Name: Wybór pasożytów Plasmodium falciparum do cytoadhezji do komórek śródbłonka ludzkiego mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Poznaj metodę selekcji Plasmodium falciparum do cytoadhezji do komórek śródbłonka mózgu człowieka. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów malarii mózgowej i identyfikację potencjalnych celów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Francisco Candalowi z CDC Technology Transfer Office w Atlancie w Georgii za udostępnienie komórek HBEC-5i. Praca ta była finansowana przez Wellcome Trust (4-letni stypendium doktoranckie dla AC oraz Senior Fellowship in Basic Biomedical Science dla JAR, numer grantu 084226).

Ogólne zalecenia
Kulturowanie ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka mózgu (HBEC-5i) zostało wcześniej opisane w 6, 8. Pasożyty P. falciparum hodowano zgodnie z opisem w 9. Zarówno hodowle HBEC-5i, jak i pasożytów P. falciparum powinny być przez cały czas utrzymywane w warunkach sterylnych. Wszystkie odczynniki należy uprzednio podgrzać do 37°C. Zalecamy regularne sprawdzanie obecności kontaminacji mykoplazmami10 za pomocą metody PCR (Minevera Biolabs, zgodnie z instrukcjami producenta). Protokół przedstawiono w skrócie na Ryc. 1.
1. Rutyniczna hodowla komórek śródbłonka
<ol>
 <li>Przygotuj niezbędne odczynniki.</li>
</ol>
<table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td>
 Medium do przygotowania</td>
 <td>
 Odczynniki</td>
 <td>
 Ilość</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>"DMEM niepełny"</td>
 <td>DMEM-F12 Ham</td>
 <td>50ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>  </td>
 <td>L-glutamina 20mM</td>
 <td>5ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>  </td>
 <td>Penicylina/streptomycyna 10X</td>
 <td>5 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>  </td>
 <td>NaOH 1M</td>
 <td>1.3 ml (dostosować pH do 7.4)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>"DMEM pełny"</td>
 <td>"DMEM niepełny"</td>
 <td>450ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>  </td>
 <td>Surowica płodowa wołową inaktywowana ciepłem</td>
 <td>50ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>  </td>
 <td>Suplement wzrostu komórek śródbłonka</td>
 <td>5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
 
<ol start="2">
 <li>Hoduj komórki HBEC-5i w wentylowanej kolbie o powierzchni 25cm2 w 10ml kompletnej pożywki DMEM w inkubatorze przy 37°C i 5% CO2.</li>
 <li>Przeprowadzaj pasażowanie komórek po osiągnięciu pełnej konfluencji. Usuń starą pożywkę za pomocą odsysacza i przemyj dwukrotnie niekompletną pożywką DMEM lub PBS klasy kultur tkankowych (bez Ca2+ i Mg2+), uprzednio ogrzanym do 37°C.</li>
 <li>Dodaj 1ml uprzednio ogrzanego Trypsyny-EDTA (0,025% Trypsyny, 0,5mM EDTA), zamieszaj, aby pokryć całą powierzchnię kolby, i inkubuj przez ok. 2 min w 37°C.</li>
 <li>Sprawdź pod mikroskopem odwróconym, czy co najmniej 90% komórek oddzieliło się od podłoża. W razie potrzeby delikatnie uderz w dno kolby, aby odczepić przylegające komórki. Dodaj 10ml kompletnej pożywki DMEM w celu zablokowania działania trypsyny i przenieś komórki do probówki stożkowej o pojemności 15ml. Centryfuguj przez 4 min przy 300 g w temperaturze pokojowej (RT).</li>
 <li>Odlej nadsącz i resuspenduj osad w 10ml kompletnej pożywki DMEM. Pipetuj roztwór w górę i w dół, aby dokładnie resuspenderć komórki.</li>
