Analiza morfologiczna dendrytów i aksonów obwodowych neuronów sensorycznych larw Drosophila z wykorzystaniem mozaik genetycznych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja szczegółowej morfologii neuronów dendrytycznych w larwach Drosophila. Osiąga się to poprzez zebranie zarodków, ich inkubację do odpowiedniego wieku oraz wygenerowanie genetycznych klonów znakowanych białkiem GFP poprzez indukcję ekspresji lipazy za pomocą szoku termicznego. Drugim krokiem jest wyselekcjonowanie larw z fluorescencyjnymi klonami neuronów i wykonanie obrazu ich dendrytycznych struktur arboryzacyjnych (ABA).

Po obrazowaniu larw są one preparowane, utrwalane i poddawane immunobarwieniu, aby można było je zamontować i zwizualizować morfologię ich wypustek dendrytycznych oraz zakończeń aksonalnych za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Dzisiaj zaprezentuję protokół analizy morfologicznej dolnych peryferyjnych sensorów i aksonów sula przy użyciu genetycznych markerów. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neurorozwoju, takie jak: jakie programy genetyczne kontrolują tożsamość neuronalną, kształt dendrytów i okablowanie zewnętrzne?

Rozpocznij ten protokół od zebrania embrionów na płytkach z sokiem jabłkowym. Szok termiczny jest przeprowadzany w kąpieli wodnej o temperaturze 38 °C, a jego czas trwania zależy od genetyki embrionów oraz pożądanej wielkości klonów. W tym protokole należy wygenerować klony markum z embrionów z driverem neuronów o dendrytycznej arboryzacji pand. Przed szokiem termicznym utrzymuj embriony markerowe w temperaturze 25 °C, w otoczeniu wilgotnych tkanek, przez dwie godziny.

Przygotuj płytki do zbierania embrionów do szoku termicznego, czyniąc je zanurzalnymi przy użyciu pustych płytek i parafilmu. Następnie poddaj embriony markerowe szokowi termicznemu przez jedną godzinę, aby uzyskać małe klony lub znakowanie pojedynczych neuronów. Aby zwiększyć liczbę klonów, zastosuj przedłużony szok termiczny, inkubując próbki przez 45 minut w kąpieli wodnej, następnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej i ponownie przez 30 minut w kąpieli.

Aby wygenerować klony flipout, należy zbierać embriony przez 24 godziny w sposób ciągły. Niniejszy protokół wykorzystuje specyficzny driver klasy czwartej. Embriony flipout należy poddać szokowi termicznemu, a następnie inkubować przez godzinę po szoku termicznym.

Umieść płytki zbierające w 10 centymetrowej szalce Petriego, otaczając je wilgotnymi chusteczkami i pożywką. Embriony inkubuj w temperaturze 25 °C w trakcie hodowli embrionalnej, monitorując i uzupełniając pastę drożdżową w razie potrzeby, ponieważ żywienie ma krytyczny wpływ na rozwój neuronów.

Utrzymuj kulturę do momentu, aż pojawiły się wędrujące larwy trzeciego stadium, następnie delikatnie i krótko opłucz larwy trzeciego stadium wodą z kranu i przenieś je na płytkę agarową. Następnie obejrzyj larwy za pomocą silnego fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego i pęsety entomologicznej. Zidentyfikuj larwy z neuronami GFP-dodatnimi w ścianie ciała i przenieś je na szkiełko z wgłębieniem z kroplą 80% glicerolu.

Połóż szkiełko nakrywkę na preparacie, aby unieruchomić larwę. Upewnij się, że między larwą a szkiełkiem nakrywką nie pozostały pęcherzyki powietrza. Wykorzystaj standardową mikroskopię konfokalną do wizualizacji interesujących neuronów przez kutykulę larwy.

Aby zmienić położenie lawy w celu uzyskania lepszego kąta widzenia, delikatnie naciśnij szkiełko nakrywkowe, aby obrócić lawę. Rozpocznij ten protokół od przeniesienia lawy na płytkę ochronną SIL za pomocą pęsety entomologicznej. Następnie przymocuj ją szpilkami w części przedniej i tylnej.

Następnie należy dodać bufor HL 3.1 bez wapnia. Teraz należy przeciąć oba końce larwy w połowie, prostopadle do osi przednio-tylnej. Następnie należy przeciąć wzdłuż linii środkowej między obiema tchawicami.

Przed delikatnym usunięciem przewodu pokarmowego należy ostrożnie przeciąć każde poszczególne połączenie tchawic ze ścianą ciała. Pozwala to zachować nienaruszone nerwy segmentalne przebiegające między PNS a CNS. Pozostawiając larwę przypiętą do płytki ochronnej komórki, należy utrwalić ją w 4%Para formaldehydzie w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej na łagodnie obracającym się wytrząsarce; każdą sekcję należy przeprowadzić w czasie krótszym niż pięć minut.

