Name: Analiza morfologiczna dendrytów i aksonów obwodowych neuronów czuciowych larw Drosophila z wykorzystaniem mozaiki genetycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj metodę analizy morfologicznej dendrytów i aksonów neuronów czuciowych larw Drosophila z wykorzystaniem mozaiki genetycznej. Protokół ten umożliwia szczegółowe badanie neurogenetyki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują instytutowi RIKEN za sfinansowanie badań. Dziękujemy również Cagri Yalginowi, Caroline Delandre i Jayowi Parrishowi za dyskusje dotyczące protokołów genetycznych i immunohistochemicznych.

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
 <li>Przygotuj sól fizjologiczną HL3.1 wolną od Ca++28.
 <ol>
 <li>W mM: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl2 , 10 NaHCO3 , 5 HEPES, 115 sacharozy i 5 trehalozy; pH 7.2. Przefiltruj w celu sterylizacji i przechowuj w temperaturze 4°C. 
 Uwaga: Roztwór wolny od Ca++ zapobiega skurczom mięśni podczas sekcji.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przygotuj szkiełka nakrywowe z poli-L-lizyną (PLL).
 <ol>
 <li>Rozpuść 100mg PLL w 4,2ml wody, przygotuj alikwoty po 300μl w probówkach Eppendorf i zamroź w temperaturze -20°C.</li>
 <li>Przed powlekaniem szkiełek nakrywowych rozmroź alikwot, uzupełnij objętość do 10ml w ddH2O i dodaj 20μl Kodak Photo-Flo; końcowe stężenie PLL wynosi 0,7 mg/ml.</li>
 <li>Zanurz szkiełka nakrywowe na 30min w roztworze PLL, wyjmij i wysusz, a następnie krótko opłucz wodą i wysusz. Powtórz dwukrotnie. Przetraktowane szkiełka nakrywowe można przechowywać przez około miesiąc.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. Krzyże genetyczne
<ol>
 <li>Aby wygenerować klony MARCM. Poniżej znajduje się przykład krzyżówki z wykorzystaniem drivera pan-DA11,27: 
 FRT2A x hsFLP; Gal4109(2)80, UAS-mCD8::GFP; tub-Gal80 FRT2A/SM5-TM6B</li>
 <li>Aby wygenerować klony Flp-out. Poniżej znajduje się przykład krzyżówki z wykorzystaniem drivera specyficznego dla klasy IV8: 
 ppk-Gal4 x yw, hsFLP;UAS-FRT-CD2,y+-stop-FRT-mCD8::GFP</li>
</ol>
3. Pobieranie zarodków
<ol>
 <li>Przechowywać krzyżówki Drosophila w butelce kolekcjonerskiej w temperaturze 25°C i zbierać zarodki na płytce z agarem z sokiem jabłkowym29 z naniesioną cienką warstwą pasty drożdżowej30,31.</li>
</ol>
4. Obróbka szokiem termicznym zarodków
<ol>
 <li>Umieść pustą płytkę naprzeciwko płytki z agarem z sokiem jabłkowym, na której ułożone są embriony. Uszczelnij obie płytki Parafilmem (Ryc. 2).</li>
 <li>Podczas szoku termicznego zanurz płytkę w kąpieli wodnej i przytrzymaj ją za pomocą metalowego obciążnika.</li>
 <li>W przypadku embrionów MARCM
 <ol>
 <li>Zbieraj embriony przez 2h, a następnie inkubuj je w 10cm czalce Petri otoczonej nawilżonymi chusteczkami w temperaturze 25°C przez kolejne 2h. 
 Uwaga: Modyfikacja protokołu szoku termicznego zmienia częstotliwość powstawania klonów.</li>
 <li>Aby uzyskać mniejszą liczbę klonów, dążąc do uzyskania pojedynczych, izolowanych neuronów, zanurz próbki i poddaj szokowi termicznemu w kąpieli wodnej przez 1h w temperaturze 38°C.</li>
