Name: Immunohistochemia: skrawki parafiny przy użyciu zestawu ABC Vectatain firmy Vector Labs (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 38 s
Description: Naucz się immunohistochemii skrawków zatopionych w parafinie przy użyciu zestawu ABC Vectastain firmy Vector Labs. Protokół obejmuje odparafinowanie, odzyskiwanie antygenów i barwienie tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Barwienie skrawków parafinaowych
<ol>
<li>Odparafinizować preparaty za pomocą ksylenu (Fisher X3S-4), powtarzając czynność 3 razy po 5 minut (wymieniać ksylen co miesiąc w zależności od zużycia; ksylen jest TOKSYCZNY). Należy używać naczyń i pokrywek na 20 preparatów marki Fisher ref 08-812-1A oraz statywów dopasowanych do tych naczyń. 200 ml cieczy na naczynie.</li>
<li>Rehydratować poprzez gradient alkoholi w następujący sposób (wymieniać gradient co 2 tygodnie): 
<ul>
<li>2x w 100% etanolu (Fisher # A406-20) po 2 min each </li>
<li>2x w 95% etanolu po 2 min each </li>
<li>1x w 70% etanolu przez 2 min </li>
<li>1x w 50% etanolu przez 2 min </li>
<li>1x w 30% etanolu przez 2 min </li>
<li>1x w ddH2O przez 2 min</li>
</ul>
</li>
<li>Moczyć w DPBS przez 5 min (DPBS = zmodyfikowany przez Dulbecco roztwór soli fosforanowej z dodatkiem Ca2+ i Mg2+).</li>
</ol>
Odzyskiwanie antygenu:
<ol>
<li>Podgrzać bufor cytrynianowo-sodowy (10 mM, pH 6,5) w mikrofalówce.</li>
<li>Gotować preparaty na szkiełkach przez 15 min w mikrofalówce. Szkiełka nie mogą wyschnąć, dlatego należy sprawdzać je co minutę i w razie potrzeby dolewać bufor cytrynianowo-sodowy.</li>
<li>Pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Zablokować endogenną aktywność peroksydazy za pomocą 1% H2O2 w DPBS przez 20 min (1,5 ml 30% roztworu zapasowego Sigma H-1009 w 50 ml DPBS).</li>
<li>Przemyć w DPBS 3 x 5 min.</li>
<li>Zablokować miejsca niespecyficzne, inkubując preparaty przez noc w temperaturze +4°C w DPBS + 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 0,1% azotku sodu + 5% surowicy. Uwaga: Wybór surowicy zależy od gatunku, w którym otrzymano przeciwciała użyte do barwienia. Należy blokować surowicą z gatunku, w którym otrzymano przeciwciało wtórne (sprzężone z biotyną). Jeśli nie jest ona dostępna, należy użyć surowicy z gatunku innego niż ten, w którym otrzymano przeciwciało pierwotne. </li>
<li>Zablokować miejsca wiązania biotyny za pomocą zestawu blokującego awidyna/biotyna (Vector Laboratories, katalog nr SP-2001): 
<ul>
<li>Inkubować z awidyną D przez 15 min. Krótko przepłukać w DPBS.</li>
<li>Inkubować z roztworem biotyny przez 15 min.</li>
</ul>
</li>
<li>Inkubować z przeciwciałem pierwotnym przez 2 h w temperaturze pokojowej w DPBS + 2% BSA + 0,1% azotku sodu + 2% surowicy (tak samo jak w kroku blokowania).</li>
<li>Przemyć w PBS 3 x 5 min.</li>
<li>Inkubować z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z biotyną przez 1 h w temperaturze pokojowej w DPBS + 2% BSA + 0,1% azotku sodu + 2% surowicy (tak samo jak w kroku blokowania).</li>
<li>Przygotować odczynnik ABC w tym samym czasie, ponieważ musi on dojrzewać przez co najmniej 30 min przed użyciem!!! (patrz Materiały)</li>
