Immunohistochemia: skrawki parafiny przy użyciu zestawu ABC Vectatain firmy Vector Labs

Cześć, nazywam się Victor Chi i jestem doktorantem w Chandy Lab na Wydziale Fizjologii i Biofizyki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine. Dzisiaj zademonstruję, jak barwieć sekcje zatopione w parafinie za pomocą zestawu A, b, C firmy Vector Laboratories. Procedura ta obejmuje dewoskowanie i nawilżanie skrawków zatopionych w parafinie, przeprowadzanie indukowanego ciepłem pobierania antygenu w celu zdemaskowania antygenów, zablokowania peroksydazy i niespecyficznego wiązania białek, inkubację z CD four i hydroksylazą tyrozynową oraz przeciwciałami drugorzędowymi oraz opracowanie i zamontowanie szkiełka.

Więc zacznijmy. Ponieważ szkiełka są zakodowane w parafinie, pierwszym krokiem jest odwoskowanie szkiełek. Odbywa się to zwykle w dygestorium przy użyciu trzech słoików ksylenu po trzech praniach składających się z pięciu minut na każde mycie.

Szkiełka są następnie umieszczane w stuprocentowym etanolu. Zauważysz, że wosk na szkiełkach zniknął, ale uważaj, aby nie dotykać szkiełek w rękawiczkach, ponieważ ksylen rozpuści gumę rękawiczek. Stamtąd przenosisz szkiełka w stuprocentowym etanolu z powrotem do laboratorium, gdzie zostaną poddane gradientowi nawodnienia.

Więc tutaj opowiem wam o gradiencie nawodnienia, przez który będą przechodzić nasze ślizgi. Najpierw zaczyna się od dwóch kąpieli stuprocentowego etanolu. Stamtąd przenosimy nasze zjeżdżalnie do dwóch wanien składających się w 95% z etanolu.

Następnie przenosimy nasze szkiełka do jednej kąpieli z 70% etanolem, a stamtąd przenosimy nasze szkiełka do kąpieli z 50% etanolem. Następnie przenosimy nasze szkiełka do 30% etanolu, a dwie minuty później przenosimy nasze szkiełka do podwójnie destylowanej wody. A po uzdatnieniu wodą podwójnie destylowaną pozwolimy naszej szkiełku usiąść w PBS.

Więc teraz pokażę ci, jak przenosić zjeżdżalnie z jednej wanny do drugiej w wagonach. Pierwszym krokiem jest więc użycie uchwytu na wózek, wyjęcie szkiełek i delikatne zeskrobanie, aby usunąć nadmiar płynu, aby nie nosić zbyt dużo płynu na następną kąpiel. Stamtąd zanurz go i poczekaj dwie minuty na następną zmianę nachylenia.

Tyle razy, gdy tkanki się utrwalają, antygen zostaje zamaskowany, tak że przeciwciało nie może się z nim związać. Więc to, co zamierzam teraz zrobić, to pokazać wam metodę indukowanego ciepłem odzyskiwania antygenu za pomocą cytrynianu sodu. Teraz jesteśmy przy kuchence mikrofalowej, gdzie zamierzam zdemaskować mój antygen CD 8, który postaram się wykryć za pomocą immunohistochemii.

A tutaj włożę mój roztwór i podgrzeję go w kuchence mikrofalowej przez 15 minut. Dlatego będziemy gotować cytrynian sodu z naszymi szkiełkami przez 15 minut, aby upewnić się, że nasze szkiełka nie wyschną. Będziemy oglądać nasze slajdy, aby po wykipieniu napełnić je cytrynianem sodu, aby upewnić się, że szkiełka pozostaną nawodnione.

Więc zanim włożę szkiełka do cytrynianu sodu, już podgrzełem roztwór przez 45 sekund. Następnie włożyłem szkiełka do cytrynianu sodu, a teraz podgrzewam cytrynian sodu przez 15 minut. Z szkiełkami w nim zwykle roztwór zacznie kipieć po około dwóch do dwóch i pół minuty od rozpoczęcia procesu gotowania.

W tym momencie zatrzymam się i zastąpię utracony cytrynian sodu świeżym cytrynianem sodu. Po gotowaniu cytrynianu sodu przez 15 minut chcemy wyjąć nasze szkiełka i roztwór i ostudzić je. Najlepszym sposobem na to jest zakręcenie uchwytu na szkiełka, wylanie nadmiaru płynu i po prostu przelanie go przez strumień zimnej wody, aż roztwór wewnątrz słoika ostygnie do temperatury pokojowej.