 <li>Aby uzyskać większą liczbę klonów, przeprowadź szok termiczny przez 45mins w temperaturze 38°C, pozwól na regenerację w RT przez 30mins, a następnie ponownie poddaj szokowi termicznemu przez dodatkowe 30mins.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Zbieraj embriony Flp-out przez 24h, a następnie poddaj szokowi termicznemu przez 1h w temperaturze 38°C.</li>
</ol>
5. Przesiewanie klonów
<ol>
 <li>Po szoku termicznym zdejmij pokrywkę z wodoodpornej aparatury i umieść szalkę z agarem z sokiem jabłkowym w 10cm płytce Petriego otoczonej zwilżonymi chusteczkami. Hoduj embriony, a następnie larwy w temperaturze 25°C aż do stadium wędrownego 3rd wzrostu. 
 Uwaga: wykazano, że warunki hodowli, a w szczególności odżywianie, wpływają na morfologię arboryzacji dendrytycznej DA32,33. Upewnij się, że rosnące larwy mają stały dostęp do pasty drożdżowej; monitoruj i uzupełniaj pastę drożdżową w razie potrzeby.</li>
 <li>Od tego momentu protokołu manipuluj larwami ostrożnie, używając pęsety entomologicznej.</li>
 <li>Krótko i delikatnie opłucz larwy wodą z kranu, a następnie przenieś je na płytkę z agarem. 
 Uwaga: ten krok redukuje tło autofluorescencji pochodzącej z pokarmu lub zanieczyszczeń na powierzchni larwy.</li>
 <li>Zbadaj larwy pod silnym fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Zidentyfikuj larwy z neuronami/komórkami GFP-dodatnimi w ścianie ciała.</li>
</ol>
6. Obrazowanie dendrytów in vivo
<ol>
 <li>Umieść larwę na szkiełku wgłebnym z niewielką kroplą 80% glicerolu. Przykryj preparat szkiełkiem nakrywkowym, aby unieruchomić larwę. Upewnij się, że między larwą a szkiełkiem nakrywkowym nie pozostały pęcherzyki powietrza.</li>
 <li>Delikatnie przesuń szkiełko nakrywkowe, aby przetoczyć larwę, umożliwiając wizualizację interesującego neuronu. Obrazuj arboryzację dendrytyczną znakowaną mCD8::GFP za pomocą mikroskopii konfokalnej.</li>
</ol>
7. Disekcja larw
Uwaga przed rozpoczęciem: Dendryty neuronów DA ulegają szybkiej degradacji po rozpoczęciu sekcji. Każdą larwę należy wypreparować w czasie krótszym niż 5min, aby zapewnić dobrą morfologię dendrytów.
<ol>
 <li>Przeprowadzić sekcję larw w stadium 3rd instar w fazie wędrowania na płytce Sylgard, zgodnie z opisem z poprzednich prac34, wprowadzając następujące modyfikacje:
 <ol>
 <li>W przypadku obrazowania zakończeń aksonów neuronów DA należy upewnić się, że OUN jest nienaruszony, a nerwy segmentowe nie są przerwane. Po otwarciu larwy należy najpierw ostrożnie przeciąć połączenia tchawikowe ze ścianą ciała, a następnie delikatnie usunąć cały przewód pokarmowy.</li>
 <li>Jeśli obrazowane są wyłącznie dendryty, należy usunąć OUN, aby umożliwić bardziej płaskie zamocowanie preparatu.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
8. Fixacja i blokowanie plastrów larwalnych
<ol>
 <li>Pozostawiając larwę przypiętą do płytki Sylgard, utrwal ją w 4% PFA w PBS przez 20 min w temperaturze pokojowej na delikatnie obracającym się wytrząsarku.</li>
 <li>Po utrwaleniu usuń resztki tkanek larwalnych (ciało tłuszczowe, tchawki itp.).</li>
 <li>Przemyj w PBST (PBS z 0,1% Triton X-100) 3x po 10 min na płytce Sylgard i wytrząsarce. W przypadku badania zakończeń aksonów, zachowaj preparat na płytce Sylgard. (Przy barwieniu dendrytów na tym etapie można przenieść preparaty larwalne do probówki o pojemności 0,5 ml34)</li>
