Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe kompleksu Mycobacterium tuberculosis dla leków pierwszego i drugiego rzutu przez rozcieńczenie bulionu w formie płytki do mikromiareczkowania

Dostępnych jest stosunkowo niewiele leków stosowanych w leczeniu prątków gruźlicy, więc oporność na jakikolwiek lek jest problemem. W tym artykule wideo opisano procedurę testowania oporności gruźlicy M na antybiotyki na 12 różnych leków mikrobiologicznych jednocześnie. W związku z tym zdolność do szybkiego wykrywania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe gruźlicy M jest bardzo ważna w wysiłkach na rzecz kontrolowania wzrostu oporności szczepów Here w celu zbadania wrażliwości na antybiotyki.

Gruźlica M jest najpierw hodowana na podłożu stałym lub w podłożu bulionowym, zawiesinie bakteryjnej. Po inkubacji inokulum przygotowuje się i dodaje do płytki do mikromiareczkowania zawierającej różne stężenia 12 leków, w tym leków pierwszego i drugiego rzutu. Stopień wzrostu w każdej studzience określa się ręcznie za pomocą skrzynki lustrzanej lub za pomocą półautomatycznego czytnika płytek.

Uzyskane dane wskazują minimalne stężenie hamujące dla każdego badanego leku i pokazują, na jakie antybiotyki badany szczep gruźlicy jest oporny. Wyniki te pomagają w wyborze odpowiedniego leku do leczenia gruźlicy. Cześć, nazywam się Nancy Ek i jestem dyrektorem Laboratorium Bakteriologicznego Myco w Klinice Mayo w Rochester w stanie Minnesota.

Dzisiaj opiszemy metodę wykonywania testów wrażliwości na antybiotyki w kierunku prątków gruźlicy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak rozcieńczanie bulionu makro, jest to, że dla każdego leku określa się wartość MIC i jednocześnie testuje się 12 antybiotyków. Procedurę zademonstruje Kurt Jude, specjalista ds. jakości w moim laboratorium, pracujący na stole laboratoryjnym.

Przygotuj się do tej procedury, oznaczając płytkę z agarem z krwią, trzy płytki Middlebrooks z siedmioma płytkami H 10, probówkę z soli fizjologicznej ze szklanych kulek i płytkę do mikromiareczkowania imieniem pacjenta i numerem identyfikacyjnym próbki. Dodatkowo oznacz agar z krwią i siedem płytek H 10 jako czyste. Zaznacz jedną z tych siedmiu płytek H 10 jako jedną do jednej liczby kolonii, a drugą jako jedną do 50 liczby kolonii.

Następnie umieść tacę w przejściu przelotowym. Następnie przygotuj się do pracy w placówce BSL trzeciego poziomu bezpieczeństwa biologicznego, zakładając solidny fartuch z przodu, rękawice zakrywające głowę, ochraniacze na buty i respirator. W tym przypadku używany jest respirator pappa.

Następnie wyjmij tacę z przejścia. Następnie w trzecim obiekcie BSL zdezynfekuj powierzchnię szafy bezpieczeństwa biologicznego. Następnie umieść ręcznik papierowy nasączony środkiem dezynfekującym wewnątrz okapu, około sześciu cali od panelu wentylacyjnego obok ręcznika papierowego.

Umieść pętle zaszczepiające, pipety i końcówki, odpowiedni pojemnik na odpady, nefi, TER i wir. Po przygotowaniu kaptura umieść organizm na ręczniku papierowym wraz ze stojakiem z bulionem McFarland 0,5 standard A seven H nine z OADC i rurką z soli fizjologicznej. Ta konfiguracja jest wykonana z solidnego, średniego materiału.

Przygotować inokulum z pożywki stałej z próbki pobranej od pacjenta. Użyj sterylnej pętli, aby zeskrobać kolonie i przenieś je do probówki z solą fizjologiczną ze szklanych koralików. Obracaj zawieszeniem przez 30 do 60 sekund.

Sprawdź wzrokowo próbkę, porównując ją ze wzorcem McFarlanda. Przekazywana kwota powinna być równa lub większa od standardowej. Jeśli nie, dodaj więcej próbki bakteryjnej i wiruj. Znów.

Po dopasowaniu standardu McFarlanda, pozwól inokulum osiąść na 15 minut, aby umożliwić osadzenie się większych grudek bakterii. Następnie użyj nefi TER, aby zmierzyć gęstość zawieszonych bakterii do zera. Nefi ter

Najpierw umieść pustą probówkę z kulkami soli fizjologicznej w nefi terze. Naciśnij przycisk kalibracji, aby wyzerować instrument, a następnie umieść wzorzec McFarland 0.5 w Nefi terze i ponownie naciśnij przycisk kalibracji. Po skalibrowaniu przyrządu usuń wzorzec McFarland i włóż inokulum.