<li>Przygotować w probówce stożkowej 50 ml. Do 15 ml DPBS (bez surowicy, bez azotku) dodać 3 krople odczynnika A, wymieszać, dodać 3 krople odczynnika B i wymieszać. Unikać ściskania butelek; lepiej poczekać, aż krople utworzą się samodzielnie. Zestaw ABC Vectastain PK-6100 z Vector Labs.</li>
<li>Przemyć w DPBS 3 x 5 min.</li>
<li>Inkubować z odczynnikiem ABC przez 30-45 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przemyć w DPBS 3 x 5 min.</li>
<li>Przygotować podłoże peroksydazy DAB (Vector Labs # SK-4100) w 5 ml ddH2O w szklanej fiolce bezpośrednio przed użyciem (patrz Materiały): 
<ul>
<li>2 krople roztworu zapasowego buforu, wymieszać</li>
<li>4 krople DAB, wymieszać (roztwór powinien stać się lekko brązowy)</li>
<li>2 krople H2O2, wymieszać</li>
</ul>
</li>
<li>Nanieść podłoże DAB na szkiełka i obserwować pojawienie się brązowego zabarwienia.</li>
<li>Zanurzyć szkiełka w wodzie z lodem z kranu, aby zatrzymać reakcję.</li>
<li>Płukać pod zimną bieżącą wodą przez 5 min.</li>
<li>Przebarwić hematoksyliną (20 s; Fisher CS401-D) i płukać w wodzie z kranu, aż woda będzie przejrzysta.</li>
<li>Odwodnić w gradiencie alkoholowym, zaczynając od 30% etanolu do 100% etanolu (po 2 min na każdym stopniu).</li>
<li>Moczyć w ksylenie 3 x 5 min.</li>
<li>Zamontować za pomocą Permount (Fisher # SP15-100): nanieść niewielką ilość nad przekrój na szkiełku i powoli docisnąć do przekroju szkiełkiem nakrywką, unikając pęcherzyków powietrza. Nie przesuwać szkiełka nakrywki aż do całkowitego wyschnięcia, co zajmuje &nbsp;około 24 h.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ksylen</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>Wymieniać ksylen co miesiąc, zależnie od intensywności użytkowania. Ksylen jest TOKSYCZNY.</td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406-20</td><td>Stosować do przygotowania gradientu EtOH.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td></td><td></td><td>Modyfikowany przez Dulbecco&amp;rsquo; roztwór soli fosforanowo-buforowany Z Ca2+ i Mg2+</td></tr><tr><td>Bufor cytrynianowo-sodowy</td><td></td><td></td><td>10 mM, pH 6.5</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1009</td><td>Roztwór zapasowy 30% =&amp;gt; Rozcieńczyć do 1% w DPBS</td></tr><tr><td>Roztwór blokujący</td><td></td><td></td><td>DPBS + 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 0.1% azotku sodu + 5% surowicy.</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azotek sodu</td><td></td><td></td><td>NaAzide</td></tr><tr><td>zestaw blokujący awidyna/biotyna</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor dla przeciwciał</td><td></td><td></td><td>DPBS + 2% BSA + 0.1% azotku sodu + 2% surowicy (taki sam, jak stosowany w etapie blokowania)</td></tr><tr><td>Zestaw ABC Vectastain PK-6100</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podłoże dla peroksydazy DAB</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS401-D</td><td>barwienie kontrastowe</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Przedmiotniki i szkiełka cover-slip</td><td></td><td></td><td>szklane</td></tr></tbody></table>