 <li>Zablokuj larwy przez 20 min w temperaturze pokojowej w 5% normalnym surowicy osła (NDS) w PBST na wytrząsarce.</li>
</ol>
9. Barwienie preparatów z larw
<ol>
 <li>Usunąć roztwór blokujący i inkubować w przeciwciałach pierwszorzędowych (w 5% NDS/PBST) przez noc w temperaturze 4°C w małym pojemniku Tupperware otoczonym zwilżonymi chusteczkami.</li>
 <li>Wyjąć probówki z temperatury 4°C i inkubować przez dodatkową godzinę w temperaturze pokojowej (RT).</li>
 <li>Przemyć 6 razy po 10 min w PBST. Dodać przeciwciała drugorzędowe (w 5% NDS/PBST) i przykryć, aby zapobiec fotowybielaniu fluoroforu34.</li>
 <li>Inkubować albo przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, albo przez noc w 4°C, a następnie przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przemyć larwy 6 razy po 10 min w PBST i przystąpić do montowania preparatów.</li>
</ol>
10. Montaż preparatów z larw w celu badania drzewa dendrytycznego
<ol>
 <li>Każdy preparat larwy należy zamocować tak płasko, jak to możliwe, używając nożyczek sekcyjnych lub skalpela do odcięcia głowy (wraz z haczykami gębowymi) oraz części tylnej (wraz z przetchanicami)34.</li>
 <li>Preparat larwy należy położyć na szkiełku przedmiotowym stroną kutykularną do dołu, zamocować w 80% glicerolu i uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci w celu wykonania szybkiego preparatu34.</li>
 <li>W celu wykonania preparatu trwałego i uzyskania wyraźniejszego obrazu:
 <ol>
 <li>Przekrojoną larwę należy położyć stroną mięśniową do dołu na kroplę PBS na szkiełku nakrywkowym pokrytym PLL; preparat szybko przylgnie do szkiełka.</li>
 <li>Po zamocowaniu należy usunąć jak najwięcej cieczy, jednak nie wolno dopuścić do całkowitego wyschnięcia.</li>
 <li>Szkiełko nakrywkowe (z przytwierdzoną larwą) należy poddać odwodnieniu w serii etanoli: 35% etanol, następnie 50%, 70%, 95% i na koniec 2x 100% etanol, po 10 minut w każdym roztworze (drugi roztwór 100% EtOH należy często wymieniać); na koniec przemyć 2-3x przez 10 min w ksylenie.</li>
 <li>Na czyste szkiełko przedmiotowe należy nanieść kroplę medium montażowego DPX (Distyrene Plasticizer Xylene) i ostrożnie położyć na niej szkiełko nakrywkowe stroną z preparatem do dołu. Przechowywać w ciemności i odczekać jeden dzień do zastygnięcia DPX przed wykonaniem obrazowania.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
11. Montaż preparatów z filletami larwalnymi do badania zakończeń aksonów
<ol>
 <li>Podczas sekcji, utrwalania i barwienia należy zachować ciągłość nerwów segmentarnych przebiegających między PNS a CNS, aby umożliwić śledzenie aksonów od ciał komórek obwodowych neuronów sensorycznych do VNC.</li>
 <li>Każdy preparat larwalny należy zamontować stroną kutykuli do dołu w 80% glicerolu na szkiełku z wgłębieniem. Pod mikroskopem konfokalnym należy prześledzić przebieg aksonów od ciała komórki DA do VNC. Uwaga: neurony PNS w każdym segmencie ściany ciała rzutują do odpowiadającego im segmentu VNC.</li>
</ol>
12. Reprezentatywne wyniki:
Reprezentatywne wyniki przedstawiono na rysunkach 3-5. Rys. 3 ukazuje cały arbor neuronu klasy IV, zarejestrowany in vivo za pomocą mikroskopu konfokalnego. Rys. 4 przedstawia powiększenie części arboru dendrytycznego immunohistochemicznie znakowanego neuronu klasy III, który został prawidłowo utrwalony w celu zachowania morfologii. Powiązany wstawka pokazuje degradację, która może wystąpić po nieudanej sekcji i utrwaleniu (oba barwione przeciwciałem anty-GFP). Rys. 5 przedstawia pojedyncze zakończenie aksonu klasy IV w OUN (anty-GFP, kolor zielony); wszystkie zakończenia klasy IV są współbarwione z anty-CD2 (kolor magenta).
<img alt="Procedura od hodowli komórkowej do mikroskopii fluorescencyjnej, przedstawiająca schemat powiększenia i sekwencji obrazowania." src="/files/ftp_upload/3111/3111fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1 Przegląd protokołu. a) Zebranie, a następnie poddanie embrionów szokowi termicznemu. b) Wybór larwy z klonem neuronów DA wykazującym pozytywną ekspresję GFP, a następnie obrazowanie GFP-znakowanego drzewka dendrytycznego w żywej larwie. c) Disekcja larwy, a następnie barwienie immunohistochemiczne preparatu. d) Montaż zabarwionego preparatu, a następnie obrazowanie drzewka dendrytycznego i projekcji aksonalnych klonów neuronów DA.
<img alt="Kultura bakteryjna na szalce Petriego, test antybiotykowy, porównanie wyników eksperymentalnych, strefa zahamowania wzrostu." src="/files/ftp_upload/3111/3111fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2 Przygotowanie szalki z agarem z soku jabłkowego do szoku termicznego. Należy wziąć szalkę (biała strzałka, a-b), położyć na niej drugą szalkę Petriego (czerwona strzałka, b) i uszczelnić krawędzie Parafilmem (niebieska strzałka, b).
<img alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej struktury sieci neuronów siatkówki; wizualizacja morfologii rozgałęzień." src="/files/ftp_upload/3111/3111fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3 obraz in vivo drzewa dendrytycznego klonu MARCM znakowanego mCD8::GFP (genotyp jak w sekcji 2.1) reprezentującego neuron klasy IV (v'ada) larwy w 3rd stadium rozwojowym. Pasek skali wynosi 50μm.
<img alt="Schemat dendrytu neuronalnego z etykietowaniem fluorescencyjnym; obraz mikroskopowy dla badań z zakresu neurobiologii." src="/files/ftp_upload/3111/3111fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4 Klon MARCM neuronu klasy III (ddaA) znakowany mCD8::GFP, barwiony przeciwciałem anty-GFP, wykazujący prawidłową morfologię po pomyślnej dyssekcji i fiksacji (zielony). Wstawka przedstawia degradację dendrytów (białe strzałki), która występuje po nieudanej dyssekcji i fiksacji (magenta). Pasek skali wynosi 25μm.
<img alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej struktury neuronalnej; drogi nerwowe zaznaczone kolorem purpurowym i zielonym." src="/files/ftp_upload/3111/3111fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5 VNC larwy w 3tym stadium rozwojowym. Klon Flp-out pojedynczego zakończenia aksonu klasy VI (vdaB) (genotyp jak w 2.2) wykazany przy użyciu przeciwciała anty-GFP (zielony). Przeciwciało anty-CD2 znakuje wszystkie zakończenia klasy IV (purpurowy). Pasek skali: 25μm.

