Mikrorozcięcie laserowe z wychwytem (Laser Capture Microdissection) tkanek ssaków

Witajcie, nazywam się Rob Edwards. Jestem dyrektorem ośrodka mikroskopii laserowej w University of California Irvine. Opiszę Państwu sposób użytkowania mikroskopu do laserowej mikrodysekcji, którym dysponujemy w naszym ośrodku.

Naszym urządzeniem jest Leica A-S-L-M-D, którą zakupiliśmy około trzech lat temu. Istnieją dwa różne typy systemów mikrosekcji laserowej. Jeden z nich można porównać do zgrzewarki punktowej, w której fragment tkanki znajduje się na szkiełku przedmiotowym, przykryty plastikową membraną.

Następnie wykorzystuje się źródło laserowe do stopienia membrany, co w rzeczywistości powoduje zgranie tkanki z membraną, po czym membrana jest usuwana wraz z przechwyconą tkanką. Dobrze. Aby uruchomić system LCM, włączamy kolejno następujące urządzenia. Zaczynamy od jednostki sterującej A-S-L-M-D, którą włączamy tutaj.

Następnie włączamy komputer w prosty sposób. Jeśli dysponujemy preparatem wymagającym optyki fluorescencyjnej do identyfikacji komórek przeznaczonych do przechwycenia, należy włączyć lampę rtęciową w celu uzyskania oświetlenia fluorescencyjnego. W tej demonstracji nie będziemy z niej korzystać.

Aby uzyskać wysokiej jakości obrazy preparatów przed i po badaniu, można oddzielnie włączyć kamerę punktową tutaj, po uruchomieniu modułu sterującego i komputera. Następnie włącza się jednostkę sterowania mocą lasera, która jest uruchamiana za pomocą klucza znajdującego się z tyłu, na dole urządzenia. Na koniec włącza się monitor komputera. Na ekranie znajduje się szereg elementów sterujących, z którymi należy się zapoznać.

Będziecie z nich korzystać dość regularnie. Jest to klasyczny program oparty na systemie Microsoft Windows, dlatego omówimy szereg dostępnych menu. Najpierw jednak opowiem o pulpicie.

Dostępne jest okno podglądu na żywo, które pokazuje obraz aktualnie widziany przez mikroskop. Na pasku menu znajduje się przycisk obrazów na żywo oraz przycisk zamrażania obrazu, który można przełączyć, a następnie wykorzystać menu plików do przechwytywania nieruchomych obrazów fragmentu tkanki, na przykład przed i po przechwytywaniu, aby udokumentować wyizolowaną tkankę. Mikroskop może pracować w trybie jasnego pola lub fluorescencji, w zależności od tego, czy obrazowana jest tkanka barwiona hematylyną, czy tkanka barwiona fluorescencyjnie.

Następne dwa przyciski obejmują tryb preparatu, który koncentruje się na płaszczyźnie stolika mikroskopu, oraz tryb kolektora, który odsuwa szkiełko przedmiotowe, umożliwiając wizualizację pobranej tkanki w górnej części probówki kolektora. Jest to ustawienie służące do kontroli jakości. Dalej na pasku menu znajdują się narzędzia do rysowania, których należy użyć do zidentyfikowania fragmentów tkanki lub komórek przeznaczonych do pobrania.

Po prawej stronie ekranu znajdują się dodatkowe narzędzia do rysowania i przechwytywania obrazu, w tym opcje kształtów rysunkowych, opcje cięcia oraz przyciski sterowania cięciem. Na panelu sterowania na dole znajduje się również urządzenie kolektorskie, czyli część mikroskopu pod stolikiem, w której znajdują się probówki einor służące do przechwytywania tkanki. Cztery przyciski oznaczone literami A, B, C i D sterują przesuwaniem odpowiedniej probówki bezpośrednio pod przechwytywaną próbkę.

Jest to przykład typowej mrożonej sekcji tkanki przygotowanej do mikrodissekcji laserowej. Są to przekroje wieńcowe głowy embrionu myszy, naniesione na szkiełko z folią Pen Foil. Były to mrożone sekcje o grubości 8 µm, które następnie wysuszono, zbarwiono hematyliną i przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

Aby zamocować te preparaty w mikroskopie, należy użyć specjalnego uchwytu dołączonego do urządzenia; należy pamiętać, że tkanka zostanie przechwycona do probówki Eppendorf, która znajduje się poniżej płaszczyzny stolika. Tkanka znajduje się po tej stronie szkiełka, dlatego preparat należy umieścić w uchwycie stroną z tkanką skierowaną w dół, w ten sposób.