 <li>Przenieś 1 lub 2 ml zawiesiny komórkowej do nowej kolby hodowlanej i dodaj 8ml świeżej pożywki w celu podtrzymania hodowli. Codziennie oceniaj wzrost kultury pod mikroskopem odwróconym i wymieniaj pożywkę co 2 lub 3 dni, zanim zmieni ona kolor na żółty.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek śródbłonka do selekcji
<ol>
 <li>Na dwa dni przed dniem selekcji, do jednej (lub więcej) szalki Petriego o średnicy 60 mm dodaj fibronektynę rozcieńczoną w sterylnym PBS (2 μg/cm2). Inkubuj szalkę przez 5 do 20 min w temperaturze 37°C, a następnie usuń roztwór fibronektyny, który można przechowywać w 4°C przez miesiąc i wykorzystać ponownie jeden raz.</li>
 <li>Wykonaj pasażowanie komórek zgodnie z opisem w sekcjach 1.3. do 1.5. Zakładając, że odłączone komórki przy 100% konfluencji zawieszono w 10 ml kompletnego medium DMEM (sekcja 1.6., w przypadku niższej konfluencji zawiesić w odpowiednio mniejszej objętości medium, np. w 8 ml, jeśli konfluencja wynosiła 80%), dodaj 1,5 ml zawiesiny komórkowej do szalki Petriego powlekanej fibronektyną oraz kolejne 1,5 ml kompletnego medium DMEM.</li>
 <li>Umieść zasianą szalkę Petriego w inkubatorze. Uwaga: Optymalnie konfluencja powinna wynosić około 90% w momencie selekcji dwa dni później.</li>
 <li>Opcjonalnie. Aby aktywować HBEC-5i, 24 godziny przed selekcją dodaj cytokinę TNF (Tumour Necrosis Factor) do końcowego stężenia 50μg/ml.</li>
</ol>
3. Rutynowa hodowla Plasmodium falciparum
<ol>
 <li>Przygotować niezbędne odczynniki (patrz tabela poniżej). Przygotować ludzkie erytrocyty (RBC), oddzielając je z krwi pełnej (grupa O+) poprzez przepuszczenie przez filtr do usuwania leukocytów (ogólne zasady hodowli pasożytów malarii opisano w publikacji „Methods in Malaria Research”11). Przemyć erytrocyty dwukrotnie, wirując przy 40 g przez 5 min i resuspendując je w 10 ml niepełnej pożywki RPMI. Przechowywać przemyte erytrocyty w temperaturze 4°C w pożywce niepełnej przy hematokrycie 50%.</li>
</ol>
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Pożywka do przygotowania</td>
 <td>Odczynniki</td>
 <td>Ilość</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>"RPMI niepełna"</td>
 <td>RPMI 1640 (z wodorowęglanem)</td>
 <td>50ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>Hepes 1M</td>
 <td>12.5ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>Glukoza 20%</td>
 <td>5ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>L-glutamina 200mM</td>
 <td>5ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>Gentamycyna 50mg/ml</td>
 <td>250μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>NaOH 1M</td>
 <td>0.7 ml (dostosować pH do 7.2)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>"RPMI pełna"</td>
 <td>"RPMI niepełna"</td>
 <td>450ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>Pooled human (non-immune) serum</td>
 <td>50ml</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
 
<ol start="2">
 <li>Hodować zakażone P. falciparum erytrocyty w pełnej pożywce RPMI przy 2% hematokrycie i inkubować w temperaturze 37°C w atmosferze 3% CO2, 1% O2 i 96% N2. Codziennie wykonywać rozmaz Giemsy1 w celu oceny stadium rozwoju pasożytów (Rysunek 2).</li>
 <li>Regularnie (około raz w tygodniu) synchronizować hodowlę poprzez traktowanie sorbitolem12. W dniu poprzedzającym test selekcyjny dążyć do uzyskania hodowli w stadium pierścienia przy parasitemii 5% lub wyższej (idealnie co najmniej 10%).</li>
</ol>
4. Selekcja P. falciparum pod kątem cytoadhezji do komórek śródbłonka
<ol>
 <li>W dniu przeprowadzenia analizy hodowla pasożytów powinna znajdować się w stadium pigmentowanych trofozoitów (Rysunek 2) (idealnie 10% parasitemii), natomiast hodowla HBEC-5i powinna osiągnąć od 50 do 100% konfluencji (idealnie 90%). Na każdą płytkę Petri z HBEC-5i wymagane jest 30μl objętości spakowanych komórek hodowli pasożytów.</li>