W przeciwnym razie neurony dendrytyczne zaczną ulegać degradacji. Po utrwaleniu usuń nadmiar tkanek larwalnych. Następnie przemyj preparaty trzykrotnie roztworem PBST, wykonując każde przemywanie przez 10 minut.

Po przemyciu inkubuj larwy przez 20 minut w temperaturze pokojowej w roztworze blokującym, delikatnie wstrząsając. Po zakończeniu blokowania zastąp roztwór blokujący roztworem przeciwciała pierwszorzędowego. Umieść próbkę w małym plastikowym pojemniku otoczonym wilgotnymi chusteczkami i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia kontynuuj inkubację przez dodatkową godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie przemyj filet lawy sześć razy w PBST, poświęcając 10 minut na każde płukanie. Teraz dodaj przeciwciało wtórne i umieść filety w ciemnym pojemniku, aby zapobiec fotoblaknięciu fluoroforu. Inkubuj filety przez kilka godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Na koniec przemyj filaty sześciokrotnie w PBST przez 10 minut podczas każdego płukania. Tkanki są następnie gotowe do montowania. Aby zwizualizować zakończenia aksonów, wystarczy zamontować filat larwy kutykulą do dołu w 80% glicerolu na szkiełku z wgłębieniem.

Aby uzyskać wyraźniejsze obrazy dendrytów, należy przygotować preparat trwały z użyciem szkiełek nakrywek powlekanych PLL. W celu kodowania szkiełek nakrywek przygotuj alikwot PLL. Doprowadź objętość do 10 milliliters wody dwukrotnie destylowanej i dodaj 20 microliters Kodak photo flow.

Zanurz szkiełka podstawowe w roztworze PLL na 30 minut, a po wyjęciu pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie krótko opłucz je wodą i odstaw. Wysusz je ponownie.

Powtórz ten proces dwukrotnie. Począwszy od kąpieli w PLL, potraktowane szkiełka nakrywki będą przydatne przez około miesiąc. Teraz zamocuj wypreparowany filet larwy stroną mięśniową do dołu w kropli PBS na szkiełku nakrywce z PLL.

Przekrój zostanie szybko przytwierdzony do szkiełka nakrywkowe za pomocą kawałka ręcznika papierowego. Należy usunąć jak największą ilość cieczy, jednak nie doprowadzić do całkowitego wyschnięcia preparatu. Następnie należy odwodnić przekroje larw, stosując serię 10-minutowych kąpieli w etanolu, zaczynając od 35% etanolu, a następnie 50%, 70%, 95%, 100% i na koniec drugiej kąpieli w 100% etanolu.

Po kąpielach w etanolu przeprowadź dwie lub trzy 10 minutowe kąpiele w ksylenie. Następnie nanieś kroplę DPX na czysty szkiełko i ostrożnie nałóż na nią szkiełko nakrywkę, dociskając ją stroną skierowaną w dół. Przechowuj preparat w ciemności przez jeden dzień, aż DPX całkowicie zastygnie.

Przed obrazowaniem tkanki za pomocą mikroskopii in vivo i ogniskowej, możliwe jest wykonanie obrazów takich jak ten. Całe rozgałęzienie neuronu o czwartej klasie arboryzacji dendrytycznej. Jest to zbliżenie arboryzacji dendrytycznej neuronu klasy trzeciej, znakowanego metodą IHC, który został prawidłowo utrwalony w celu zachowania morfologii.

Wstawka przedstawia degradację, która może wystąpić po nieudanej sekcji i utrwaleniu. Ta nakładka pokazuje pojedynczy zakończenie aksonu klasy czwartej w OUN. Akson jest znakowany przeciwciałem anty-GFP na zielono, a wszystkie zakończenia aksonów klasy czwartej są współbarwione przeciwciałem anty-CD2 na purpurowo.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby szybko przeprowadzić sekcję i utrwalić próbki, śledząc aksony od obwodu do OUN. Warto pamiętać, że neurony OOB w każdym organizmie rzutują segmentowo do odpowiedniego segmentu nerwu brzusznego. Ponadto, jeśli celem jest wizualizacja wyłącznie dendrytów, należy usunąć OUN podczas sekcji, a barwienie można przeprowadzić w probówkach zamiast na płytkach.

Podczas montowania tych filetów do obrazowania dendrytów, najpierw odetnij głowę za pomocą haków gębowych, a część tylną za pomocą iskierników. W celu przygotowania preparatu.