Name: Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe kompleksu Mycobacterium tuberculosis dla leków pierwszego i drugiego rzutu przez rozcieńczenie bulionu w formie płytki do mikromiareczkowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Poznaj metodę mikromiareczkowania do równoczesnego testowania wrażliwości Mycobacterium tuberculosis na 12 leków przeciwgruźliczych. Technika ta umożliwia szybkie oznaczenie wartości MIC i wybór odpowiedniego leczenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować technikom laboratoryjnym z Laboratorium Mykobakteriologii Mayo Clinic za pomoc podczas badania.

Każde laboratorium powinno przeprowadzić ocenę ryzyka we współpracy z instytucjonalnym inspektorem ds. bezpieczeństwa biologicznego, aby określić odpowiedni poziom bezpieczeństwa biologicznego dla przygotowania inokulum oraz dla pipetowania inokulum do płytki. W naszym laboratorium stosujemy praktyki właściwe dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL3) aż do momentu zaszczepienia płytek mikrotitracyjnych i zamknięcia ich plastikową plombą adhezyjną. Płytki te są następnie umieszczane w plastikowej torebce, która jest zgrzewana termicznie. Inkubacja i odczyt interpretacyjny płytki mikrotitracyjnej są przeprowadzane w laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2).
1. Etykietowanie materiałów
<ol>
 <li>W laboratorium BSL2 opisz płytkę z agarem krwawym, trzy płytki Middlebrook 7H10, bulion Middlebrook 7H9, probówkę z koralikami szklanymi z solą i Tweenem oraz płytkę mikrotytrową AST, wpisując odpowiednie dane identyfikacyjne (np. imię i nazwisko pacjenta, numer historii choroby).</li>
 <li>Oznacz agar krwawy i płytki 7H10 jako „kontrola czystości”. Zaleca się okresowe przeliczanie kolonii inokulum, aby upewnić się, że w teście zastosowano odpowiednie stężenie drobnoustrojów. W przypadku przeprowadzania przeliczeń kolonii, dwie z płytek 7H10 należy opisać jako „przeliczanie kolonii 1/1” oraz „przeliczanie kolonii 1/50”.</li>
</ol>
2. Przygotowanie technologa do wejścia do laboratorium BSL3
<ol>
 <li>Do pracy w laboratorium poziomu BSL3 niezbędne są odpowiednie środki ochrony indywidualnej, w tym fartuch z pełnym przodem, nakrycie głowy, rękawice, ochraniacze na obuwie oraz respirator. Każda instytucja powinna opracować własny plan ochrony dróg oddechowych we współpracy z instytucjonalnym specjalistą ds. higieny pracy. W naszym laboratorium dostępnych jest kilka rodzajów respiratorów, w tym zasilane respiratory oczyszczające powietrze (PAPRs) oraz dopasowane półmaski z filtrem HEPA N95.</li>
 </ol>
3. Przygotowanie komory bezpiecznej biologicznie
<ol>
 <li>W laboratorium BSL3 przygotować komorę z laminarnym przepływem powietrza (BSC), dezynfekując jej powierzchnię i umieszczając ręcznik papierowy nasączony środkiem dezynfekującym w odległości około 6 cali od panelu wentylacyjnego.</li>
 <li>Po lewej stronie ustawić pojemnik na odpady, a po prawej niewielki nefelometr oraz wortex.</li>
 <li>Pętle do szczepienia, pipety i końcówki umieścić obok ręcznika papierowego.</li>
 <li>Na ręczniku papierowym ustawić statyw z organizmem (w bulionie lub na podłożu stałym) oraz wzorzec McFarland 0.5.</li>
</ol>
4. Kalibracja nefelometru
<ol>
 <li>Umieść probówkę z koralikiem szklanym w roztworze soli fizjologicznej z Tweenem w nefelometrze i wyzeruj instrument, używając próbki ślepej z soli fizjologicznej z Tweenem.</li>
 <li>Umieść wzorzec McFarland 0.5 w nefelometrze i przeprowadź kalibrację zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
5. Przygotowanie inokulum
<ol>
 <li>Pracując w BSC, zebrać kolonie z podłoża stałego za pomocą sterylnej pętlki do odpowiednio oznakowanej probówki z szklanymi kuleczkami zawierającej roztwór soli fizjologicznej z Tweenem, aż do uzyskania mętności odpowiadającej standardowi McFarland ≥0,5.</li>
 <li>Przeprowadzić wizualną ocenę próbki i porównać ją ze standardem McFarland.</li>
 <li>Mieszać próbkę w wirówce vortex przez 30-60 sekund.</li>
 <li>Pozostawić inokulum do osadzenia na 15 minut (nastawić minutnik).</li>
 </ol>