A to zwykle zajmuje około 10 do 15 minut. Tak więc po wyjęciu szkiełek ze zlewu musimy zablokować endogenną aktywność peroksydazy w tkankach. Więc to, co zamierzamy zrobić, to zrobić roztwór nadtlenku wodoru, używając 30% nadtlenku wodoru i tworząc 1% roztwór nadtlenku wodoru.

A stąd po prostu przenoszę szkiełka bezpośrednio do roztworu nadtlenku wodoru. A teraz będziemy inkubować nasze szkiełka w wodzie utlenionej, przez 20 minut. Teraz, po upływie 20 minut, po zablokowaniu endogennej peroksydazy, zamierzam teraz zmyć nadtlenek wodoru ze szkiełek za pomocą popłuczyń PBS.

Zamierzam więc przenieść moje szkiełka do wagonu i umyć je trzema praniami trwającymi po pięć minut każde. Tak więc te szkiełka zostały umieszczone tyłem do siebie, aby uniknąć kontaktu z innymi szkiełkami, które mogą uszkodzić tkankę. Więc po prostu zsuwam się ze szkiełek i układam je tak, aby tkanka nie miała możliwości kontaktu ze szkłem.

Tam przenosimy nasze slajdy do PBS. Tak więc po umyciu naszych szkiełek PBS, zamierzam teraz zablokować szkiełka pod kątem niespecyficznego wiązania białek roztworem 5% BSA 5% surowicy koziej i 0,1% azydku sodu. Więc chcesz zmienić kozią surowicę na inny gatunek, jeśli pracujesz z kozimi przeciwciałami.

Więc teraz po prostu włożę szkiełka do naszego uchwytu na szkiełka i wypełnię go naszym roztworem. Więc zwykle po prostu wypełniam go do połowy, aby objętość szkiełek upewniła się, że tkanki są zanurzone. Jedną z rzeczy, o których chcesz się upewnić, wkładając szkiełka do pojemnika, jest to, aby te chusteczki nie dotykały boków pojemnika.

Tak więc na ostatnim slajdzie obróć go do wewnątrz, aby chusteczka nie dotykała pojemnika. Więc teraz, gdy zablokowałem slajdy na noc, zamierzam zmyć nadmiar roztworu blokującego trzema praniami po pięć, składającymi się z pięciu minut w PBS. Więc w tym momencie chcemy narysować okrąg za pomocą płynnego blokera wokół naszej tkanki, abyśmy zminimalizowali ilość użytego przeciwciała.

Jeśli nie martwisz się o zachowanie przeciwciał, zawsze możesz inkubować szkiełka w tych samych osłonkach, w których wykonaliśmy krok blokowania. Więc od tego momentu pokażę wam, jak rysujemy za pomocą płynnego blokera wokół naszej tkanki. Dlatego najpierw usuwamy krew z nadmiaru płynu, uważając, aby nie dotknąć tkanki.

Więc po prostu przetrzyj w rogach, aby usunąć nadmiar płynu. Ponownie, będąc bardzo, bardzo ostrożnym, aby nie dotknąć tkanki. Weź szpilkę blokującą płyn, delikatnie dociśnij, aby uruchomić przepływ, a stamtąd owiń tkankę pisakiem.

Pozostaw bloker płynu do wyschnięcia na około 15 sekund. W tym momencie chcemy dodać przeciwciało pierwszorzędowe. Dlatego za pomocą pipety upewnij się, że pokryłeś tkankę pierwotnym przeciwciałem i przenieś ją do pudełka z kontrolowaną wilgotnością.

Używamy więc chusteczki Kim. Śr poślubił trochę wody di w tym pudełku, aby zapobiec wysychaniu szkiełka podczas inkubacji z pierwotnym przeciwciałem. Teraz, gdy nasze pierwotne przeciwciało inkubuje się przez godzinę, usuniemy nasze szkiełka i zmyjemy nadmiar przeciwciała za pomocą PBS.

Więc znowu, po prostu pozwól płynowi spłynąć i włóż go do prania PBS. I znowu umyj trzy razy przez pięć minut. Więc po naszych trzech pięciominutowych myciach dodamy nasze drugorzędowe przeciwciało do naszej tkanki w taki sam sposób, w jaki dodaliśmy nasze pierwszorzędowe przeciwciało.