Odczyt inokulum powinien być równy standardowemu odczytowi McFarlanda. Jeśli odczyt jest zbyt niski, wyjmij probówkę i przenieś więcej bakterii z płytki. Następnie przeprowadź wir i ponownie odczytaj próbkę.

Jeśli odczyt jest zbyt wysoki, dodaj tween soli fizjologicznej do wiru probówki. Następnie ponownie przeczytaj próbkę. Kontynuuj dostosowywanie inokulum w razie potrzeby, aż stężenie bakterii będzie zgodne ze standardem McFarlanda.

Następnie użyj pipetera o pojemności 200 mikrolitrów i długiej, odpornej na aerozol końcówki pipety, aby usunąć 100 mikrolitrów inokulum z górnej jednej trzeciej probówki. Aby uniknąć grudek, które osiadają na dnie inokulacji, bulion Middlebrook seven H nine powoli wiruje zaszczepiony bulion przez 20 sekund, aby pokryć inokulum Zacznij od wyjęcia płytki mikromiareczkowej z opakowania producenta. Jeśli środek osuszający jest niebieski lub jeśli opakowanie foliowe jest uszkodzone, nie używaj go.

Na płytce znajduje się już 12 środków przeciwdrobnoustrojowych, które mają być testowane w każdym dołku, w tym najskuteczniejsze leki pierwszego rzutu i leki drugiego rzutu. Ostrożnie wlać inokulum bulionu siedem H dziewięć do garnka, uważając, aby nie wytworzyć aerozoli. Następnie umieść płytkę mikromiareczkową z etykietą skierowaną na zewnątrz, jak pokazano tutaj, i użyj 12-kanałowego pipetera, aby dodać 100 mikrolitrów inokulum do każdej studzienki.

Następnie przygotuj płytki do przeprowadzenia liczenia kolonii. Najpierw należy przygotować nierozcieńczoną płytkę, przenosząc jednolitrową pętlę próbki z dołka kontroli pozytywnej do siedmiu płytek H 10 oznaczonych jeden do jednego. Następnie użyj pętli, aby narysować smugi na płycie, jak pokazano tutaj.

Następnie, aby przygotować rozcieńczenie od jednego do 50, przenieś pętlę o pojemności jednego mikrolitra ze studzienki kontroli pozytywnej i zawiruj ją w probówce z 50 mikrolitrami smugi wody. Jeden mikrolitr tego rozcieńczenia na płytce oznaczonej od jednego do 50. Zaszczepić płytki czystości przez pipetowanie 50 mikrolitrów inokulum z trth na odpowiednio oznakowany agar z krwią i siedem płytek H 10 i smugę do izolacji.

Następnie ułóż kolejną porcję na zaszczepionym pojemniku i delikatnie umieść je w pojemniku na odpady. Umieścić uszczelkę samoprzylepną na płytce do mikromiareczkowania. Następnie, używając białego podkładu, mocno dociśnij każdą studzienkę, aby zapewnić odpowiedni sufit, upewniając się, że nie ma zagnieceń.

Zdezynfekuj płytkę mikromiareczkowania, przecierając ją ręcznikiem papierowym nasączonym gruźliczym środkiem dezynfekującym do zabijania ludzi. Następnie umieść płytkę do mikromiareczkowania w plastikowej torbie i zamknij ją uszczelką termiczną. Na koniec zdezynfekuj wszystkie materiały, w tym nefi, wir ltra, płytki i rurki, przecierając je gruźliczym środkiem dezynfekującym.

W tym przypadku pro spray stosuje się po upływie wystarczającej ilości czasu, aby zapewnić dezynfekcję. 15 minut w przypadku sprayu pro. Talerze są oklejane taśmą klejącą umieszczaną w plastikowych torebkach, a zapieczętowane materiały eksploatacyjne są wyjmowane z szafy bezpieczeństwa biologicznego i umieszczane w przejściu przejściowym.

Odrzucona czerwona torba jest zamykana i uszczelniana skręcanym krawatem w tym momencie, zdejmuje się suknię, botki i rękawiczki. Po udaniu się do przedpokoju i umyciu rąk wyjmij respirator i zdezynfekuj go oraz przechowuj po ponownym umyciu rąk, załóż świeży fartuch i opuść apartament BSL trzy. Następnie pojemnik na odpady jest sterylizowany w autoklawie.

Następnie inkubuj płytkę do mikromiareczkowania i siedem płytek H 10 i ślimaka krwi prawą stroną do góry w inkubatorze o temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza z pięcioma do 10% CO2 w laboratorium BSL dwa. Jest to dopuszczalne, ponieważ płytka jest dobrze uszczelniona i znajduje się w plastikowej torbie, czas wytwarzania prątków gruźlicy wynosi około 12 do 24 godzin, więc minie co najmniej tydzień, zanim wzrost będzie można zobaczyć jako tworzenie się osadu komórkowego na dnie kontroli. Cóż, w dniu 10 wykonaj ręczny odczyt lustra, umieszczając zapieczętowane ostrze mikromiareczkowania ST na platformie pudełka z lustrem.