6. Inokulacja płytki mikrotitracyjnej

 <ol>
 <li>Dostosuj miano inokulum za pomocą bulionu solno-tweenowego, korzystając z nefelometru skalibrowanego do standardu McFarland 0,5 zgodnie z krokami 4.1 i 4.2. Czynność tę należy wykonać w ciągu 30 minut (zgodnie ze specyfikacją producenta). </li>
 <li>Użyj a 200 μL pipetkę oraz DŁUGĄ końcówkę do pipetki z filtrem zapobiegającym tworzeniu się aerozoli do usunięcia 100 μL inakulum z górnej 1/3 częścird z probówki z kuleczkami solnymi i Tweenem. Zaszczepić bulion Middlebrooka 7H9. Zaszczepiony bulion 7H9 powoli mieszać w wortexie przez 20 sekund. </li>
 <li>Wyjmij płytkę mikrotitracyjną do testów AST z opakowania producenta. NIE używać, jeśli osuszacz ma kolor niebieski lub jeśli opakowanie z folii jest uszkodzone.</li>
 <li>Przygotować probówkę do rozcieńczenia 1:50, która zostanie wykorzystana później podczas sporządzania rozcieńczenia 1:50 za pomocą pipety 50 μL sterylnej wody do sterylnej probówki.</li>
 <li>Ostrożnie przelej inokulum w bulionie 7H9 do koryta. UNIKAJ GENEROWANIA AEROZOLI.</li>
 <li>Umieść płytkę mikrotitracyjną do badania AST etykietą skierowaną w Twoją stronę.</li>
 <li>Za pomocą pipety 12-kanałowej należy dodać 100 μL inokulum do każdej studzienki. </li>
 <li>Przygotowanie rozcieńczeń do zliczania kolonii:
 <ol type="a">
 <li>Rozcieńczenie 1:1 przygotowuje się poprzez przenoszenie próbki z dołka kontroli pozytywnej (H12). 1 μl pętlą na płytce 7H10 oznakowanej jako „1/1”.</li>
 <li>Rozcieńczenie 1/50 przygotowuje się poprzez zaszczepienie 1 μl pętlę z dołka kontroli pozytywnej (H12) i wymieszać ją w probówce z 50 μl z przygotowanej powyżej probówki z wodą. Wykonaj posiew kreskowy 1 μL tego rozcieńczenia na płytkę opisaną jako „1/50”. </li>
 </ol></li>

 <li>Zaszczepić płytki do kontroli czystości z koryta za pomocą pipety 50 μL na odpowiednio oznakowane płytki z agarem krwi oraz podłoże 7H10, a następnie wykonać posiew w celu izolacji. </li>
 <li>Na płytkę mikrotitracyjną AST nałożyć uszczelniającą folię przylepną. Docisnąć mocno każde dołkowanie, korzystając z białej strony folii, aby zapewnić odpowiednie uszczelnienie. Należy unikać powstawania zagięć. </li>
 <li>Zdezynfekuj płytkę mikrotitracyjną, przecierając ją ręcznikiem papierowym nasączonym środkiem dezynfekcyjnym o działaniu tuberkulocydowym, a następnie umieść płytkę mikrotitracyjną w plastikowej torbie i zamknij ją za pomocą zgrzewarki termicznej lub taśmy. 
 <ol type="a">
 <li>Plastikowy worek służy jako pojemnik zewnętrzny, aby zapewnić zatrzymanie całej zawartości pożywki w przypadku wycieku lub rozlania z podstawowej płytki.</li>
 </ol></li>
 </ol>
7. Dezynfekcja materiałów i komory bezpieczeństwa biologicznego
 <ol>
 <li>Aby uniknąć powstawania aerozoli, na wierzchu zaszczepionej korytka należy położyć drugie korytko, a następnie ostrożnie umieścić je w pojemniku na odpady.</li>
 <li>Wszystkie materiały, w tym nefelometr, wstrząsarkę, płytki, probówki itp., należy zdezynfekować, przecierając je środkiem dezynfekcyjnym o działaniu przeciwprątkowym, a następnie odczekać odpowiedni czas w celu zapewnienia dezynfekcji zgodnie z instrukcją producenta przed wyjęciem z BSC. Na przykład stosowany przez nas środek przeciwprątkowy Prospray wymaga 15 minut do zniszczenia prątków.</li>
 <li>Pojemnik na odpady należy umieścić w worku na odpady biologiczne i szczelnie zamknąć przed autoklawowaniem.</li>
 </ol>
8. Inkubacja
 <ol>
 <li>Płytki należy inkubować stroną z pożywką do dołu, zachowując ostrożność, aby uniknąć rozlania lub rozpryskania cieczy. </li>
 <li>Inkubować płytkę mikrotitracyjną do AST, podłoża 7H10 oraz płytki z agarem krwi w temperaturze 35-37°C inkubator z 5-10% CO22 z dodatkiem 5-10% CO2 w laboratorium poziomu BSL2.
 <ol class="lalpha">
 <li>W naszym laboratorium jest to dopuszczalne, ponieważ płytka jest szczelnie zamknięta i znajduje się w zamkniętej plastikowej torbie. </li>
 </ol></li>
 <li>Zgodnie z instrukcjami producenta, w inkubatorze nie należy układać w stosie więcej niż 2 mikrotitracyjnych płytek AST.</li>
 </ol>
9. Reprezentatywne wyniki
Interpretacja wyników:
Zapieczętowane płytki mikrotitracyjne AST można odczytywać ręcznie, wspomagając się lustrem, lub za pomocą automatycznego czytnika płytek, takiego jak Vizion (TREK Diagnostics). Płytki można badać już 7 dni po inokulacji. Należy sprawdzić studzienki kontroli wzrostu w pozycjach H11 i H12, aby określić, czy są one dodatnie (tj. czy na dnie studzienki znajduje się osad komórkowy). Jeśli studzienki kontroli wzrostu nie są dodatnie, płytkę należy ponownie inkubować i okresowo badać (np. w 10. dniu, 14. dniu), aż studzienki kontroli wzrostu staną się dodatnie.
 <ol type="a">
 <li>Odczyt metodą lustrzaną: 
 <ol type="i">
 <li>Umieść zamkniętą płytkę mikrotitracyjną AST na platformie; </li>
 <li>Odczytaj dołki kontroli wzrostu po 7 dniach inkubacji; jeśli wynik jest negatywny, poddaj płytkę mikrotitracyjną AST ponownej inkubacji; </li>
 <li>Jeśli kontrole wzrostu są akceptowalne, odczytaj dołki zawierające lek. Dla każdego leku zapisz pierwsze rozcieńczenie, w którym nie stwierdzono wzrostu, porównując dołki z lekiem z kontrolą wzrostu. </li>
 <li>Wzrost objawia się jako zmętnienie lub osad komórek na dnie dołka. </li>
 </ol></li>
 <li>Odczyt instrumentalny: postępuj zgodnie z instrukcjami producenta; poniższe instrukcje są przykładem sposobu wykonania odczytu na platformie Vizion:
 <ol type="i">
 <li>Zaloguj się. </li>
 <li>Użyj oprogramowania do płytek AST „MYCOTB”.</li>
 <li>Umieść zamkniętą płytkę kodem kreskowym skierowanym w stronę użytkownika. Wzrost objawia się jako zmętnienie lub osad komórek na dnie dołka. </li>
 <li>Odczytaj kontrole wzrostu; jeśli wynik jest negatywny, poddaj płytkę mikrotitracyjną AST ponownej inkubacji; jeśli wynik jest pozytywny, odczytaj płytkę, dotykając ekranu w miejscu pierwszego dołka dla każdego leku, w którym nie występuje wzrost.</li>
 </ol></li>
 </ol>
Odczytaj płyty czystości. Płyta z agarem krwi nie powinna wykazywać wzrostu po 48 godzinach, a płyta czystości 7H10 powinna wykazywać zlewne wzrost jednego typu organizmu. W przypadku zanieczyszczenia test mikrotitracyjny AST musi zostać powtórzony z czystej kultury.