immunohistochemia: skrawki w parafiniie z użyciem zestawu vectastain abc firmy vector labs

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemia (IHC) jest cenną techniką wykorzystywaną do lokalizacji i wizualizacji ekspresji białek w preparacie tkankowym przy użyciu swoistych przeciwciał. Istnieją dwie metody: bezpośrednia i pośrednia. W niniejszym doświadczeniu opiszemy wyłącznie zastosowanie pośredniego barwienia IHC. Pośrednie barwienie IHC wykorzystuje wysokoswoiste przeciwciała pierwszorzędowe oraz przeciwciała drugorzędowe sprzężone z biotyną. Przeciwciała pierwszorzędowe służą do precyzyjnej identyfikacji białek docelowych poprzez wiązanie się ze swoistym epitopem, natomiast przeciwciała drugorzędowe ograniczają nieswoiste barwienie tła i wzmacniają sygnał poprzez tworzenie kompleksów z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Preparaty mogą być przygotowane z cięć mrożonych lub cięć zatopionych w parafinie, naniesionych na szkiełka przedmiotowe. W niniejszym protokole omawiamy przygotowanie cięć zatopionych w parafinie poprzez odparafinowanie, nawadnianie z użyciem gradientu alkoholi, termiczną regenerację antygenów oraz blokowanie endogennej aktywności peroksydazy i nieswoistych miejsc wiązania. Część preparatów barwi się przeciwciałami swoistymi dla markera limfocytów T CD8, natomiast pozostałe barwi się pod kątem hydroksylazy tyrozynowej. Następnie szkiełka poddaje się działaniu odpowiednich przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z biotyną, a następnie wywołuje przy użyciu peroksydazy chrzanowej (HRP) sprzężonej z awidyną, stosując diaminobenzydynę (DAB) jako substrat. Po wywołaniu preparaty poddaje się barwieniu kontrastowemu, a następnie zamyka pod szkiełkami nakrywkowymi za pomocą medium Permount. Po odpowiednim wyschnięciu szkiełka są gotowe do obrazowania.

Immunohistochemia: skrawki w parafiniie z użyciem zestawu Vectastain ABC firmy Vector Labs

Immunohistochemia (IHC) jest cenną techniką wykorzystywaną do lokalizacji/wizualizacji ekspresji białek w zamontowanym przekroju tkanki przy użyciu specyficznych ...