Więc po prostu używając wystarczającej objętości, aby pokryć tkanki, dodaj swoje wtórne przeciwciało, którego używamy, jest kozie przeciwko królikowi, i przenieś szkiełko z powrotem do komory o kontrolowanej wilgotności. Używamy więc przeciwciała drugorzędowego, którym jest biotynylowany kozioł anty królik, co jest niezbędne, gdy używasz metody A BC. Przenosimy więc nasze szkiełko do komory o kontrolowanej wilgotności i pozwalamy mu inkubować się na jedno wyjście.

Tak więc, podczas gdy przeciwciało drugorzędowe inkubuje, musimy przygotować odczynnik A BC. Używamy więc laboratoriów wektorowych, odczynnika A, B, C z zestawu do barwienia wektorowego. Usuń więc odczynnik i pozwól mu trzykrotnie wpaść do 15 mililitrów PBS, uważając, aby nie ścisnąć probówki, ponieważ krople muszą być specjalnie odmierzone i mieć określony rozmiar.

Więc po zakończeniu inkubacji przeciwciała drugorzędowego przez około godzinę, bierzesz szkiełka i wkładasz je ponownie do PBS, tak jak to zrobiłeś z przeciwciałem pierwszorzędowym. Tak więc po trzech praniach składających się z pięciu minut każde, przenosisz szkiełka do tego pojemnika, gdzie dodajesz odczynnik A, B, C, który przygotowałeś 30 do 45 minut przed czasem. Więc po prostu dodaj tutaj swój odczynnik A, B, C, wypełnij swoje szkiełka i pozwól im inkubować przez kolejne 30 do 45 minut.

Tak więc po tym, jak szkiełka będą siedzieć w A, B, C przez około 34 do pięciu minut, chcemy zmyć nadmiar roztworu A, B, C. Więc po prostu usuwasz slajdy i dodajesz do swojego rozwiązania PBS. Dlatego chcemy powtórzyć tę samą procedurę prania trzy razy w PBS przez pięć minut przy każdym praniu.

Podczas mycia szkiełek przygotowuję substrat peroksydazy DAB z laboratoriów wektorowych. Biorę bufor o pH 7,5 i dodaję dwie krople. Po buforze pH 7,5 biorę odczynnik reagujący z substratem DAB i dodaję do niego dwie krople.

Ponownie, wielkość kropli ma kluczowe znaczenie, więc nie ściskaj butelki i po prostu pozwól, aby krople spadły. Dwie krople dla buforu o pH 7,5. Więc chcesz dodać cztery krople odczynnika do substratu DAB, pozwalając mu również upuścić.

Chcesz również dodać na końcu, chcesz dodać dwie krople odczynnika substratowego nadtlenku wodoru. Tak więc powinna wyglądać mieszanina odczynników do substratów DAB. Teraz jest gotowy do dodawania do slajdów, usuwania slajdów i pozwalania, aby PBS po prostu spuścił slajdy.

Tak więc z biegiem czasu odczynnik DAB staje się bardziej brązowy. Dlatego w tym momencie chcemy dodać go do naszych slajdów. Więc weź wystarczającą objętość, aby pokryć tkanki i po prostu dodaj ją bezpośrednio na próbki tkanek.

Więc po prostu weź odpowiednią objętość i dodaj ją bezpośrednio na próbki tkanek i pozwól, aby roztwór się rozwinął, ponieważ próbki tkanek powinny z czasem stać się bardziej brązowe. Po dodaniu roztworu DAB można było zobaczyć w tej części mózgu, gdzie tkanka zmienia kolor na brązowy tu i ówdzie. Brązowa pozycja DAB odsłania obszar zawierający neurony dopaminergiczne śródmózgowia.

Po wywołaniu slajdów z dowolnego miejsca od dwóch do 10 minut, chcesz dodać swoje, więc chcesz dodać slajdy do lodowatej wody, aby zatrzymać reakcję. Więc po prostu pozwól, aby roztwór spłynął i dodaj szkiełka bezpośrednio do lodowatej wody. Po zanurzeniu szkiełek w lodowatej wodzie przenieś wannę do zlewu i wlej do niej zimną wodę na około pięć minut, aby upewnić się, że cały roztwór DAB został spuszczony z tej wanny.

Więc kiedy dodajesz do zlewu, uważaj, aby strumień nie uderzył w chusteczkę, a raczej uderzył w jeden z rogów i pozwolił mu po prostu się przelać, aby twoje tkanki nie zostały zakłócone przez płynący przepływ wody. Więc po wyjęciu szkiełek z prania chcesz zrobić plamę przeciwstawną. Dlaczego więc możesz chcieć plamy przeciwstawnej?