Oblicz liczbę kolonii w studzience kontroli pozytywnej, korzystając z poniższej tabeli:

Klucz do liczenia kolonii
<table border="1">
<tbody>
<tr>
 <td>Liczba kolonii policzonych na płytce oznaczonej jako „1/1”</td>
 <td>Liczba kolonii policzonych na płytce oznaczonej jako „1/50”</td>
 <td>Liczba kolonii w inokulum (cfu/mL)</td>
</tr>

<tr>
 <td>&lt;50</td>
 <td>0</td>
 <td>&lt;5 X 104</td>
</tr>

<tr>
 <td>50-100</td>
 <td>0-2</td>
 <td>5 X 104 do 1 X 105</td>
</tr>

<tr>
 <td>&gt;100</td>
 <td>≤ 10</td>
 <td>1 X 105 do 5 X 105</td>
</tr>

<tr>
 <td>&gt;100</td>
 <td>&gt;10</td>
 <td>&gt;5 X 105</td>
</tr>
</tbody>
</table>

W niektórych szczepach Mycobacterium tuberculosis może występować zjawisko rozmycia (trailing) w przypadku kwasu p-aminosalicylowego. Można to zinterpretować, analizując wszystkie studzienki zawierające osad i przyjmując za punkt końcowy pierwszą studzienkę, w której osad ma taką samą wielkość jak w kolejnym rozcieńczeniu. Oporność na ten lek występuje rzadko.

<img src="/files/ftp_upload/3094/3094fig1.jpg" alt="Test podatności na antybiotyki; metoda mikrorozcieńczeń; eksperymentalna analiza oporności na leki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu płytki MYCOTB.

<table border="1">
<tbody>
<tr>
 <td>Skrót nazwy leku</td>
 <td>Lek</td>
 <td>MIC μ/ml</td>
</tr>
<tr>
 <td>OFL</td>
 <td>ofloksacyna</td>
 <td>16</td>
</tr>
<tr>
 <td>MXF</td>
 <td>moksiflocacyna</td>
 <td>8</td>
</tr>
<tr>
 <td>RIF</td>
 <td>ryfampicyna</td>
 <td>&gt;16</td>
</tr>
<tr>
 <td>AMI</td>
 <td>amikacyna</td>
 <td>0.5</td>
</tr>
<tr>
 <td>STR</td>
 <td>streptomycyna</td>
 <td>16</td>
</tr>
<tr>
 <td>RFB</td>
 <td>rifabutyna</td>
 <td>8</td>
</tr>
<tr>
 <td>PAS</td>
 <td>kwas p-aminosalicylowy</td>
 <td>≤0.5</td>
</tr>
<tr>
 <td>ETH</td>
 <td>etionamid</td>
 <td>5</td>
</tr>
<tr>
 <td>CYC</td>
 <td>cykloseryna</td>
 <td>4</td>
</tr>
<tr>
 <td>INH</td>
 <td>izoniazyd</td>
 <td>2</td>
</tr>
<tr>
 <td>KAN</td>
 <td>kanamycyna</td>
 <td>1.2</td>
</tr>
<tr>
 <td>EMB</td>
 <td>etambutol</td>
 <td>4.0</td>
</tr>
</tbody>
</table>