Witajcie, nazywam się Victor Chi i jestem studentem studiów magisterskich w laboratorium Chandy w Katedrze Fizjologii i Biofizyki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine. Dzisiaj zaprezentuję sposób barwienia przekrojów zatopionych w parafinie przy użyciu zestawu VECTStain ABC z Vector Laboratories. Procedura ta obejmuje odparafinowanie i nawilżanie przekrojów zatopionych w parafinie, przeprowadzenie odmaskowywania antygenów metodą HIER, blokowanie peroksydazy oraz niespecyficznego wiązania białek, inkubację z przeciwciałami przeciwko CD4 i tyrozynowej hydroksylazie oraz przeciwciałami wtórnymi, a na koniec wywołanie i montowanie preparatu.Zacznijmy zatem. Ponieważ preparaty są zatopione w parafinie, pierwszym krokiem jest ich odparafinowanie. Jest to zazwyczaj wykonywane w dygestorium przy użyciu trzech słoików z ksylenem, z trzema etapami płukania, z których każdy trwa pięć minut.Następnie preparaty przenosi się do stuprocentowego etanolu. Zauważą Państwo, że wosk z preparatów zniknął, jednak należy uważać, aby nie dotykać ich w rękawiczkach, ponieważ ksylen rozpuści gumę, z której są wykonane. Następnie preparaty w stuprocentowym etanolu przenosi się z powrotem do laboratorium, gdzie zostaną poddane gradientowi nawadniania.W tej części omówię gradient nawadniania, przez który będziemy przeprowadzać nasze preparaty. Proces rozpoczyna się od dwóch kąpieli w 100% etanolu. Następnie przenosimy preparaty do dwóch kąpieli zawierających 95% etanolu.Następnie przenosimy preparaty do kąpieli w 70% etanolu, a stamtąd do kąpieli w 50% etanolu. Po tym etapie przenosimy preparaty do 30% etanolu, a po dwóch minutach do wody dwukrotnie destylowanej. Po potraktowaniu wodą dwukrotnie destylowaną pozostawiamy preparaty w roztworze PBS.W tej części pokażę, jak przenosić preparaty między kolejnymi kąpielami przy użyciu kaset. W pierwszym kroku, korzystając z uchwytu kasety, należy wyjąć preparaty i delikatnie je otrzepać, aby usunąć nadmiar cieczy i zapobiec przeniesieniu zbyt dużej jej ilości do następnej kąpieli. Następnie należy zanurzyć preparaty i odczekać dwie minuty do kolejnej zmiany gradientu.W wielu przypadkach po utrwaleniu tkanek antygen zostaje zamaskowany, co uniemożliwia związanie się z nim przeciwciała. Przedstawię zatem metodę termicznej odmaskowania antygenów z wykorzystaniem cytrynianu sodu. Znajdujemy się teraz przy kuchence mikrofalowej, gdzie przeprowadzę odmaskowanie antygenu CD8, który będę próbował wykryć za pomocą immunohistochemii.Teraz włożę roztwór do mikrofalówki i będę go podgrzewać przez 15 minut. W ten sposób będziemy gotować cytrynian sodu wraz z preparatami przez 15 minut, aby upewnić się, że preparaty nie wyschną. Będziemy monitorować preparaty, aby w przypadku wygotowania się płynu uzupełnić cytrynian sodu, zapewniając stałe nawilżenie preparatów.Zatem przed umieszczeniem preparatów w cytrynianie sodu, podgrzałem wcześniej roztwór przez 45 sekund. Następnie umieściłem preparaty w cytrynianie sodu i teraz podgrzewam go przez 15 minut. Gdy preparaty znajdują się w roztworze, zazwyczaj zaczyna on wykipować około drugiej do drugiej i pół minuty procesu gotowania.W tym momencie przerwę i uzupełnię ubytek cytrynianu sodu świeżym roztworem cytrynianu sodu. Po gotowaniu cytrynianu sodu przez 15 minut należy wyjąć preparaty oraz roztwór i je ochłodzić. Najlepszym sposobem na wykonanie tej czynności jest zamknięcie uchwytu do szkiełek, odlanie nadmiaru cieczy i przepłukanie