 <li>Przemyj pasożyty dwukrotnie, wirując (50g przez 5 min) 1,5ml hodowli pasożytów. Odlej nadosad i resuspenduj w 10ml świeżo przygotowanego, ogrzanego, niepełnego medium DMEM. Powtórz płukanie drugi raz. Resuspenduj 30μl objętości spakowanych komórek w 1,5ml niepełnego DMEM z 1% BSA.</li>
 <li>Przemyj powleczoną komórkami HBEC-5i płytkę Petri dwukrotnie, odsysając medium i dodając 3ml niepełnego DMEM.</li>
 <li>Dodaj zawiesinę pasożytów do płytki z HBEC-5i i inkubuj w 37°C przez 75min. Dwukrotnie resuspenduj pasożyty (po 30 i 60 min) podczas inkubacji, delikatnie kołysząc płytką w czterech kierunkach, a także zgodnie i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.</li>
 <li>Po inkubacji przemyj płytkę 5 razy poprzez odsysanie medium, dodawanie 3ml ciepłego niepełnego medium DMEM za pomocą plastikowej pipety Pasteura oraz delikatne kołysanie. W przypadku użycia wielu płytek, trzymaj je na ciepłej powierzchni, np. w dużej kolbie wypełnionej wodą o temperaturze 37°C.</li>
 <li>Sprawdź płytkę pod mikroskopem odwróconym. Jeśli wciąż widoczne są liczne niezakażone RBC, wykonaj dodatkowe płukania zgodnie z powyższym opisem. Operuj płytką Petri bardzo ostrożnie, aby uniknąć ryzyka kontaminacji.</li>
 <li>Usuń medium z płytki i dodaj 3ml ciepłego pełnego medium RPMI z 40μl objętości spakowanych komórek świeżych uRBC.</li>
 <li>Umieść płytkę w szczelnej komorze inkubacyjnej, przeprowadź gazowanie przez 3 min i umieść komorę w inkubatorze w 37°C na noc.</li>
 <li>Następnego dnia zbierz pasożyty, płukąc je niepełnym medium RPMI w sposób podobny do opisanego w sekcji 4.4, ale intensywniej. Całe zużyte medium (zawierające zresuspendowane RBC) przechowuj w probówce stożkowej 15ml. Sprawdź pod mikroskopem odwróconym, czy wszystkie RBC zostały usunięte z płytki.</li>
 <li>Odwiruj pasożyty, odlej nadosad, resuspenduj w 5ml pełnego medium RPMI i przelej mieszaninę do kolby do standardowego hodowania.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Nieselekcjonowane pasożyty wykazują niski poziom wiązania do HBEC-5i (Rysunek 3A). W związku z tym, po pierwszej rundzie selekcji, zebrać zostanie bardzo mało pasożytów, a osiągnięcie parasytemii wystarczającej do drugiej rundy selekcji może wymagać nawet miesiąca hodowli. Po każdej rundzie selekcji coraz więcej pasożytów wiąże się z komórkami śródbłonka, co pozwala na powtarzanie selekcji w krótszych odstępach czasu. Po 4-5 rundach selekcji uzyskuje się populacje pasożytów o wysokim powinowactwie do wiązania (Rysunek 3).
W naszych badaniach wiązanie HB3-HBEC do HBEC-5i lub aktywowanych TNF HBEC-5i znajdowało się na podobnym poziomie (dane nie zostały przedstawione).
Opisany tutaj protokół został przetestowany na 4 szczepach P. falciparum: HB3, IT/FCR3, 3D7 oraz Dd2 (Tabela 1). Tylko ten ostatni okazał się niezdolny do wiązania się z HBEC-5i, nawet po 5 rundach selekcji.
Wyselekcjonowano również pasożyty HB3 pod kątem cytoadhezji do ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka skóry i płuc (HDMEC oraz HPMEC). Po 4 rundach selekcji, przy zastosowaniu opisanej tutaj metody, uzyskano populację o wysokim stopniu wiązania zarówno na HDMEC, jak i HPMEC (Rysunek 4).
<img alt="Schemat selekcji pasożytów: inkubacja HBEC-5i, przemywanie, proces hodowli, czas zależny od stadium." src="/files/ftp_upload/3122/3122fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Przegląd procesu selekcji.