<ol><li>Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., Parrish, N. Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs. Presented at 50th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 Sept. 12, Boston, MA, , Abstract 2450 (2010).</li>
<li>HHS Publication No. (CDC) 21-112: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22U.S.+Department+of+Health+and+Human+Services+Centers+for+Disease+and+Preventions%22">U.S. Department of Health and Human Services Centers for Disease and Preventions</a>. , 5th Edition, National Institutes of Health. (2009).</li>
<li>Morcillo, N., Imperiale, B., Digiulio, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+MGIT+960+and+the+colorimetric-based+method+for+tuberculosis+drug+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Tuberc+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of MGIT 960 and the colorimetric-based method for tuberculosis drug susceptibility testing.</a> Int J Tuberc Lung Dis. 14, 1169-1175 (2010).</li>
<li>Bemer, P., Bodmer, T., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V., Drugeon, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+Evaluation+of+the+MB%2FBACT+System+for+Susceptibility+Testing+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multicenter Evaluation of the MB/BACT System for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 42, 1030-1034 (2004).</li>
<li>SENSITITRE MYCOTB Susceptibility Plate: For Mycobacterium Susceptibility Testing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Product+Insert%22">Product Insert</a>. , TREK Diagnostic Systems. Cleveland, OH. (2010).</li>
<li>CLSI. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Susceptiblity+Testing+of+Mycobacteria%2C+Nocardia%2C+and+Other+Aerobic+Actinomycetes%3B+Approved+Standard.+Document+M24-A%22">Susceptiblity Testing of Mycobacteria, Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard. Document M24-A</a>. , CLSI. Wayne, Pennsylvania. (2003).</li>
<li>Sullivan, N., Sotos, J., Anhalt, K., Allen, S. Preliminary results from a new TREK Sensititre Mycobacterium tuberculosis MIC plate (MYCOTB). C-151 presented at 110th American Society for Microbiology, Annual Meeting, San Diego, CA, , Abstract C-151 (2010).</li>
<li>VersaTREK MYCO SUSCEPTIBLITY KIT. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Product+insert%22">Product insert</a>. , TREK Diagnostic Systems. Cleveland, OH. 7115-7160 (2008).</li>
<li>Parrish, N. M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Clinical+Mycobacteriology+Laboratory+in+the+Diagnosis+and+Management+of+Tuberculosis+in+Low+Prevalance+Settings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Role of the Clinical Mycobacteriology Laboratory in the Diagnosis and Management of Tuberculosis in Low Prevalance Settings.</a> J Clin Microbiol. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Kam, K. M., Sloutsky, A., Yip, C. W., Bulled, N., Zingol, M., Espinal, M., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+critical+concentrations+of+second-line+anti-tuberculosis+drugs+with+clinical+and+microbiological+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Tubercl+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">Determination of critical concentrations of second-line anti-tuberculosis drugs with clinical and microbiological relevance.</a> Int J Tubercl Lung Dis. 14, 282-288 (2010).</li>
<li>Woods, G. L., Warren, N. G., Inderlied, C. B. Susceptibility Test Methods: Mycobacteria, Nocardia, and Other Actinomycetes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoods%2C+GL+%22Manual+of+Clinical+Microbiology%22">Manual of Clinical Microbiology</a>. Murray, P. R., Barron, E. J., Jorgensen, J. H., Landry, M. L., Pfaller, M. A. , 9th Ed, ASM Press. Washington DC. 1223-1247 (2007).</li>
<li>Bergmann, J. S., Woods, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+ESP+Culture+System+II+for+Testing+Susceptibilities+of+Mycobacterium+tuberculosis+Isolates+to+Four+Primary+Antituberculosis+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs.</a> J Clin Microbiol. 36, 2940-2943 (1998).</li>
</ol>

Nie ma nic do ujawnienia.

Przykład płytki mikrotytracyjnej do AST z dodatnimi kontrolami wzrostu przedstawiono na Rysunku 1, gdzie zaznaczono końcowe MIC (μg/ml) dla każdego leku. Badanie przeprowadzone w naszym laboratorium wykazało, że metoda płytki mikrotytracyjnej AST jest równoważna ze złotym standardem, jakim jest metoda proporcji na agarze, w badaniu wrażliwości Mycobacterium tuberculosis. Szybsze raportowanie wyników uzyskano przy zastosowaniu płytki mikrotytracyjnej AST w porównaniu z tradycyjną metodą proporcji na agarze, przy czym ostateczna interpretacja dla płytki mikrotytracyjnej AST i metody proporcji na agarze nastąpiła odpowiednio w 14. i 21. dniu. Płytka mikrotytracyjna AST daje możliwość jednoczesnego testowania leków pierwszego i drugiego rzutu, co może pomóc zapobiec nadmiernym opóźnieniom w przypadku szczepów opornych. Płytka mikrotytracyjna AST jest również znacznie łatwiejsza w przygotowaniu i odczycie niż APM; do odczytu płytek można użyć zarówno ręcznego lusterka, jak i systemu półautomatycznego, takiego jak VIZION. Dostępność wartości MIC w badaniu oporności prątków gruźlicy na leki może dostarczyć lekarzom cennych nowych informacji w porównaniu z tradycyjną wartością stężenia krytycznego, zwłaszcza w przypadku izolatów o wrażliwości „granicznej”.

<table><tbody><tr><td>płytki mikrotitracyjne do AST i uszczelka adhezyjna</td><td>TREK Diagnostics, Thermo Scientific</td><td>MYCOTB</td><td></td></tr><tr><td>standard McFarland 0,5</td><td>TREK Diagnostics, Thermo Scientific</td><td>E1041</td><td></td></tr><tr><td>płytki z podłożem Middlebrook 7H10</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki z agarem krwi</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pętliki sterylne 1 &amp;mu;L</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pętle sterylne 10 &amp;mu;L</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bulion z szklanymi kuleczkami Sensititre Saline-Tween</td><td>TREK Diagnostics, Thermo Scientific</td><td>27143</td><td></td></tr><tr><td>Bulion 7H9 OADC</td><td>TREK Diagnostics, Thermo Scientific</td><td>T3440</td><td></td></tr><tr><td>Długie końcówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne korytka</td><td>TREK Diagnostics, Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;*M. tuberculosis*&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>27294</td><td></td></tr><tr><td>Pipety: 1000, 200, 20&amp;mu;L</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>końcówki 1000, 20, 20 &amp;mu;L</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator 5-10% CO2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Worki plastikowe, małe, CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; przepuszczalny</td><td>Wyroby z tworzyw sztucznych</td><td></td><td></td></tr><tr><td>środek dezynfekcyjny do zwalczania prątków gruźlicy (np. ProSpray C-60)</td><td>Certol International, Commerce City, CO</td><td>PSC60/32</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik Mirror Box</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

badanie wrażliwości kompleksu mycobacterium tuberculosis na leki pierwszego i drugiego rzutu metodą rozcieńczeń w bulionie z wykorzystaniem płytek mikrotitracyjnych