go strumieniem zimnej wody, aż roztwór w słoiku ochłodzi się do temperatury pokojowej.Zazwyczaj trwa to od 10 do 15 minut. Po wyjęciu preparatów z naczynia musimy zablokować endogenną aktywność peroksydazy w tkankach. W tym celu przygotujemy roztwór nadtlenku wodoru, wykorzystując 30% nadtlenek wodoru do przygotowania roztworu 1% nadtlenku wodoru.Następnie przenoszę preparaty bezpośrednio do roztworu nadtlenku wodoru. Teraz inkubujemy preparaty w nadtlenku wodoru przez 20 minut. Po upływie 20 minut, po zablokowaniu peroksydazy endogennej, wypłukania nadtlenku wodoru z preparatów za pomocą przemyć z PBS.Przeniosę teraz preparaty na prowadnicę i przemyję je trzykrotnie, wykonując trzy płukania po 5 minut każde. Preparaty zostały ułożone tyłem do siebie, aby uniknąć kontaktu z innymi szkiełkami, co mogłoby uszkodzić tkankę. Delikatnie wysuwam preparaty i układam je w taki sposób, aby tkanka nie miała możliwości kontaktu ze szkłem.Następnie przenosimy preparaty do PBS. Po przemyciu preparatów PBS-em, teraz zablokuję nieswoiste wiązanie białek za pomocą roztworu 5% BSA, 5% surowicy koziej oraz 0,1% azotku sodu. Jeśli pracujesz z przeciwciałami kozimi, należy zastąpić surowicę kozią surowicą innego gatunku.W tej chwili umieszczę preparaty w uchwycie do szkiełek i wypełnię go roztworem. Zazwyczaj wypełniam go do połowy, aby objętość cieczy zapewniła całkowite zanurzenie tkanek. Należy zwrócić uwagę, aby podczas umieszczania szkiełek w pojemniku tkanki nie dotykały jego ścianek.W przypadku ostatniego slajdu, obróć go do wewnątrz, aby tkanka nie dotykała pojemnika. Po całonocnym blokowaniu slajdów, wypłukuję nadmiar roztworu blokującego, wykonując trzy pięciominutowe płukania w PBS. Na tym etapie należy obrysować tkankę okręgiem z blokera w płynie, aby zminimalizować ilość zużytego przeciwciała.Jeśli nie muszą Państwo oszczędzać przeciwciał, można inkubować preparaty na szkiełkach w tych samych kasetkach, w których przeprowadzono etap blokowania. Od tego momentu pokażę, jak obrysować tkankę blokerem w płynie. Najpierw usuwamy nadmiar cieczy, uważając, aby nie dotknąć tkanki.Należy przetrzeć narożniki, aby usunąć nadmiar cieczy. Ponownie, zachowując ogromną ostrożność, aby nie dotknąć tkanki. Należy wziąć pin blokujący ciecz, lekko go nacisnąć, aby uruchomić przepływ, a następnie obrysować tkankę pisakiem.Pozostaw blokery w płynie do wyschnięcia przez około 15 sekund. Na tym etapie należy dodać przeciwciało pierwszorzędowe. Za pomocą pipety pokryj tkankę przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie przenieś ją do komory z kontrolowaną wilgotnością.Używamy chusteczki Kimwipe, którą zwilżyliśmy wodą destylowaną w tym pudełku, aby zapobiec wysychaniu preparatu podczas inkubacji z przeciwciałem pierwotnym. Po godzinie inkubacji przeciwciała pierwotnego wyjmujemy preparaty i wypłukujemy nadmiar przeciwciał za pomocą PBS.Ponownie należy odczekać, aż ciecz spłynie, a następnie umieścić próbkę w roztworze PBS do płukania. Ponownie płuczemy trzy razy po pięć minut. Po trzech pięciominutowych płukaniach dodamy przeciwciało wtórne do tkanki w ten sam sposób, w jaki dodawaliśmy przeciwciało pierwotne.Używając objętości wystarczającej do pokrycia tkanek, dodaj przeciwciało wtórne – w tym przypadku stosujemy przeciwciało kozie anty-królicze – a następnie przenieś preparat z powrotem do komory z kontrolowaną wilgotnością. Stosujemy przeciwciało wtórne, biotynylowane przeciwciało kozie anty-królicze, które