<img alt="Etapy infekcji komórek krwi; obrazy mikroskopowe iRBC w stadium pierścienia oraz iRBC z pigmentowanymi trofozoitami." src="/files/ftp_upload/3122/3122fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Etapy rozwoju P. falciparum zakażone erytrocytyPreparat barwiony metodą Giemsy oglądany pod mikroskopem przy powiększeniu 10X.
<img alt="Analiza wiązania pasożytów: obrazy mikroskopowe, wykres słupkowy; porównanie komórek HB3, wyniki doświadczalne." src="/files/ftp_upload/3122/3122fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. Typowy przykład wiązania się pasożytów z komórkami HBEC-5i(A) Niebieska warstwa to komórki HBEC-5i utrwalone glutaraldehydem i barwione metodą Giemsy, obrazowane pod mikroskopem przy powiększeniu 100X. Zdjęcia wykonano po wypłukaniu uRBC oraz nie związanych iRBC. Panel po lewej stronie przedstawia pojedynczą P. falciparum Pasożyt HB3 (nie wyselekcjonowany) związany z HBEC-5i. Na panelu prawym pasożyty HB3-HBEC były selekcjonowane przez 5 rund. (B) Dane przedstawiają średnią z dwóch niezależnych eksperymentów, z których każdy przeprowadzono w duplikacie. Policzono liczbę pasożytów związanych z jedną komórką śródbłonka.
<img alt="Tabela selekcyjna dla HBEC-5i przedstawia liczbę rund niezbędnych dla HB3, IT/FCR3, 3D7 (Tak) oraz Dd2 (Nie)." src="/files/ftp_upload/3122/3122table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Podsumowanie Plasmodium falciparum szczepy, które zostały pomyślnie wyselekcjonowane pod kątem wiązania z HBEC-5i. Należy zauważyć, że HB3 był selekcjonowany również na aktywowanych TNF komórkach HBEC-5i. Po 5 rundach selekcji szczep Dd2 nie wykazał zwiększonego wiązania z HBEC-5i w porównaniu do nieselekcjonowanego szczepu Dd2.
<img alt="Mikroskopia kultur komórkowych HDMEC i HPMEC przedstawiająca komórki HB3-Unselected oraz HB3-HBEC, jądra komórkowe zabarwione." src="/files/ftp_upload/3122/3122fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4. Wiązanie P. falciparum pasożyty HB3 do komórek śródbłonka skóry (HDMEC) i płuc (HPMEC), przed i po 4 rundach selekcji. Choć pożywka hodowlana dla HDMEC i HPMEC nieznacznie się różni (patrz instrukcje dostawcy), protokół wykorzystany do selekcji był identyczny jak w przypadku HBEC-5i. Zdjęcia wykonane przy 40-krotnym powiększeniu.

<table border="1">
<tbody >
 <tr>
 <td>Nazwa odczynnika</td>
 <td>Firma</td>
 <td>Numer katalogowy</td>
 <td>Uwagi</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM-F12 Ham </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>D6421 </td>
 <td>Do pełnej pożywki DMEM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamina 200mM </td>
 <td>GIBCO </td>
 <td>25030 </td>
 <td>Do pełnych pożywek DMEM i RPMI</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicylina/streptomycyna 10X (100 units/ml i 10mg/ml) </td>
 <td>ScienCell </td>
 <td>0503 </td>
 <td>Do pełnej pożywki DMEM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Płóca wołowa (FBS) inaktywowana ciepłem </td>
 <td>ScienCell </td>
 <td>025 </td>
 <td>Do pełnej pożywki DMEM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsyna-EDTA (0,025% Trypsin, 0,5mM EDTA) </td>
 <td>ScienCell </td>
 <td>0103 </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Suplement wzrostu komórek śródbłonka </td>
 <td>ScienCell </td>
 <td>1052 </td>
 <td>Do pełnej pożywki DMEM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Szalki Petriego 60 mm X 15 mm do hodowli tkankowych </td>
 <td>BD </td>
 <td>35302 </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ludzka fibronektyna </td>
 <td>Millipore </td>
 <td>FC010 </td>
 <td>Stosować w stężeniu 2 μg/cm2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TNF </td>
 <td>R&amp;D Systems </td>
 <td>210-TA </td>
 <td>opcjonalnie, stosować w stężeniu 50 μg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 </td>
 <td>Lonza </td>
 <td>BE12-167F </td>
 <td>Do pełnej pożywki RPMI</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycyna 50mg/ml </td>
 <td>Lonza </td>
 <td>17-518Z </td>
 <td>Do pełnej pożywki RPMI</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hepes 1M </td>
 <td>Lonza </td>
 <td>BE17-737E </td>
 <td>Do pełnej pożywki RPMI</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HDMEC </td>
 <td>ScienCell </td>
 <td>20 </td>
 <td>Pierwotna linia komórkowa</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HPMEC</td>
 <td>ScienCell</td>
 <td>30</td>
 <td>Pierwotna linia komórkowa</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBEC-5i</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>Otrzymano od Francisco Candal (fcandal@cdc.gov)</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
Tabela 2. Materiały