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

Szybka detekcja oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe jest istotna w wysiłkach na rzecz kontroli wzrostu liczby opornych szczepów Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Badania wrażliwości przeciwdrobnoustrojowej (AST) Mtb były tradycyjnie przeprowadzane metodą proporcji na agarze lub testami w makrobulionie przy użyciu urządzeń takich jak BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) lub BacT/ALERT (bioMérieux, Hazelwood, MO). Metoda proporcji na agarze, choć uznawana za „złoty” standard AST, jest pracochłonna i wymaga obliczenia oporności poprzez przeliczanie kolonii na agarze zawierającym lek w porównaniu z agarem bez leku. Jeśli wzrost na podłożu zawierającym lek wynosi ≥1% w porównaniu z podłożem bez leku, organizm uznaje się za oporny na ten lek. Metody w makrobulionie wymagają specjalistycznej aparatury oraz ustalenia krytycznych stężeń leków („punktów odcięcia”) dla leków pierwszego rzutu (izoniazydu, etambutolu, ryfampicyny i pirazynamidu). Metoda opisana w niniejszym opracowaniu jest dostępna komercyjnie w formacie 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej [MYCOTB (TREK Diagnostics)] i zawiera rosnące stężenia 12 środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych w leczeniu gruźlicy, w tym leki pierwszego (izoniazyd, ryfampicyna, etambutol) i drugiego rzutu (amikacyna, cykloseryna, etionamid, kanamycyna, moksyfloksacyna, ofloksacyna, kwas para-aminosalicylowy, ryfabutyna i streptomycyna). Pirazynamid, lek pierwszego rzutu, nie jest zawarty na płytce mikrotitracyjnej ze względu na konieczność zapewnienia kwasowych warunków testowych. Zalety systemu mikrotitracyjnego obejmują zarówno łatwość przygotowania, jak i krótszy czas oczekiwania na wynik (14 dni) w porównaniu z tradycyjną metodą proporcji na agarze (21 dni). Dodatkowo, płytkę można przygotować z inokulum sporządzonym z bulionu lub podłoża stałego. Ponieważ format płytki mikrotitracyjnej jest nowy, a Mtb stwarza wyjątkowe wyzwania w zakresie bezpieczeństwa w laboratorium, niniejszy protokół opisuje sposób bezpiecznego przygotowania, inkubacji i odczytu płytki mikrotitracyjnej.

Badanie wrażliwości Mycobacterium tuberculosis na środki przeciwdrobnoustrojowe jest trudne, lecz kluczowe dla opieki nad pacjentem. Ten format z użyciem płytek mikrotytrujących umożliwia przetestowanie 12 leków przeciwprątkowych i pozwala wyznaczyć wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC), co pomoże w doborze odpowiedniego leczenia.

Badanie wrażliwości kompleksu Mycobacterium tuberculosis na leki pierwszego i drugiego rzutu metodą rozcieńczeń w bulionie z wykorzystaniem płytek mikrotitracyjnych

Szybka detekcja oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe jest istotna w wysiłkach mających na celu ograniczenie wzrostu liczby opornych szczepów Mycobacterium tuberculosis (Mtb). ...

