Ustanawianie opaski krosowej całej komórki do zapisu elektrofizjologicznego z siatkówki myszy z płaskim mocowaniem

Umieść płaską siatkówkę myszy w roztworze fizjologicznym w komorze nagrywającej.

Za pomocą mikroskopu umieść pipetę rejestrującą nad siatkówką. Pipeta zawiera elektrodę i jest wypełniona roztworem wewnętrznym.

Zastosuj nadciśnienie, aby zapobiec zatkaniu pipety, włóż ją do siatkówki, a następnie zmniejsz ciśnienie, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.

Przesuń pipetę w kierunku komórek amakrynowych gwiazdotwórczych lub SAC, które są synaptycznie połączone z innymi neuronami.

Zbliż się do komórki, aż na jej błonie utworzy się wgłębienie. Zwolnij nacisk, pozwalając membranie przylegać do końcówki.

Użyj prądu ujemnego, aby narysować plaster membranowy do pipety.

Zastosuj ssanie, aby rozerwać membranę, ustanawiając ciągłość między elektrodą a cytoplazmą komórki, techniką zwaną opaską krosową całej komórki.

Aby zarejestrować prądy synaptyczne, należy przyłożyć napięcie, aby utrzymać stały potencjał błony SAC.

Neuroprzekaźniki uwalniane przez neurony połączone synaptycznie wyzwalają przepływ jonów przez receptory synaptyczne SAC, mierzony przez elektrodę.

W tej procedurze przefiltruj roztwór wewnętrzny przez filtr strzykawkowy do niestandardowego filamentu do wypełniacza. Następnie włóż filament do świeżo wyciągniętej mikropipety i dozuj roztwór wewnętrzny w pobliżu końcówki, aż roztwór pokryje drut srebrnej elektrody na więcej niż 5 milimetrów. Następnie przymocuj mikropipetę do uchwytu elektrody z drążkiem ssącym, za pomocą którego można regulować ciśnienie wewnątrz elektrody, naciskając lub pociągając tłok 10-mililitrowej plastikowej strzykawki podłączonej do rurki.

Następnie umieść pipetę pod obiektywem i obniż ją do około 100 mikrometrów powyżej siatkówki. W obecnym trybie wtórnika użyj przesunięcia DC, aby wyzerować stojący sygnał napięcia DC. Zmierz rezystancję pipety w trybie cęgów prądowych, wstrzykując przez pipetę prądy o fali prostokątnej o stałej amplitudzie, gdy znajduje się ona w kąpieli. Zneutralizuj różnicę, obracając pokrętło dostępu R i korzystając z odczytu na nim, aby obliczyć rezystancję pipety.

Następnie powoli umieść elektrodę na wysokości około 10 mikrometrów nad siatkówką. Zastosuj nadciśnienie do elektrody. Następnie obserwuj, jak odbicie zmienia się na końcówce pipety, gdy zbliża się ona do siatkówki.

Szybko, ale delikatnie wepchnij pipetę do GCL i natychmiast zmniejsz nadciśnienie. Przesuń pipetę w kierunku oznakowanego neuronu i unikaj kontaktu z innymi neuronami, naczyniami krwionośnymi i stopami końcowymi komórek Müllera. W razie potrzeby zastosuj większe nadciśnienie, aby zapobiec zatkaniu elektrody.

Następnie umieść końcówkę pipety w pobliżu oznaczonego neuronu, aż będzie widoczny wgłębienie. Następnie zwolnij nadciśnienie i pozwól, aby błona plazmatyczna odbiła się z powrotem na końcówkę pipety. Zastosuj do pipety prądy ujemne o natężeniu od 20 do 120 pico amperów, aby pomóc w tworzeniu gigaomowego uszczelnienia.

Umożliwienie błonie komórkowej odbicia się od niej po uwolnieniu nadciśnienia jest ważne, ponieważ doskonałe uszczelnienie utworzone naturalnie między błoną a otworem pipety jest ważne dla zachowania morfologii komórki po zarejestrowaniu.

W razie potrzeby zastosuj delikatne ssanie, aby wciągnąć błonę plazmatyczną do pipety. Odczekać pięć minut po utworzeniu się uszczelnienia, aby pękła błona komórkowa, aby umożliwić usunięcie rozlanego roztworu wewnętrznego przez superfuzję. Po pęknięciu membrany i w bieżącym trybie zacisku włącz balans mostka i wyreguluj go za pomocą pokrętła osi R. Rejestruj pobudzające i hamujące prądy postsynaptyczne w trybie cęgów napięciowych, utrzymując ogniwo przy potencjałach odwrócenia.