<ol><li>Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+malaria%3A+in+situ+switching%2C+relaxed+and+mutually+exclusive+transcription+of+var+genes+during+intra-erythrocytic+development+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum.</a> Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).</li>
<li>MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+malaria.+A+quantitative+ultrastructural+analysis+of+parasitized+erythrocyte+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration.</a> Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).</li>
<li>Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+and+intensity+of+parasite+sequestration+in+comatose+Malawian+children%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children.</a> J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).</li>
<li>Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+the+pathologies+of+cerebral+malaria+by+postmortem+parasite+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts.</a> Nat. Med. 10, 143-145 (2004).</li>
<li>van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+hypothesis+for+the+genesis+of+cerebral+malaria%3A+sequestration%2C+inflammation+and+hemostasis+leading+to+microcirculatory+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction.</a> Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).</li>
<li>Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+characterization+of+microvascular+endothelial+cells+derived+from+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain.</a> Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).</li>
<li>Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. A., Arman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+to+human+cells%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to human cells: molecular mechanisms and therapeutic implications.</a> Expert reviews in molecular medicine. 11, e16-e16 (2009).</li>
<li>Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum%3A+involvement+of+additional+receptors+in+the+cytoadherence+of+infected+erythrocytes+to+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum: involvement of additional receptors in the cytoadherence of infected erythrocytes to microvascular endothelial cells.</a> Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996).</li>
<li>Corrigan, R. A., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+variation+in+early+innate+cytokine+induction+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum.</a> Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).</li>
<li>Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+mycoplasma+contamination+in+Plasmodium+falciparum+cultures+and+methods+for+its+detection+and+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).</li>
<li>Moll, K., Ljungström, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoll%2C+K+%22Methods+in+Malaria+Research%22">Methods in Malaria Research</a>. , MR4/ATCC. (2009).</li>
<li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li>
<li>Herricks, T., Antia, M., Rathod, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformability+limits+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Deformability limits of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> Cell. Microbiol. , (2009).</li>
<li>Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum-infected+erythrocyte+receptor%28s%29+for+CD36+and+thrombospondin+are+restricted+to+knobs+on+the+erythrocyte+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface.</a> J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).</li>
<li>Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMP-420%2C+a+new+therapeutic+approach+for+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria.</a> Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).</li>
<li>Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+potentiate+brain+endothelial+alterations+induced+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum.</a> Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Charakterystyczną cechą malarii mózgowej jest sekwestracja P. falciparum iRBC w obrębie mikrokrążenia mózgowego2, 3Jednakże, in vitro hodowle P. falciparum wykazują jedynie słabą cytoadhezję do HBEC-5i, modelu ludzkiego śródbłonka mikro naczyniowego mózgu. Opracowaliśmy prosty test umożliwiający wzbogacenie populacji pod kątem wiązania się z HBEC-5i, co pozwala na uzyskanie bardziejin vivo fenotyp podobny do [...]. Trzech z 4 P. falciparum Metodą tą pomyślnie wyselekcjonowano szczepy. Ponadto szczep HB3 wyselekcjonowano również na komórkach HDMEC i HPMEC, co wskazuje, że protokół ten może być stosowany dla różnych typów pasożytów i komórek śródbłonka.
Brak wiązania ze szczepem Dd2 można wyjaśnić za pomocą różnych hipotez. Najbardziej prawdopodobną jest fakt, że linia pasożyta ta jest pozbawiona guzków (knobless), co znacznie utrudnia cytoadherencję13, 14.