Cóż, jednym z powodów jest to, że możesz chcieć zobaczyć strukturę swojej tkanki. Innym jest wizualizacja wszystkich komórek. Tak więc dla naszych celów zamierzamy przeciwdziałać barwieniu za pomocą hemat toin, co oznacza jądra.

Więc chcemy po prostu wziąć nasze szkiełka, usunąć nadmiar płynu i po prostu zanurzyć go raz w roztworze Hemat Hematin. Po pierwsze, wyjmij go i dodaj bezpośrednio do wody. Po dodaniu zjeżdżalni do wody z kranu, chcesz wziąć je i zanurzyć pod wodą, tak jak to miało miejsce wcześniej w przypadku lodowatej kąpieli wodnej.

Tak więc, aby umyć hemat Toin, po prostu pozwól mu płynąć pod bieżącą wodą, aż woda w słoiku stanie się czysta. Tak więc po wyjęciu z wody naszych poplamionych na blacie szkiełków, chcemy ponownie odwodnić nasze szkiełka. Chcemy więc przepuścić go z powrotem przez nasz gradient etanolu, ale w odwrotnej kolejności.

Byłoby to więc jedno pranie wodą dejonizowaną, jedno pranie 30% etanolem, jedno pranie 50% etanolem, jedno pranie 70% etanolem, dwa pranie i 95% etanolu oraz dwa prania i 100% etanolu, każde składające się z dwóch minut każde. Wyjmij więc szkiełka, zetrzyj nadmiar płynu i dodaj go bezpośrednio do 30% etanolu i pozostaw na dwie minuty. Tak więc po ostatnim myciu stuprocentowym etanolem chcemy włożyć szkiełka z powrotem do ksylenu.

Więc weź ponownie szkiełka, zeskrobując nadmiar płynu, weź szkiełka i dodaj je do pierwszego ksylenu na pięć minut. Będą to więc trzy kolejne płukania ksylenem przez pięć minut każde. A teraz jesteśmy gotowi do zamontowania naszych zjeżdżalni.

Więc to, co zwykle robię, to na minutę przed przygotowaniem szkiełek biorę pipetę pastwiskową i pobieram roztwór do montażu trwałej ondulacji i pozwalam, aby minęło około minuty przed tym, jak moje szkiełka będą gotowe do wyjęcia Po ostatnim praniu ksylenu, uważając, aby nie zanurzyć rękawic ani nie zamoczyć rękawiczek ksylenem, Usuń je pęsetą, uważając, po której stronie znajduje się tkanka. Delikatnie zetrzyj nadmiar XLE chusteczką Kim, uważając, aby nie dotknąć chusteczki, wystarczy ostrożnie przetrzeć rogi i krawędzie, pozwalając większości ksylenu odparować. Prawdopodobnie możesz pracować na dwóch slajdach, zanim jeden wyschnie.

Tak więc, gdy skończysz suszyć jeden slajd, drugi szkiełko powinno być gotowe do pracy. Teraz musisz z nimi pracować, zanim całkowicie wyschną. Więc chcesz wziąć swój perimount i narysować cienką linię obok tkanki, uważając, aby nie dotknąć tkanki.

Zdejmij mocowanie peryferyjne, biorąc szkiełko nakrywkowe. Nałóż go pod kątem 45 stopni i pozwól mu się zgiąć. A następnie przesuń szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że perimount zakrywa wszystkie tkanki.

Następnie połóż, połóż go i delikatnie naciśnij środek, aby usunąć nadmiar pęcherzyków powietrza. Pozwól mu wyschnąć podczas pracy nad drugą chusteczką to czas, aby spojrzeć na nasze slajdy, a nie właściwie. Musimy więc pozwolić mocowaniu perma wyschnąć przez noc, zanim spojrzymy na nasze szkiełka.

W przeciwnym razie, w świetle mikroskopu, trwały montaż będzie bulgotał, a wtedy zrujnujesz swoją próbkę. Oto spojrzenie na nasze sekcje mózgu po barwieniu chemikaliami, króliczym przeciwciałem poliklonalnym skierowanym przeciwko hydroksylazie tyrozyny. Ponownie, brązowa plama DAB pokazuje lokalizację neuronów dopaminergicznych w śródmózgowiu.

Barwienie przeciw hematynie zmienia kolor wszystkich jąder w tej tkance na niebieski. Właśnie pokazałem Ci, jak barwieć sekcje zatopione w parafinie za pomocą zestawu A BC firmy Vector Laboratories. Teraz będziesz chciał dostosować warunki do typów tkanek, które będziesz barwić, i przeciwciał, których będziesz używać.

Życzymy więc powodzenia w eksperymentach.