Użyj lampy biurkowej, aby pomóc w wizualizacji wzrostu, dostosuj w razie potrzeby, aby uzyskać najlepszy kontrast. Sprawdź studzienki kontrolujące wzrost w tym przypadku, H 11 i H 12, patrząc w lustro. Jeśli nastąpi wzrost, studnia będzie wydawać się mętna lub będzie wydawać się pokryta osadem, jak pokazano tutaj.

Jeśli nie ma wzrostu, jak pokazano w tym przykładzie, studnia będzie wydawać się czysta. W takim przypadku należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze i kontynuować inkubację przez okres do 21 dni. Dla każdego warunku porównaj wzrost z kontrolą.

Cóż, dla każdego zapisu leku, pierwsze rozcieńczenie, które nie ma wzrostu. Jest to minimalne stężenie hamujące lub MIC dla leku, aby zbadać wyniki za pomocą automatycznego czytnika płytek, takiego jak wizja, zacznij od otwarcia oprogramowania Myco TB a ST plate i zalogowania się na miejscu zapieczętowanej płytki z kodem kreskowym skierowanym na zewnątrz. Jak pokazano tutaj, wzrost pojawia się jako zmętnienie lub jako osad komórek na dnie studni na ekranie komputera.

Najpierw sprawdź kontrolę wzrostu. Tak jak poprzednio. Jeśli wynik jest ujemny dla wzrostu, należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na okres do 21 dni.

Jeśli wynik jest pozytywny, zapisz wyniki, dotykając pierwszej studzienki, która nie pokazuje wzrostu na ekranie dla każdego leku. W niektórych przypadkach bakterie, osad lub leki wytrącają się na dno studni. Zjawisko to, znane jako trailing, jest wskazywane przez kilka studni z granulkami tej samej wielkości i nie jest w rzeczywistości uważane za dodatni wzrost.

Następnie bada się siedem płytek H 10 i agar z krwią w celu określenia stężeń bakterii i oceny czystości. Na płytce z agarem z krwią nie powinien być widoczny wzrost po 48 godzinach. Narośl na płytce z agarem z krwią wskazuje na zanieczyszczenie szybko rozwijającymi się bakteriami.

W przypadku wzrostu należy powtórzyć próbę mikromiareczkowania. Na siedmiostopniowej płytce o czystości H 10 powinien znajdować się wzrost jednego organizmu. Gruźlica typu EM powinna wydawać się płowa, zabarwiona, pomarszczona i szorstka W przypadku zanieczyszczenia test mikromiareczkowy należy powtórzyć z czystej hodowli.

Aby ocenić stężenie bakterii, policz kolonie na siedmiu płytkach H 10. Następnie, korzystając z tabeli w dołączonym dokumencie pisemnym, oblicz liczbę kolonii. Mycobacterium tuberculosis wyhodowano z próbki pacjenta, a oporność na antybiotyki oceniono zgodnie z opisem w tym filmie na pokazanej tutaj tabliczce, 12 różnych leków jest obecnych w rosnących stężeniach, przy czym najwyższe stężenia znajdują się na górze, a najniższe na dole.

Minimalne stężenie hamujące lub MIC leku zostało wskazane przez najniższe stężenie leku, które nie wykazało żadnego wzrostu i jest zakreślone na pokazanym tutaj obrazie przy użyciu standaryzowanych punktów granicznych ustalonych przez Instytut Standardów Klinicznych i Laboratoryjnych. Przedstawione tutaj dane sugerują, że ten szczep gruźlicy będzie oporny na Isid i Rifampin. W warunkach in vitro wysokie wartości mic obserwowane w kilku innych lekach, w tym w oinie, moksyfloksacynie, streptomycynie i ryfabutynie, sugerują oporność szczepu gruźlicy EM na te środki.

Wyniki MIC powinny być wykorzystane przez specjalistę chorób zakaźnych doświadczonego w leczeniu gruźlicy w celu opracowania zindywidualizowanego planu leczenia: Po opanowaniu tej techniki ustawienie jednego izolatu zajmuje około 40 minut. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że jest to patogen układu oddechowego, a po wygenerowaniu kropek aerozoli, po obejrzeniu tego filmu, powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować mycobacterium tuberculosis, badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe metodą rozcieńczania mikrobulionu. Nie zapominaj, że praca z prątkami gruźlicy może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak ochrona dróg oddechowych, powinny być zawsze podejmowane tam, gdzie jest to wymagane.