Zalecamy hodowlę nie wyselekcjonowanych pasożytów równolegle z procesem selekcji, aby zapewnić kontrolę do porównania. Pozwoli to na przykład na porównanie transkryptomu pasożytów wiążących i niewiążących, z nadzieją na odkrycie potencjalnych ligandów pasożytniczych.
TNF jest cytokiną występującą w wysokim stężeniu u pacjentów z malarią mózgową i wykazano, że indukuje ona ekspresję wielu białek powierzchniowych HBEC-5i (Claessens et al, w przygotowaniu oraz 8, 15, 16). W tym przypadku ilość związanych iRBC była podobna w normalnych komórkach HBEC-5i w porównaniu do aktywowanych komórek HBEC-5i.
Ten „model sekwestracji” może być również wykorzystany do badania oddziaływań molekularnych między iRBC a komórką śródbłonka, a także wpływu potencjalnych leków przeciwcytoadhezyjnych. W tym przypadku zaleca się wysiewanie HBEC-5i w mniejszych dołkach, takich jak „slajdy komorowe 8-dołkowe” (BD 354628) lub „CultureWell” (Sigma C7735-20EA).

wybór pasożytów plasmodium falciparum pod kątem cytoadhezji do ludzkich komórek śródbłonka mózgu

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Większość zgonów z powodu malarii u ludzi jest spowodowana pasożytami Plasmodium falciparum w stadium krwi. Malaria mózgowa, najgroźniejsze powikłanie tej choroby, charakteryzuje się gromadzeniem zakażonych Plasmodium falciparum czerwonych krwinek (iRBC) w stadium pigmentowanych trofozoitów w mikrokrążeniu mózgu2-4. Ta niedrożność mikronaczyniowa (sekwestracja) prowadzi do kwasicy, hipoksji i wydzielania szkodliwych cytokin zapalnych (przegląd w 5). Sekwestracja występuje również w większości tkanek mikrokrążenia w organizmie człowieka2, 3. Mechanizm, w którym iRBC przytwierdzają się do ścian naczyń krwionośnych, nie jest jeszcze dobrze poznany.
Unieśmiertelniona linia ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka mózgu (HBEC-5i) była wykorzystywana jako model in vitro bariery krew-mózg6. Jednakże iRBC Plasmodium falciparum słabo przylegają do komórek HBEC-5i in vitro, co różni się od gęstej sekwestracji występującej w przypadkach malarii mózgowej. Opracowaliśmy zatem test przeglądowy (panning assay) w celu selekcji (wzbogacenia) różnych szczepów P. falciparum pod kątem adhezji do HBEC-5i, aby uzyskać populacje pasożytów o wysokim stopniu wiązania, bardziej reprezentatywne dla zjawisk zachodzących in vivo.
Próbkę hodowli pasożytów (mieszaninę iRBC i niezinfekowanych RBC) w stadium pigmentowanych trofozoitów poddaje się przemywaniu, a następnie inkubuje na warstwie komórek HBEC-5i hodowanych na płytce Petriego. Po inkubacji płytkę delikatnie przemywa się, aby usunąć uRBC oraz niezwiązane iRBC. Do niewielkiej liczby iRBC przytwierdzonych do HBEC-5i dodaje się świeże uRBC i inkubuje przez noc. W momencie pękania pasożytów w stadium schizontów, merozoity ponownie infekują RBC; te pasożyty w stadium pierściankowym są zbierane następnego dnia. Pasożyty hoduje się do momentu uzyskania odpowiedniej ilości materiału (zazwyczaj od 2 do 4 tygodni), po czym można przeprowadzić kolejną rundę selekcji. W zależności od szczepu P. falciparum konieczne jest przeprowadzenie od 4 do 7 rund selekcji, aby uzyskać populację, w której większość pasożytów wiąże się z HBEC-5i. Fenotyp wiązania jest stopniowo tracony po kilku tygodniach, co wskazuje na zmianę w ekspresji genów wariantowych antygenów powierzchniowych, dlatego do utrzymania fenotypu wymagana jest regularna selekcja na HBEC-5i.