jest niezbędne przy zastosowaniu metody ABC. Przenosimy zatem preparat do komory z kontrolowaną wilgotnością i pozostawiamy do inkubacji przez jedną godzinę.W czasie inkubacji przeciwciała wtórnego należy przygotować odczynnik ABC. Wykorzystujemy odczynnik A, B, C firmy Vector Laboratories z zestawu Vector Stain. Należy wyjąć odczynnik A, przygotować go do użycia, a następnie nanieść trzy krople do 15 mL PBS, uważając, aby nie ściskać probówki, ponieważ krople muszą być precyzyjnie odmierzone i mieć określoną wielkość.Po inkubacji przeciwciała wtórnego przez około godzinę, należy wziąć preparaty i ponownie przemyć je w PBS, tak jak w przypadku przeciwciała pierwotnego. Po trzech przemyciach, z których każde trwało pięć minut, przenosi się preparaty do pojemnika, do którego dodaje się odczynnik ABC, przygotowany od 30 do 45 minut wcześniej. Należy dodać odczynnik ABC do pojemnika, tak aby całkowicie przykrył preparaty, i pozostawić je do inkubacji przez kolejne 30 do 45 minut.Po inkubowaniu preparatów w roztworze A, B, C przez około 3-5 minut, należy wypłukać nadmiar tego roztworu. W tym celu wyjmuje się preparaty i przenosi je do roztworu PBS. Tę procedurę płukania w PBS należy powtórzyć trzykrotnie, wykonując każde płukanie przez 5 minut.Podczas płukania szkiełek przygotowuję podłoże peroksydazy DAB firmy Vector Laboratories. Pobieram bufor o pH 7,5 i dodaję dwie krople. Następnie pobieram odczynnik substratu DAB i dodaję dwie krople tego preparatu.Ponownie podkreślam, że wielkość kropli jest kluczowa, dlatego nie ściskaj butelki, lecz pozwól kroplom swobodnie spadać. Dwie krople dla buforu o pH 7,5. Następnie należy dodać cztery krople odczynnika substratu DAB, również pozwalając im swobodnie spaść.Na koniec należy dodać dwie krople odczynnika substratu nadtlenku wodoru. Tak powinna wyglądać mieszanina odczynnika substratu DAB. Teraz jest ona gotowa do naniesienia na preparaty; wyjmij slajdy i pozwól, aby PBS po prostu spłynął z ich powierzchni.Z czasem odczynnik DAB staje się coraz bardziej brązowy. W tym momencie należy go dodać do preparatów. Należy pobrać objętość wystarczającą do pokrycia tkanek i nanieść ją bezpośrednio na próbki tkanek.Należy pobrać odpowiednią objętość i dodać ją bezpośrednio na próbki tkanek, a następnie odczekać, aż roztwór zadziała; z czasem próbki tkanek powinny przybrać brązowy kolor. Po dodaniu roztworu DAB można zauważyć na tym przekroju mózgu, że tkanka brązowieje w tym oraz w tym miejscu. Brązowe barwienie DAB ujawnia obszar zawierający dopaminergiczne neurony śródmózgowia.Po wywoływaniu preparatów przez okres od 2 do 10 minut, należy przenieść je do lodowatej wody w celu zatrzymania reakcji. Odcedź roztwór i włóż preparaty bezpośrednio do lodowatej wody. Po zanurzeniu preparatów w lodowatej wodzie przenieś kąpiel do zlewu i płucz ją zimną wodą przez około pięć minut, aby upewnić się, że cały roztwór DAB został całkowicie usunięty z kąpieli.Podczas mycia w zlewie należy uważać, aby strumień wody nie uderzał bezpośrednio w tkankę, lecz w jeden z rogów naczynia, pozwalając wodzie swobodnie przelewać się przez próbki; dzięki temu tkanki nie zostaną uszkodzone przez nurt wody. Po wyjęciu preparatów z kąpieli należy przeprowadzić przeciwbarwienie. Dlaczego zatem może być ono konieczne?Jednym z powodów jest chęć zobaczenia struktury tkanki. Innym jest wizualizacja wszystkich komórek. W naszym przypadku zastosujemy przeciwbarwienie hematoksyliną, która barwi jądra