$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Zacznij od unieruchomionego wycinka mózgu myszy umieszczonego w komorze rejestracyjnej układu elektrofizjologicznego wypełnionej sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym w celu utrzymania żywotności neuronów.
Zestaw zawiera wstępnie zmontowaną mikropipetę rejestrującą wypełnioną roztworem kationowym, podłączoną do wzmacniacza i jednostki sterującej ciśnieniem.
Pod mikroskopem zlokalizuj neuron i umieść mikropipetę w jego pobliżu.
Zastosuj dodatnie ciśnienie powietrza, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
Przesuwaj mikropipetę w kierunku neuronu, aż na błonie utworzy się wgłębienie, wskazujące na bliskość neuronów.
Zastosuj słabe ssanie, aby wciągnąć mały plaster membranowy do wnętrza mikropipety.
W ten sposób powstaje szczelne uszczelnienie, które zwiększa opór mikropipety, potwierdzając stabilne uszczelnienie.
Utrzymuj potencjał komórki na fizjologicznym potencjale spoczynkowym dla stabilności komórki.
Następnie zastosuj krótkie, silne ssanie, aby przerwać błonę łaty, ustanawiając bezpośrednie połączenie z wnętrzem komórki.
Ta konfiguracja całej komórki jest gotowa do rejestrowania aktywności elektrycznej neuronów.
Korzystając z pokrętła precyzyjnego ustawiania ostrości mikroskopu, zacznij ustawiać ostrość w dół, stopniowo opuszczając mikropipetę. Zawsze najpierw ustaw ostrość w dół, a następnie opuść mikropipetę do płaszczyzny ostrości, aby upewnić się, że końcówka mikropipety nie wniknie nagle w plasterek. Gdy mikropipeta zetknie się z powierzchnią plasterka, zmniejsz prędkość mikromanipulatora do trybu średnio-niskiego. Delikatnie zastosuj lekki nadciśnienie, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia ze ścieżki.
Następnie zbliż się do komórki, albo na przemian z pokrętłami sterującymi X, Y, Z, albo zbliżając się po przekątnej, gdzie obie osie XZ są zmieniane wraz z obrotem pokrętła osi Z. Gdy mikropipeta znajdzie się wystarczająco blisko komórki, na powierzchni komórki pojawi się wgłębienie.
Teraz przyłóż słabe i krótkie ssanie przez rurkę podłączoną do rurki ssącej uchwytu pipety, aby uzyskać uszczelnienie. Podczas tworzenia się gigaseal użyj sterowanego komputerowo sterownika wzmacniacza, aby sprowadzić potencjał utrzymywania komórek do fizjologicznego potencjału spoczynkowego, aby zapobiec nagłym zmianom po pęknięciu błony. Po uformowaniu się gigaseal skompensuj szybką lub wolną pojemność.
Tutaj bardzo ważne jest, aby zastosowane ssanie nie było zbyt silne, w przeciwnym razie membrana może pęknąć przed ustanowieniem uszczelnienia.
Jeśli uszczelka pozostaje stabilna i przekracza 1 gigaom, zastosuj krótkie i silne ssanie, aby rozerwać błonę plazmatyczną.
Ssanie musi być krótkie i jest silniejsze niż ciśnienie stosowane podczas zakładania uszczelnienia, aby prawidłowo rozerwać membranę i uzyskać stabilną konfigurację całej komórki.