.

Technika mikroperfuzji do badania regulacji przepuszczalności mikronaczyń w krezce szczura

Ten manuskrypt opisuje test tworzenia rurki w celu ilościowego określenia wpływu danego związku lub stanu na angiogenezę za pomocą tworzenia komórek śródbłonka w kontrolowanym środowisku.

Strategiczny test tworzenia rurki śródbłonkowej: porównanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej czynnika wzrostu

Angiogeneza obejmuje interakcje wielokomórkowe, wielosystemowe, które muszą być badane w fizjologicznie odpowiednim środowisku. Celem tego badania jest wykazanie zdolności modelu hodowli krezki szczurów do dokonywania poklatkowych porównań nienaruszonych sieci mikronaczyniowych podczas angiogenezy.

Metoda ex vivo do obrazowania poklatkowego sieci mikronaczyniowych krezki szczura

Tutaj prezentujemy nowatorskie zastosowanie testu pierścienia aortalnego, w którym wstępnie znakowane komórki mezenchymalne są hodowane wspólnie z sieciami śródbłonka pochodzącymi z aorty szczura. Ta nowatorska metoda umożliwia wizualizację naprowadzania i integracji mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) z sieciami śródbłonka, ilościowe określenie właściwości sieci oraz ocenę immunofenotypów MSC i ekspresji genów.

Test kohodowli pierścienia aortalnego: wygodne narzędzie do oceny potencjału angiogennego mezenchymalnych komórek zrębu in vitro

Tutaj prezentowany jest krytyczny eksperymentalny model niedokrwienia kończyn tylnych, a następnie przeprowadzany jest zestaw testów funkcjonalnych, histologicznych i molekularnych w celu oceny skuteczności terapii angiogennych.

Ocena angiogenezy terapeutycznej w mysim modelu niedokrwienia kończyn tylnych

Opisujemy dwie metody oceny przejściowej przepuszczalności naczyń krwionośnych związanych z funkcją wejścia do mikrośrodowiska guza (TMEM) i wewnątrznaczynieniem komórek rakowych za pomocą dożylnego wstrzyknięcia dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej (155 kDa) u myszy. Metody te obejmują obrazowanie przyżyciowe u żywych zwierząt oraz analizę tkanek utrwalonych za pomocą immunofluorescencji.

Ocena mikrośrodowiska guza przepuszczalności naczyniowej za pośrednictwem drzwi z przerzutami związanych z rozsiewaniem komórek rakowych za pomocą obrazowania przyżyciowego i analizy tkanek stałych

Tutaj pokazujemy potencjał terapeutyczny antyangiogennych neutrofili związanych z nowotworem po ich przeniesieniu do myszy z nowotworem. Protokół ten może być wykorzystany do manipulowania aktywnością neutrofili ex vivo, a następnie do oceny ich funkcjonalności in vivo w rozwijających się nowotworach. Jest to odpowiedni model do badania potencjalnych immunoterapii opartych na neutrofilach.

Transfer manipulowanych neutrofili związanych z nowotworem do myszy z guzem w celu zbadania ich potencjału angiogennego in vivo

Obecny protokół pozwala na odzyskanie struktur przypominających rurki powstałych w klasycznym teście angiogenezy in vitro, gdzie komórki, takie jak komórki trofoblastu, organizują się w struktury podobne do naczyń włosowatych na warstwie zewnątrzkomórkowej macierzy błony podstawnej. Odzyskane struktury są wykorzystywane do izolacji RNA i białek do różnych analiz biochemicznych.

Odzyskiwanie komórek trofoblastu z testu tworzenia rurki angiogenezy do analizy ekspresji markerów różnicowania

Poznaj metodę testowania angiogenezy w krezkach szczura, umożliwiającą ilościową analizę tworzenia naczyń krwionośnych. Technika ta pozwala badaczom oceniać wpływ czynników proangiogennych w modelu naczyniowym.

Test angiogenezy w krezoni szczura

Przeglądaj więcej filmów