Preparat pasuje do tego miejsca i jest w nim utrzymywany dzięki naciskowi sprężyny. Następnie ten otwór pozostaje nienaruszony. Uchwyt preparatów zostaje umieszczony na stole mikroskopu pomiędzy tymi dwiema prowadnicami.

Zauważą Państwo, że znajduje się tam niewielki wypust, który pasuje pod uchwyt z tyłu stolika, mocując preparat w odpowiedniej pozycji. Po jego wsunięciu poczują Państwo wyraźne kliknięcie. Dobrze, kolejnym elementem do przygotowania są rurki Einhora, w których zostanie uchwycona tkanka.

Można wybrać probówki Eppendorf o pojemności 0,2 lub 0,5 ml, które mieszczą się w tych małych uchwytach, a te z kolei w tacy umieszczanej w specjalnym gnieździe pod stolikiem mikroskopu. W ten sposób tkanka zostanie uwięziona w górnej części zakrętki probówki Eppendorf. W celach instruktażowych używam tutaj probówki o pojemności 0,5 ml.

Zatem kapturek wkłada się w ten sposób, przesuwając go pod spód, a następnie krawędzie kapturka są utrzymywane w miejscu przez te ząbki, po czym kapturek zatrzaskuje się od spodu w ten sposób, a następnie cały kapturek trafia do uchwytu. Obecnie, w przypadku wyodrębniania kwasów nukleinowych, w szczególności izolacji RNA, można wlać kilkaset mikrolitrów kropli roztworu triola bezpośrednio do kapturka. Oczywiście ważne jest, aby nie rozlać go do instrumentu ze względu na fenol i inne żrące substancje chemiczne zawarte w odczynniku triolowym.

Oto kontroler mikroskopu, o którym wspomniałem wcześniej; obiektywy, oświetlenie oraz ostrość są w tym urządzeniu w pełni zmotoryzowane. Pokrętło ostrości znajduje się tutaj, na górze. Tym pokrętłem steruje się przesuwaniem stolika w osi Y.

Tutaj znajduje się sterowanie translacją X. W lewym dolnym rogu znajduje się regulator przysłony, który zmienia poziom oświetlenia; mikroskop zapamiętuje ustawiony poziom oświetlenia dla każdego powiększenia. Dzięki temu podczas zmiany obiektywów oświetlenie jest dostosowywane automatycznie.

I wreszcie po prawej stronie kontrolera znajduje się pokrętło obrotowej głowicy obiektywów, które służy do przełączania między obiektywami. Instrument ten posiada pięć obiektywów: 4x, 10x, 20x, 40x oraz 63x. Pierwszym krokiem w procesie rejestracji obrazu tkanki jest odpowiednia kalibracja mikroskopu, aby obraz widoczny na ekranie odpowiadał temu, co zostanie faktycznie zarejestrowane.

Przechodzimy do opcji menu lasera, wybieramy kalibrację i zatwierdzamy, klikając kontynuuj. Obecnie korzystam z ustawienia 4x i można zauważyć stosunkowo duży obszar błony. Zauważcie, że nie ma tutaj tkanki.

Ustawianie osiowości przeprowadzamy w jednym z narożników preparasu. Laser wyciął kratkę w prawym górnym rogu ekranu; za pomocą myszy wycentruję ją na ekranie, a następnie kliknę w obszar tej kratki, co spowoduje, że komputer wytnie kolejną kratkę. Wyrównam preparas względem niej i kliknę, po czym zostanie wycięta trzecia kratka, względem której wykonamy ostateczne ustawienie.

Kalibracja obiektywu 4x dla mikroskopu została zakończona; urządzenie jest teraz wyrównane i gotowe do właściwego obrazowania tkanki. Podczas procesu wyrównywania można było zauważyć, że wycinane kreskowanie było dość grube. Działo się tak z powodu ustawienia bardzo wysokiej mocy sterującej lasera.

Prawdopodobnie nie potrzebujemy tak dużej mocy cięcia. Zademonstruję zatem, w jaki sposób dostosowuje się moc lasera, wycinając linię. Jeśli narysuję odręcznie ukośną linię na ekranie, wybiorę odpowiednią czapkę, a następnie kliknę „start cut”, komputer przetnie materiał wzdłuż zdefiniowanej przeze mnie linii.

I można zauważyć, jak szeroka jest ta linia. Muszę zmniejszyć moc lasera. Zrobię to.

Przechodzę do menu lasera, następnie do sekcji sterowania, gdzie zauważą Państwo, że intensywność została ustawiona na maksimum. Zmniejszę intensywność lasera do około 30 i zatwierdzę to ustawienie. Teraz, gdy narysuję nową linię i wykonam cięcie, zobaczą Państwo, że szerokość przypalonej tkanki lub przypalonej błony jest znacznie mniejsza.