Dostępnych jest stosunkowo niewiele leków do leczenia mycobacterium tuberculosis, dlatego oporność na jakikolwiek preparat jest kwestią niepokojącą. Niniejszy artykuł wideo opisuje procedurę jednoczesnego badania oporności M tuberculosis na 12 różnych leków przeciwdrobnoustrojowych. Zatem zdolność do szybkiego wykrywania oporności M tuberculosis na leki przeciwdrobnoustrojowe jest bardzo istotna w wysiłkach na rzecz ograniczenia wzrostu liczby szczepów opornych, co służy tutaj do testowania wrażliwości na antybiotyki.Próbki M tuberculosis są najpierw hodowane na podłożach stałych lub w pożywkach płynnych w celu uzyskania zawiesiny bakteryjnej. Inokulum jest przygotowywane i nanoszone na płytkę mikrotitracyjną zawierającą różne stężenia 12 leków, w tym leków pierwszego i drugiego rzutu. Po inkubacji stopień wzrostu w każdej studzience jest określany ręcznie przy użyciu lustrzanego pudełka lub za pomocą półautomatycznego czytnika płytek.Otrzymane dane wskazują minimalne stężenie hamujące dla każdego z badanych leków i pokazują, na które antybiotyki oporny jest badany szczep prątków gruźlicy. Wyniki te pomagają w wyborze odpowiedniego leku do leczenia gruźlicy. Dzień dobry, nazywam się Nancy Ek i jestem dyrektorem Laboratorium Mykobakteriologii w Mayo Clinic w Rochester w stanie Minnesota.W dzisiejszym materiale przedstawimy metodę przeprowadzania testów wrażliwości *Mycobacterium tuberculosis* na antybiotyki. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak makrorozcieńczanie w bulionie, jest możliwość wyznaczenia MIC dla każdego leku oraz jednoczesnego przetestowania 12 antybiotyków. Procedurę zaprezentuje Kurt Jude, specjalista ds. jakości w moim laboratorium, pracujący przy stole laboratoryjnym.W celu przygotowania do tej procedury należy oznakować płytkę z agarem krwi, trzy płytki Middlebrooks 7H10, probówkę z kuleczkami szklanymi zawierającą roztwór soli fizjologicznej z Tweenem oraz płytkę mikrotitracyjną, wpisując imię i nazwisko pacjenta oraz numer identyfikacyjny próbki. Dodatkowo, płytkę z agarem krwi oraz płytki 7H10 należy oznakować jako kontrolę czystości. Jedną z płytek 7H10 należy oznaczyć jako przeliczenie kolonii 1:1, a drugą jako przeliczenie kolonii 1:50.Następnie umieść tacę w śluzie transferowej. W kolejnym kroku przygotuj się do pracy w laboratorium poziomu trzeciego bezpieczeństwa biologicznego BSL-3, zakładając fartuch z pełnym przodem, osłonę głowy, rękawiczki, ochraniacze na obuwie oraz respirator. W tym przypadku zastosowano respirator PAPR.Następnie wyjmij tacę z okna podawczego. W następnym kroku, w laboratorium poziomu BSL 3, zdezynfekuj powierzchnię komory bezpieczeństwa biologicznego. Następnie umieść wewnątrz wyciągu ręcznik papierowy nasączony środkiem dezynfekującym, w odległości około six inches od panelu wentylacyjnego, obok ręcznika papierowego.Przygotuj pętle do szczepienia, pipety i końcówki, odpowiedni pojemnik na odpady, nephi, TER oraz wirówkę typu vortex. Po przygotowaniu dygestorium umieść organizm na ręczniku papierowym wraz ze statywem zawierającym standard McFarland 0,5, bulion A seven H nine z OADC oraz probówkę z koralikiem w soli fizjologicznej. Przygotowanie to jest wykonywane z podłoża stałego.Przygotować inokulum z hodowli na podłożu stałym z próbki pacjenta. Za pomocą sterylnej pętlki zebrać kolonie i przenieść je do probówki z kuleczkami szklanymi zawierającej roztwór soli fizjologicznej z Tweenem. Mieszać zawiesinę w wstrząsarzu typu vortex od 30 do 60 sekund.Przeprowadź kontrolę wizualną próbki, porównując ją ze standardem McFarlanda. Ilość przeniesionego materiału powinna być równa lub większa niż w przypadku standardu. Jeśli nie jest tak w rzeczywistości, dodaj więcej próbki bakteryjnej i ponownie wymieszaj w wirówce vortex.Po dopasowaniu do standardu McFarlanda należy odstawić inokulum na 15 minut, aby większe skupiska bakterii mogły opaść na dno. Następnie należy użyć nefelometru do zmierzenia gęstości zawiesiny bakterii do zera. Nefelometr.Najpierw umieść w nefelometrze probówkę z pustym koralikiem solnym. Naciśnij przycisk kalibracji, aby wyzerować instrument, a następnie umieść w nefelometrze wzorzec McFarland 0.5 i ponownie naciśnij przycisk kalibracji. Po skalibrowaniu instrumentu wyjmij wzorzec McFarland i włóż inokulum.Odczyt inokulum powinien być równy odczytowi standardu McFarlanda. Jeśli odczyt jest zbyt niski, należy wyjąć probówkę i przenieść z płytki więcej bakterii. Następnie próbkę należy wymieszać w wortexie i ponownie odczytać jej wartość.Jeśli odczyt jest zbyt wysoki, należy dodać do probówki roztwór soli fizjologicznej z Tweenem i wymieszać w wortexie. Następnie ponownie odczytać próbkę. Kontynuować regulację inokulum w razie potrzeby, aż stężenie bakterii będzie zgodne ze standardem McFarlanda.Następnie, używając pipety 200 µl oraz długiej końcówki z filtrem zapobiegającym aerozolom, pobierz 100 µl inokulum z górnej jednej trzeciej probówki. Aby uniknąć grudek osadzających się na dnie bulionu Middlebrook 7H9, powoli wymieszaj inokulowany bulion wirówką przez 20 sekund przed wysianiem inokulum na płytkę. Rozpocznij od wyjęcia płytki mikrotitracyjnej z opakowania producenta. Jeśli osuszacz jest niebieski lub opakowanie z folii jest uszkodzone, nie należy go używać.Płytka zawiera już 12 środków przeciwdrobnoustrojowych do przetestowania w każdej studni, w tym leki najskuteczniejsze lub pierwszego rzutu oraz leki drugiego rzutu. Ostrożnie przelej inokulum w bulionie H nine do probówki, dbając o to, aby nie generować aerozoli. Następnie umieść płytkę do miareczkowania mikrobiologicznego etykietą skierowaną na zewnątrz, jak pokazano tutaj, i za pomocą pipety 12-kanałowej dodaj 100 µL inokulum do każdej studni.Następnie należy przygotować płytki do zliczania kolonii. Najpierw przygotuj płytkę bez rozcieńczenia, przenosząc za pomocą pętli o objętości 1 µL próbkę z dołka kontroli pozytywnej na płytkę 7H10 oznaczoną jako 1:1. Następnie użyj pętli, aby wykonać posiew na płytce, jak pokazano tutaj.Następnie, aby przygotować rozcieńczenie 1:50, przenieś pętlę o objętości 1 µL z dołka kontroli pozytywnej i zamieszaj nią w probówce zawierającej 50 µL wody. Nanieś 1 µL tego rozcieńczenia na płytkę oznaczoną jako 1:50. Zaszczep płytki do kontroli