komórkowe.W tym kroku należy wziąć preparaty, usunąć nadmiar cieczy i zanurzyć je jednorazowo w roztworze hematyny. Następnie należy je wyjąć i przenieść bezpośrednio do wody. Po umieszczeniu preparatów w wodzie z kranu, należy je płukać pod strumieniem wody, podobnie jak robiono to wcześniej w kąpieli z lodowatej wody.W przypadku płukania z hematyliny wystarczy pozostawić preparaty pod bieżącą wodą, aż woda w słoju stanie się przejrzysta. Po wyjęciu z wody barwionych kontrastowo preparatów należy je ponownie odwodnić. W tym celu przeprowadzamy je przez gradient etanolu, ale w kolejności odwrotnej.Procedura obejmuje jedno płukanie wodą dejonizowaną, jedno płukanie w 30% etanolu, jedno płukanie w 50% etanolu, jedno płukanie w 70% etanolu, dwa płukania w 95% etanolu oraz dwa płukania w 100% etanolu, przy czym każde płukanie trwa dwie minuty. Należy wyjąć preparaty, odsączyć nadmiar cieczy, umieścić je bezpośrednio w 30% etanolu i pozostawić na dwie minuty. Po ostatnim płukaniu w 100% etanolu preparaty należy ponownie umieścić w ksylenie.Ponownie weźcie preparaty, usuwając nadmiar cieczy, a następnie włóżcie je do pierwszego ksylenu na pięć minut. W ten sposób przeprowadzonych zostanie trzy kolejne płukania w ksylenie po pięć minut każde. Teraz jesteśmy gotowi do montowania preparatów.Zazwyczaj na jedną minutę przed przygotowaniem szkiełek pobieram pipetą Pasteura medium do montażu permanentnego i odstawiam je mniej więcej na minutę, aż szkiełka będą gotowe do wyjęcia. Po ostatnim przemyciu ksylenem, uważając, aby nie zanurzyć rękawiczek ani nie zamoczyć ich ksylenem, wyjmij szkiełka pęsetą, zwracając uwagę, na której stronie znajduje się tkanka. Delikatnie usuń nadmiar ksylenu chusteczką Kim, uważając, aby nie dotknąć tkanki – przecieraj ostrożnie jedynie narożniki i krawędzie, pozwalając większości ksylenu odparować. Prawdopodobnie zdążysz opracować dwa szkiełka, zanim pierwsze z nich wyschnie.Gdy osuszą się już preparaty na jednym szkiełku, drugie powinno być gotowe do dalszej pracy. Należy teraz przystąpić do dalszych czynności, zanim całkowicie wyschną. Należy nanieść cienką linię medium Perimount obok tkanki, uważając, aby nie dotknąć samej tkanki.Usuń perimount, zdejmując szkiełko nakrywkę. Przyłóż je pod kątem 45 stopni i pozwól mu powoli opaść. Następnie przesuń szkiełko nakrywkę, upewniając się, że perimount pokrywa wszystkie tkanki.Następnie połóż go i delikatnie naciśnij w centralnej części, aby usunąć wszystkie nadmiarowe pęcherzyki powietrza. Pozostaw do wyschnięcia podczas pracy nad drugą próbką tkanki; nie jest to jeszcze czas na oglądanie preparatów. Należy pozwolić, aby środek PermaMount wyschnął przez noc przed analizą preparatów.W przeciwnym razie, pod światłem mikroskopu, medium do trwałego montowania utworzy pęcherzyki powietrza, co doprowadzi do zniszczenia próbki. Oto nasze przekroje mózgu po barwieniu odczynnikami chemicznymi oraz króliczym przeciwciałem poliklonalnym przeciwko tyrozynohydroksylazie. Ponownie, brązowe barwienie DAB wskazuje lokalizację dopaminergicznych neuronów śródmózgowia.Barwienie kontrastowe hematyną zabarwia wszystkie jądra komórkowe w tej tkance na kolor niebieski. Przedstawiłam zatem sposób barwienia przekrojów zatopionych w parafinie przy użyciu zestawu ABC firmy Vector Laboratories. Teraz należy dostosować warunki do rodzajów tkanek, które będą barwione, oraz stosowanych przeciwciał.Życzymy zatem powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