Zatem jako ogólną zasadę, moc sterująca laserem należy ustawić na jak najniższą wartość, aby zminimalizować ilość waporyzowanej tkanki. Teraz zaprezentuję faktyczne pobranie próbki tkanki przy użyciu tego lustrzanego oka. Obecnie korzystam z obiektywu 4x i podejmę próbę pobrania stosunkowo dużego fragmentu tkanki.

Wyizolujemy całą soczewkę z centrum tego oka. W tym celu wykonam cięcie metodą wolnoręczną. Korzystając z narzędzia rysowania znajdującego się w górnej części ekranu, wykonam nacięcie.

Obrysuję obszar wokół preparatu, który ma zostać pobrany. Robię to przy bardzo niskim powiększeniu. W przypadku chęci wykonania dokładniejszych wycięć lub pobrania mniejszych obszarów tkanki, można oczywiście przeprowadzić przechwytywanie przy wyższym powiększeniu.

Po zaznaczeniu obszaru do wycięcia przechodzę do menu rysowania kształtów, gdzie zazwyczaj mam włączoną opcję zamkniętych linii. Funkcja zamkniętych linii polega na tym, że jeśli narysuje się nieregularny kształt wokół obiektu i nie zamknie go całkowicie, program automatycznie dorysuje linię prostą między otwartymi końcami kształtu. Po wyznaczeniu obszaru do wycięcia rozpoczynamy proces cięcia; można zauważyć, że sterownik skupia wiązkę lasera na zaznaczonych obszarach, wycinając je niemal całkowicie.

Podczas pobierania dużych fragmentów tkanki często zdarza się pozostawienie fragmentu tkanki (tzw. hanging Chad). Nie dochodzi wtedy do całkowitego oddzielenia tkanki. W takiej sytuacji w pierwszej kolejności należy spróbować ponownego wycięcia, a laser będzie podążał wzdłuż krawędzi tkanki.

Alternatywnie, w miejscu, w którym tkanka zwisa, można wyznaczyć niewielką przestrzeń i ją przeciąć, co spowoduje jej oddzielenie. W ten sposób pobraliśmy ten fragment tkanki. Jak wspomniałem wcześniej, możemy teraz przełączyć się w tryb kolektora i zweryfikować, czy ten fragment tkanki znajduje się rzeczywiście w kolektorze lub w nakrętce probówki einor.

Przejdę zatem do przycisku sterowania kolektorem, nacisnę go, a wówczas zauważą Państwo, że mikroskop zmieni widok. Patrzymy teraz na wewnętrzną powierzchnię rurki einor; w dolnej prawej części ekranu znajduje się pobrany fragment tkanki, który po ustawieniu ostrości pozwala dostrzec poszczególne komórki. W ten sposób potwierdziliśmy, że rzeczywiście pobrano wybraną tkankę.

Warto zauważyć, że proces wychwytywania nie przebiega ze stuprocentową wydajnością, ponieważ wychwytywane tkanki przypominają w zasadzie opadające liście. Niewielki procent fragmentów wychwyconej tkanki nie wpadnie do pokrywki probówki Eppendorf, jednak stopień strat jest bardzo niski po zakończeniu pobierania pożądanej tkanki. Kolejnym krokiem jest oczywiście wyjęcie z urządzenia probówki Eppendorf z wychwyconą tkanką i szczelne zamknięcie jej zakrętką.

Aby to zrobić, bardzo delikatnie wyciągamy uchwyt w linii prostej w ten sposób. Pamiętając o tym, aby nakrętka probówki pozostała w pozycji pionowej, wyjmujemy uchwyt z tacki, a następnie bardzo delikatnie wyciągamy probówkę. Przesuwamy ją w ten sposób, wyjmujemy z uchwytu, a następnie przesuwamy wkład, a nie pokrywkę, w ten sposób.

Jeśli w pokrywce umieszczono już kroplę triolu, tkanka rozpocznie proces solubilizacji, co pozwala na powrót do laboratorium i dokończenie izolacji RNA. Istnieje wielu producentów oferujących zestawy do mikroizolacji RNA, takich jak Amon, którego produkty preferujemy. I to wszystko.

W dzisiejszym materiale oprowadziłem Państwa po pracowni mikroskopii do mikrodysekcji laserowej tutaj, na UC Irvine. Zademonstrowaliśmy proces pobierania tkanek z mrożonych przekrojów na szkiełkach pokrytych folią Pen Foil w celu przygotowania do izolacji RNA z tych tkanek. Dziękuję za uwagę i życzę powodzenia w przeprowadzaniu własnych mikrodysekcji laserowych.