<ol><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila%3A+the+role+of+Collier%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315, 232-242 (2008).</li>
<li>Hattori, Y., Sugimura, K., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+Knot%2FCollier%2C+a+transcriptional+regulator+of+the+EBF%2FOlf-1+family%2C+endows+the+Drosophila+sensory+system+with+neuronal+class-specific+elaborated+dendritic+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Selective expression of Knot/Collier, a transcriptional regulator of the EBF/Olf-1 family, endows the Drosophila sensory system with neuronal class-specific elaborated dendritic patterns.</a> Genes Cells. 12, 1011-1022 (2007).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li>
<li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43, 809-822 (2004).</li>
<li>Li, W., Wang, F., Menut, L., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BTB%2FPOZ-zinc+finger+protein+abrupt+suppresses+dendritic+branching+in+a+neuronal+subtype-specific+and+dosage-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">BTB/POZ-zinc finger protein abrupt suppresses dendritic branching in a neuronal subtype-specific and dosage-dependent.</a> 43, 823-834 (2004).</li>
<li>Zlatic, M., Landgraf, M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+specification+of+axonal+arbors%3A+atonal+regulates+robo3+to+position+terminal+branches+in+the+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic specification of axonal arbors: atonal regulates robo3 to position terminal branches in the Drosophila nervous system.</a> Neuron. 37, 41-51 (2003).</li>
<li>Grueber, W. B., Ye, B., Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrites+of+distinct+classes+of+Drosophila+sensory+neurons+show+different+capacities+for+homotypic+repulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendrites of distinct classes of Drosophila sensory neurons show different capacities for homotypic repulsion.</a> Curr Biol. 13, 618-626 (2003).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112, 805-818 (2003).</li>
<li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamlet%2C+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+mechanisms+to+define+neuron+class-specific+dendrite+arbor+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology.</a> Cell Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).</li>
<li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Mol. Cell. Neurosci. 35, 383-396 (2007).</li>
<li>Nishimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+Behaviors+and+Segmental+Coordination+During+Larval+Locomotion+Is+Disrupted+by+Nuclear+Polyglutamine+Inclusions+in+a+New+Drosophila+Huntington%27s+Disease-Like+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model.</a> J Neurogenet. 24, 194-206 (2010).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li>
<li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+TRP+channel+NompC+in+Drosophila+larval+and+adult+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li>
<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19, 799-806 (2009).</li>
<li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Larval+CNS+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (1), e85-e85 (2006).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Merritt, D. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+projections+of+sensory+neurons+in+the+Drosophila+embryo+correlate+with+sensory+modality%2C+soma+position%2C+and+proneural+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Central projections of sensory neurons in the Drosophila embryo correlate with sensory modality, soma position, and proneural gene function.</a> J Neurosci. 15, 1755-1767 (1995).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+techniques+for+studying+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development.</a> Development. 130, 5065-5072 (2003).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Wong, A. M., Wang, J. W., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+representation+of+the+glomerular+map+in+the+Drosophila+protocerebrum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial representation of the glomerular map in the Drosophila protocerebrum.</a> Cell. 109, 229-241 (2002).</li>
<li>Shimono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidendritic+sensory+neurons+in+the+adult+Drosophila+abdomen%3A+origins%2C+dendritic+morphology%2C+and+segment-+and+age-dependent+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death.</a> Neural Dev. 4, 37-37 (2009).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Kaczynski, T. J., Gunawardena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+Embryonic+Nervous+System+in+Whole-mount+Drosophila+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (46), e2150-e2150 (2010).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Medina, P. M., Swick, L. L., Andersen, R., Blalock, Z., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+forward+genetic+screen+for+identifying+mutations+affecting+larval+neuronal+dendrite+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel forward genetic screen for identifying mutations affecting larval neuronal dendrite development in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 172, 2325-2335 (2006).</li>
<li>Mirouse, V., Swick, L. L., Kazgan, N., St Johnston, D., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LKB1+and+AMPK+maintain+epithelial+cell+polarity+under+energetic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LKB1 and AMPK maintain epithelial cell polarity under energetic stress.</a> J Cell Biol. 177, 387-392 (2007).</li>
<li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Larval+NMJ+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. 25, e1108-e1108 (2009).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
<li>Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+Drosophila+neuropile%3A+a+strategy+for+the+standardised+characterisation+of+genetically+amenable+neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites.</a> Dev Biol. 260, 207-225 (2003).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Model neuronów DA larw Drosophila stanowi doskonały system genetyczny do badania mechanizmów kontrolujących morfologię neuronów i tworzenie obwodów. Metoda MARCM jest powszechnie stosowana do znakowania oraz generowania mutantowych klonów neuronów DA. W przypadku MARCM stosujemy sterownik pan-neuronalny (np. Gal4c155) lub specyficzny dla neuronów DA. Dzięki zastosowaniu sterownika pan-neuronalnego możliwe jest bezpośrednie wykorzystanie wielu linii szeroko dostępnych w publicznych cen...