czystości, pipetując 50 µL inokulum z pożywki na odpowiednio oznaczone agar krwi oraz płytki 7H10, a następnie wykonaj posiew w celu izolacji kolonii.Następnie na zaszczepionym podłożu TRTH ułóż drugą warstwę podłoża TRTH i ostrożnie umieść je w pojemniku na odpady. Na płytkę mikrotitracyjną nałóż uszczelkę adhezyjną. Następnie, korzystając z białej podkładki, mocno dociśnij każdą studzienkę, aby zapewnić odpowiednie uszczelnienie, dbając o to, by nie powstały żadne zagięcia.Zdezynfekuj płytkę mikrotitrową, przecierając ją ręcznikiem papierowym nasączonym środkiem dezynfekcyjnym o działaniu przeciwprątkowym. Następnie umieść płytkę mikrotitrową w plastikowej torbie i zamknij ją za pomocą zgrzewarki termicznej. Na koniec zdezynfekuj wszystkie materiały, w tym pipety, wirówkę typu vortex, płytki i probówki, przecierając je środkiem dezynfekcyjnym o działaniu przeciwprątkowym.W tym przypadku spray do dezynfekcji jest stosowany po upływie czasu wystarczającego do zapewnienia pełnej sterylizacji. W przypadku tego preparatu czas oczekiwania wynosi 15 minut. Płytki są zaklejone taśmą klejącą, umieszczone w plastikowych workach, a szczelnie zamknięte materiały są usuwane z komory bezpiecznej biologicznie i przenoszone do śluzy.W tym momencie czerwony worek na odpady zostaje zamknięty i uszczelniony za pomocą wiązadła, a następnie zdejmuje się fartuch, ochraniacze na buty oraz rękawice. Po przejściu do pomieszczenia śluzy i umyciu rąk, należy zdjąć respirator, a po ponownym umyciu rąk zdezynfekować go i schować; następnie zakłada się nowy fartuch i opuszcza strefę BSL 3. Następnie pojemnik z odpadami poddaje się autoklawowaniu.Następnie inkubuj płytkę mikrotitracyjną oraz siedem płytek H 10 i blood auger w pozycji poziomej w inkubatorze w temperaturze 35 do 37 °C z 5 do 10% CO2 w laboratorium BSL 2. Jest to dopuszczalne, ponieważ płytka jest szczelnie zamknięta i znajduje się w plastikowym worku. Czas generacji mycobacterium tuberculosis wynosi około 12 do 24 godzin, zatem minie co najmniej tydzień, zanim wzrost będzie widoczny w postaci komórka pelletu na dnie dołka kontrolnego. W 10. dniu wykonaj manualny odczyt MIR, umieszczając zamkniętą płytkę mikrotitracyjną AST na platformie urządzenia MIR box.Użyj lampki biurkowej, aby ułatwić wizualizację wzrostu, i dostosuj jej ustawienie w celu uzyskania najlepszego kontrastu. Sprawdź studzienki kontrolne wzrostu, w tym przypadku H 11 i H 12, patrząc w lustro. Jeśli występuje wzrost, studzienka będzie wyglądać na mętną lub będzie w niej widoczny osad, tak jak pokazano tutaj.Jeśli nie występuje wzrost, jak pokazano w tym przykładzie, studzienka będzie wydawać się przejrzysta. W takim przypadku należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze i kontynuować inkubację do 21 dni. Dla każdego wariantu należy porównać wzrost z kontrolą.W takim razie, dla każdego zapisu leku, pierwszym rozcieńczeniem, w którym nie stwierdzono wzrostu, jest minimalne stężenie hamujące lub MIC dla danego leku. Aby zbadać wyniki przy użyciu zautomatyzowanego czytnika płytek, takiego jak Vision, należy rozpocząć od uruchomienia oprogramowania MycoTB AST plate i zalogowania się, a następnie umieścić zamkniętą płytkę kodem kreskowym skierowanym na zewnątrz. Jak pokazano tutaj, wzrost objawia się mętnością lub osadem komórek na dnie dołka na ekranie komputera.W pierwszej kolejności należy sprawdzić kontrole wzrostu, analogicznie jak poprzednio. Jeśli w kontroli nie stwierdzono wzrostu, należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na okres do 21 dni.Jeśli wynik jest dodatni, zarejestruj go, dotykając na ekranie pierwszej studni dla każdego leku, w której nie stwierdzono wzrostu. W niektórych przypadkach bakterie, osad lub leki wytrącają się na dnie studni. Zjawisko to, znane jako trailing, objawia się obecnością kilku studni z osadem o tej samej wielkości i nie jest uznawane za faktyczny wzrost dodatni.Następnie siedem płytek z agar H 10 oraz agar z krwią poddaje się analizie w celu określenia stężeń bakterii i oceny czystości. Na płytce z agarem z krwią po 48 godzinach nie powinien być widoczny wzrost. Wzrost na płytce z agarem z krwią wskazuje na zanieczyszczenie szybko rosnącymi bakteriami.W przypadku stwierdzenia wzrostu należy powtórzyć test w mikropłytce. Na płytce do badania czystości H 10 powinien wystąpić wzrost jednego organizmu. Szczepy EM tuberculosis powinny mieć kolor beżowy, być pomarszczone i szorstkie. W przypadku zanieczyszczenia test w mikropłytce należy powtórzyć, używając czystej kultury.Aby ocenić stężenie bakterii, należy policzyć kolonie na płytce H 10. Następnie, korzystając z tabeli w dołączonym dokumencie pisemnym, obliczyć liczbę kolonii. Mycobacterium tuberculosis wyhodowano z próbki pobranej od pacjenta, a oporność na antybiotyki oceniono zgodnie z opisem w tym filmie; na pokazanej tutaj płytce znajduje się 12 różnych leków w rosnących stężeniach, przy czym najwyższe stężenia znajdują się u góry, a najniższe na dole.Minimalne stężenie hamujące (MIC) leku określono jako najniższe stężenie leku, przy którym nie stwierdzono wzrostu; zostało ono zakreżone na przedstawionym obrazie zgodnie ze znormalizowanymi wartościami granicznymi ustalonymi przez Clinical and Laboratory Standards Institute. Przedstawione dane sugerują, że ten szczep TB będzie oporny na Isid i Rifampinę. In vitro wysokie wartości MIC zaobserwowane dla kilku innych leków, w tym oin, moksiflocyny, streptomycyny i rifabutyny, wskazują na oporność szczepu gruźlicy EM na te środki.Wyniki MIC powinny zostać wykorzystane przez specjalistę chorób zakaźnych z doświadczeniem w leczeniu gruźlicy w celu opracowania indywidualnego planu terapii. Po opanowaniu techniki przygotowanie jednego izolatu zajmuje około 40 minut. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że jest to patogen układu oddechowego i nie wolno generować aerozoli. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania testu wrażliwości Mycobacterium tuberculosis na środki przeciwdrobnoustrojowe z wykorzystaniem metody mikrorozcieńczeń w bulionie. Należy pamiętać, że praca z Mycobacterium tuberculosis może być niezwykle niebezpieczna, dlatego zawsze należy przestrzegać wymaganych środków ostrożności, takich jak ochrona dróg oddechowych.