immunohistochemistry-paraffin-sections-using-vectastain-abc-kit-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Immunohistochemia: Cięcia parafinowe z użyciem zestawu Vectastain ABC od Vector Labs

Technika łącząca barwienie tetramerami in situ i hybrydyzację in situ (ISTH) umożliwia wizualizację, mapowanie i analizę bliskości przestrzennej wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ względem zainfekowanych wirusem komórek docelowych oraz określenie ilościowych zależności między tymi efektorami odpornościowymi a celami w kontekście wyników infekcji.

Technika jednoczesnej wizualizacji wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ i komórek zainfekowanych wirusem in situ

Normalna unaczyniona tkanka ssaka dorosłego, w której nie zachodzi fizjologiczna angiogeneza i która nie była poddana interwencji chirurgicznej, jest wykorzystywana do badania: (i) inicjacji i rozwoju angiogenezy po podaniu środków testowych do jamy otrzewnej; oraz (ii) modyfikacji angiogenezy po systemowym podaniu wybranych środków testowych.

Test angiogenezy w krezoni szczura

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę ilościowego określania heterogeniczności molekularnej w przekrojach histologicznych materiału nowotworowego z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji, analizy obrazu oraz statystycznego miernika heterogeniczności. Metoda ta jest przeznaczona do zastosowania w opracowywaniu i analizie klinicznych biomarkerów.

Mapowanie heterogeniczności ekspresji białek w guzach z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji

Ten film opisuje technikę barwienia immunohistochemicznego w celu identyfikacji komórek dendrytycznych z biopsji wewnątrzoskrzelowych.

Barwienie immunohistochemiczne: metoda uzyskiwania informacji przestrzennych z cienkich skrawków tkanek

Protokół immunofluorescencji pośredniej opisany w tym artykule pozwala na wykrywanie i lokalizację białek w gruczole sutkowym myszy. Podano kompletną metodę przygotowania próbek gruczołu mlecznego, przeprowadzenia immunohistochemii, obrazowania skrawków tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz rekonstrukcji obrazów.

Immunofluorescencja pośrednia na zamrożonych odcinkach mysiego gruczołu sutkowego

Ten protokół jest opłacalną alternatywą dla ekspresji nagiego plazmidowego DNA w skórze myszy. Ogólnym celem protokołu jest dostarczenie genów związanych z odpornością do tkanki skórnej w celu określenia funkcjonalnej roli określonego genu w zapaleniu skóry.

Opracowanie ekonomicznego systemu dostarczania DNA przez "Acufection" i jego zastosowanie w badaniach nad skórą

Tutaj opisujemy metodę, która łączy barwienie in situ MHC-tetrameru z immunohistochemią w celu określenia lokalizacji, fenotypu i ilości limfocytów T specyficznych dla antygenu w tkankach. Protokół ten służy do określania charakterystyki przestrzennej i fenotypowej limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w stosunku do innych typów komórek i struktur w tkankach.

In Situ Barwienie tetrameru MHC i analiza ilościowa w celu określenia lokalizacji, liczebności i fenotypu limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w tkankach

Obecnie, barwienie immunofluorescencyjne na stałych komórkach jest metodą wyboru do określania poziomów ekspresji białek, gdy informacja morfologiczna jest również niezbędna. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół przewiduje alternatywną metodę immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie.

Oznaczanie poziomu ekspresji białek w hodowanych komórkach metodą immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie

Metoda lokalizacji immunofluorescencji in vivo (IVIL) może być użyta do badania in vivo biodystrybucji przeciwciał i koniugatów przeciwciał do celów onkologicznych w organizmach żywych przy użyciu kombinacji metod celowania w nowotwory in vivo i barwienia immunologicznego ex vivo.

Lokalizacja immunofluorescencji in vivo do oceny terapeutycznej i diagnostycznej biodystrybucji przeciwciał w badaniach nad rakiem

Ten eksperymentalny protokół opisuje i optymalizuje metodę barwienia metodą immunohistochemii multipleksowej (IHC), głównie poprzez optymalizację warunków inkubacji przeciwciał jednokanałowych i dostosowanie ustawień przeciwciał i kanałów do rozwiązania problemów autofluorescencji i przesłuchu kanałowego w tkankach raka płuc pochodzenia klinicznego.

Multipleksowe barwienie immunohistochemiczne tkanki raka płuc zatopionej w parafinie

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Naucz się immunohistochemii skrawków zatopionych w parafinie przy użyciu zestawu ABC Vectastain firmy Vector Labs. Protokół obejmuje odparafinowanie, odzyskiwanie antygenów i barwienie tkanek.

Immunohistochemia: skrawki w parafiniie z użyciem zestawu Vectastain ABC firmy Vector Labs

Przeglądaj więcej filmów