<table><tbody><tr><td>mikroskop do mikrodissekcji fluorescencyjnej SZX16 (z filtrem GFPHQ)</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>pinceta do żywych owadów</td><td>Fine Science Tools</td><td>26030-10</td><td></td></tr><tr><td>szkiełko wklęsłe 26mm x 76mm</td><td>Toshinriko Co.</td><td>T8-R004</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 (lub Silpot 184)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1524</td><td>Produkt ten okazał się najskuteczniejszy</td></tr><tr><td>medium montażowe DPX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciała królika anty-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A-11122</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>przeciwciała szczura anty-CD8</td><td>Caltag</td><td>5H10</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>przeciwciała mysie anty-CD2</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA443R</td><td>Rozcieńczenie 1:700</td></tr><tr><td>przeciwciała mysie anty-Fasciclin2</td><td>DSHB</td><td>1D4</td><td>Rozcieńczenie 1:10</td></tr></tbody></table>

analiza morfologiczna dendrytów i aksonów obwodowych neuronów sensorycznych larw drosophila z wykorzystaniem mozaik genetycznych

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Rozwój układu nerwowego wymaga prawidłowej specyfikacji pozycji i tożsamości neuronów, po której następuje precyzyjny rozwój dendrytów specyficzny dla danej klasy neuronów oraz tworzenie połączeń aksonalnych. W ostatnim czasie neurony z arboryzacją dendrytyczną (DA) w obwodowym układzie nerwowym (PNS) larwy Drosophila stały się potężnymi modelami genetycznymi, pozwalającymi wyjaśnić zarówno ogólne, jak i specyficzne dla danej klasy mechanizmy różnicowania neuronów.
Istnieją cztery główne klasy neuronów DA (I-IV)1. Zostały one nazwane zgodnie z rosnącą złożonością arboryzacji dendrytów i wykazują specyficzne dla klasy różnice w genetycznej kontroli ich różnicowania2-10. System sensoryczny DA jest praktycznym modelem do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw kontroli morfologii dendrytycznej11-13, ponieważ: 1) pozwala on na wykorzystanie potężnych narzędzi genetycznych dostępnych u muszki owocówki, 2) arboryzacja dendrytów neuronów DA rozprzestrzenia się tylko w dwóch wymiarach pod optycznie przejrzystą kutykulą larwy, co ułatwia ich wizualizację z wysoką rozdzielczością in vivo, 3) specyficzna dla klas różnorodność morfologii dendrytycznej umożliwia analizę porównawczą w celu znalezienia kluczowych elementów kontrolujących tworzenie prostych w stosunku do silnie rozgałęzionych drzew dendrytycznych oraz 4) stereotypowe kształty arboryzacji dendrytycznej różnych neuronów DA ułatwiają statystyczne analizy morfometryczne.
Aktywność neuronów DA modyfikuje sygnał wyjściowy generatora wzorców centralnych odpowiedzialnego za lokomocję larwalną14-16. Różne klasy neuronów DA posiadają odmienne modalności sensoryczne, a ich aktywacja wywołuje różne odpowiedzi behawioralne14,16-20. Ponadto różne klasy przesyłają stereotypowe projekcje aksonalne do larwalnego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila w obrębie brzusznego sznura nerwowego (VNC)21. Projekcje te kończą się reprezentacjami topograficznymi zarówno modalności sensorycznej neuronów DA, jak i położenia pola dendrytycznego w ścianie ciała7,22,23. Zatem badanie projekcji aksonalnych DA może służyć do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw mapowania topograficznego7,22,23, a także okablowania prostego obwodu modulującego lokomocję larwalną14-17.
Przedstawiamy praktyczny przewodnik po generowaniu i analizowaniu mozaik genetycznych24 znakujących neurony dopaminergiczne (DA) za pomocą technik MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 oraz Flp-out22,26,27 (podsumowanie na Rys. 1).

Neurony sensoryczne o arboryzacji dendrytycznej w obwodowym układzie nerwowym larw Drosophila stanowią użyteczne modele do wyjaśniania zarówno ogólnych, jak i specyficznych dla danej klasy neuronów mechanizmów różnicowania neuronów. Przedstawiamy praktyczny przewodnik po generowaniu i analizie mozaik genetycznych neuronów o arboryzacji dendrytycznej.