antimicrobial-susceptibility-testing-mycobacterium-tuberculosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe dla zespołu Mycobacterium Tuberculosis na leki pierwszego i drugiego rzutu przez rozcieńczanie w pożywce w formacie płytki mikrotyteracyjnej

Test wrażliwości na leki metodą obserwacji mikroskopowej (MODS) jest tanim i niedostępnym technologicznie narzędziem do wysokowydajnego wykrywania gruźlicy (TB) oraz gruźlicy wielkoopornej (MDRTB). Niniejszy film opisuje metodę hodowli MODS w pożywkach płynnych.

Metoda MODS w diagnostyce gruźlicy oraz gruźlicy wielolekoopornej

Mycobacterium tuberculosis tworzy lekooporne biofilmy podczas hodowli w określonych warunkach. W niniejszej pracy opisujemy metody hodowli biofilmów M. tuberculosis oraz określania częstotliwości występowania lekoopornych form przetrwalnikowych (persisterów). Protokoły te będą przydatne w dalszych badaniach nad mechanizmami tolerancji leków u M. tuberculosis.

Wzrost biofilmu Mycobacterium tuberculosis

Źródło: Koeth, L. M., et al., A Reference Bulion Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobical. J. Vis. Exp. (2015).Ten film przedstawia metodę mikrorozcieńczenia bulionu w celu określenia minimalnego stężenia hamującego (MIC) antybiotyku lipoglikopeptydowego przeciwko bakteriom Gram-dodatnim. Obejmuje izolację kolonii bakteryjnych, rozcieńczanie, inokulację studzienek mikropłytek o różnych stężeniach antybiotyków oraz weryfikację czystości...

Metoda mikrorozcieńczania bulionu do badania wrażliwości bakterii Gram-dodatnich na antybiotyki

Ten film pokazuje test do oceny skuteczności leków przeciwko zakażeniu Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  Generowany jest model infekcji in vitro zawierający agregaty Mtb/makrofagów, który naśladuje infekcję in vivo. Po wprowadzeniu odpowiednich antybiotyków ich skuteczność jest testowana za pomocą testu resuzaryny w celu monitorowania przeżywalności bakterii przy rosnących stężeniach leku.

Test do oceny skuteczności leku przeciwko modelowi zakażenia Mycobacterium tuberculosis

Ten film demonstruje test w bulionie w celu określenia skuteczności antybiotyku przeciwko Mycobacterium tuberculosis. Kultura bakteryjna jest inkubowana z różnymi stężeniami antybiotyku bakteriobójczego. Skuteczność bakteriobójczą mierzy się, oceniając obecność żywych bakterii za pomocą testu resazurynowego.

Ocena skuteczności badanego związku przeciwko prątkom w bulionie

Próba CARA) to półilościowa, średnio przepustowa metoda oceny aktywności badanych agentów przeciwko prątkom, które się replikują, nie replikują, lub jedno i drugie.  CARA pozwala na szybką ocenę aktywności zależnej od czasu i stężenia oraz identyfikuje parametry, które należy realizować za pomocą testów jednostek tworzących kolonie (CFU).

Wizualizacja testu resazuryny agarowej z węglem drzewnym do półilościowego, średnioprzepustowego oznaczania liczby prątków

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Nowe modele i testy, które poprawiłyby wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych nowej generacji, są wysoce pożądane. Tutaj opisujemy szybki, niedrogi i zgodny z BSL-2 test do oceny skuteczności leku przeciwko Mycobacterium tuberculosis, który można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

Szybkie i skuteczne oznaczanie wzrostu wewnątrzkomórkowego M. tuberculosis jest kluczowe dla poszukiwania lepszych terapii przeciwko gruźlicy (TB). Protokół ten opisuje test detekcji kolorymetrycznej na bazie bulionu przy użyciu zautomatyzowanego systemu hodowli płynów do ilościowego określenia wzrostu Mtb w makrofagach traktowanych potencjalnymi terapiami kierowanymi przez gospodarza.

Zautomatyzowany system hodowli do stosowania w badaniach przedklinicznych terapii gruźlicy ukierunkowanych na gospodarza

Przedstawiamy tutaj protokół do identyfikacji potencjalnych kandydatów do leków przeciwgruźliczych poprzez badanie fenotypową, obejmujące syntezę chemiczną związku 4-aminochinolinowego, określenie jego minimalnego stężenia hamującego wobec Mycobacterium tuberculosis i ocenę jego cytotoksyczności w liniach komórek ssaczych.

Identyfikacja potencjalnych kandydatów przeciwgruźliczych: Krok po kroku przewodnik po syntezie, oznaczaniu MIC i ocenie cytotoksyczności w komórkach ssaczy

Poznaj metodę mikromiareczkowania do równoczesnego testowania wrażliwości Mycobacterium tuberculosis na 12 leków przeciwgruźliczych. Technika ta umożliwia szybkie oznaczenie wartości MIC i wybór odpowiedniego leczenia.

Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe kompleksu Mycobacterium tuberculosis dla leków pierwszego i drugiego rzutu przez rozcieńczenie bulionu w formie płytki do mikromiareczkowania (Wideo) | JoVE Journal

Badanie wrażliwości kompleksu Mycobacterium tuberculosis na leki pierwszego i drugiego rzutu metodą rozcieńczeń w bulionie z wykorzystaniem płytek mikrotitracyjnych

Przeglądaj więcej filmów