Analiza morfologiczna dendrytów i aksonów obwodowych neuronów sensorycznych larw Drosophila z wykorzystaniem mozaik genetycznych

Rozwój układu nerwowego wymaga prawidłowej specyfikacji pozycji i tożsamości neuronów, a następnie precyzyjnego, specyficznego dla klasy neuronów rozwoju dendrytycznego...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja szczegółowej morfologii neuronów dendrytycznych w larwach Drosophila. Osiąga się to poprzez zebranie zarodków, ich inkubację do odpowiedniego wieku oraz wygenerowanie genetycznych klonów znakowanych białkiem GFP poprzez indukcję ekspresji lipazy za pomocą szoku termicznego. Drugim krokiem jest wyselekcjonowanie larw z fluorescencyjnymi klonami neuronów i wykonanie obrazu ich dendrytycznych struktur arboryzacyjnych (ABA).Po obrazowaniu larw są one preparowane, utrwalane i poddawane immunobarwieniu, aby można było je zamontować i zwizualizować morfologię ich wypustek dendrytycznych oraz zakończeń aksonalnych za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Dzisiaj zaprezentuję protokół analizy morfologicznej dolnych peryferyjnych sensorów i aksonów sula przy użyciu genetycznych markerów. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neurorozwoju, takie jak: jakie programy genetyczne kontrolują tożsamość neuronalną, kształt dendrytów i okablowanie zewnętrzne?Rozpocznij ten protokół od zebrania embrionów na płytkach z sokiem jabłkowym. Szok termiczny jest przeprowadzany w kąpieli wodnej o temperaturze 38

morphological-analysis-drosophila-larval-peripheral-sensory-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analiza morfologiczna dendrytów i aksonów obwodowych neuronów czuciowych larw Drosophila z wykorzystaniem mozaiki genetycznej

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

Źródło: Ting, C., et al., Analiza morfologii dendrytycznej w kolumnach i warstwach. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje procedurę przygotowania mózgu Drosophila, przechwytywania poziomych i czołowych stosów obrazów dendrytów rdzenia znakowanych GFP pod mikroskopem konfokalnym oraz tworzenia rekonstrukcji 3D w celu analizy ich morfologii w warstwach i kolumnach.

Analiza morfologii dendrytycznej w warstwach i kolumnach rdzenia Drosophila

Prezentujemy technikę oznaczania pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) zarodków Drosophila, która pozwala na analizę morfologii neuronów za pomocą światła przechodzącego lub mikroskopii konfokalnej.

Znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster

Badania morfogenezy neuronów za pomocą neuronów dendrytycznych larw Drosophila korzystają z wizualizacji in situ białek neuronalnych i naskórkowych za pomocą immunofluorescencji. Opisujemy procedurę, która poprawia analizę immunofluorescencyjną neuronów da i otaczających komórek naskórka poprzez usunięcie tkanki mięśniowej ze ściany ciała larwy.

Usuwanie tkanki mięśniowej Drosophila z filetów larwalnych w celu analizy immunofluorescencyjnej neuronów czuciowych i komórek naskórka

Dwa algorytmy analizy obrazu, "Drosophila NMJ Morphometrics" i "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" zostały stworzone, aby automatycznie określić ilościowo dziewięć cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila (NMJ).

Dwa algorytmy wysokoprzepustowej i wieloparametrycznej kwantyfikacji morfologii połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Ten protokół skupia się na ilościowej analizie złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej (NDAC) u Drosophila, która może być wykorzystana do badań morfogenezy dendrytycznej.

Analiza ilościowa złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej u Drosophila

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji celowania aksonalnego za pomocą białka fluorescencyjnego w odnóżach dorosłych Drosophila poprzez etapy fiksacji, montażu, obrazowania i po obrazowaniu.

Wizualizuj aksony neuronu ruchowego nóg Drosophila przez naskórek dorosłego człowieka

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Tutaj udostępniamy protokoły do przeprowadzenia trzech prostych testów degeneracji aksonów (śmierci aksonów) wywołanych urazem u Drosophila melanogaster, aby ocenić morfologiczne i funkcjonalne zachowanie odciętych aksonów i ich synaps.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna aksonów i ich synaps podczas śmierci aksonów u Drosophila melanogaster

Poznaj metodę analizy morfologicznej dendrytów i aksonów neuronów czuciowych larw Drosophila z wykorzystaniem mozaiki genetycznej. Protokół ten umożliwia szczegółowe badanie neurogenetyki.

Analiza morfologiczna dendrytów i aksonów obwodowych neuronów sensorycznych larw Drosophila z wykorzystaniem mozaik genetycznych

Przeglądaj więcej filmów