Podsumowując, opracowaliśmy test selekcyjny nadający pasożytom P. falciparum fenotyp bardziej „przylepny w przebiegu malarii mózgowej”. Byliśmy w stanie wyselekcjonować 3 z 4 szczepów P. falciparum na komórkach HBEC-5i. Test ten został również z sukcesem wykorzystany do selekcji pasożytów wiążących się z ludzkimi komórkami śródbłonka skóry i płuc. Co istotne, metoda ta może być stosowana do selekcji populacji pasożytów specyficznych tkankowo w celu zidentyfikowania potencjalnych ligandów pasożytów wiążących się ze śródbłonkiem mózgu. Ponadto test ten może służyć do przesiewowania potencjalnych leków przeciwdziałających sekwestracji7.

Opisano model in vitro sekwestracji w malarii mózgowej1. Krwinki czerwone zakażone Plasmodium falciparum są selekcjonowane pod kątem wiązania się z unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami śródbłonka mikrokrążenia mózgowego. Wyselekcjonowane pasożyty wykazują wyraźny fenotyp. Proces selekcji można zastosować w przypadku różnych szczepów P. falciparum oraz linii komórek śródbłonka.

Wybór pasożytów Plasmodium falciparum pod kątem cytoadhezji do ludzkich komórek śródbłonka mózgu

Większość zgonów na malarię u ludzi jest spowodowana przez pasożyty Plasmodium falciparum w stadium krwinkowym. Malaria mózgowa, najgroźniejsza dla życia komplikacja...

Ogólnym celem tej procedury jest wyselekcjonowanie pasożytów z gatunku Plasmodium falciparum wykazujących zdolność do wiązania się z ludzkimi komórkami śródbłonka mózgu. Osiąga się to poprzez inkubację kultury Plasmodium falciparum i pasożytów, zawierającej mieszaninę zainfekowanych i niezainfekowanych erytrocytów, z warstwą ludzkich komórek śródbłonka mózgu; kolejnym krokiem jest usunięcie niezainfekowanych i niewiązanych erytrocytów poprzez kilkukrotne przemycie ich pożywką hodowlaną. Następnie dodaje się świeże erytrocyty, aby umożliwić dalszy wzrost populacji pasożytów.Ostatnim krokiem, wykonanym kilka tygodni później, jest powtórzenie całego procesu selekcji, gdy tylko osiągnięta zostanie wystarczająca liczba pasożytów. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię, aby wykazać wysoką liczbę pasożytów związanych z HBE five i. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie malarii mózgowej, takie jak identyfikacja ligandów pasożytów lub cząsteczek receptorowych gospodarza zaangażowanych w proces cytoadherencji.Przygotuj ludzkie erytrocyty z krwi pełnej grupy O dodatniej, oddzielając krwinki czerwone od białych krwinek poprzez przepuszczenie ich przez filtr do leukocytredukcji. Odwiruj komórki przy 1000 G przez 10 minut i przemyj osad w PMI Incomplete medium.Powtórz ten etap płukania jeszcze raz, a następnie ponownie zawiesić osad. W naszym niepełnym medium PMI przy hematokrycie 50%, erytrocyty są przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsius przez tydzień. Hoduj erytrocyty zakażone Odium Valspar.Uzupełnić pożywką RPMI z 2% hematokrytem i inkubować codziennie w temperaturze 37 °C przy 3% carbon dioxide, 1% oxygen i 96% nitrogen. Wykonać rozmaz Giemsy, aby ocenić stopień rozwoju pasożytów. Wymieniać pożywkę codziennie, wirując kulturę przy 500 G przez pięć minut.Odsysanie supernatantu i dodawanie świeżej kompletnej pożywki RPMI około raz w tygodniu. Synchronizacja pasożytów poprzezy traktowanie 5% wodnym roztworem sorbitolu. Test selekcyjny można przeprowadzić dzień po zaobserwowaniu w hodowli stadium pierścionka w ilości minimum 5% do 10% Parsit.Dodatkowo, na każdą płytkę 60 mm z komórkami hbe five eye wymagana jest ilość kultury pasożytów wystarczająca do utworzenia 30 µL objętości komórek P. Przygotuj 60-milimetrową płytkę do hodowli tkankowej dla linii ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka mózgu lub H back fivei, dodając do płytki 2 µg/cm² fibronektyny i sterylną sól fizjologiczną.Inkubuj naczynie w temperaturze 37 °C przez 5 do 20 minut, a następnie odessij roztwór fibronektyny. Następnie pobierz komórki HBE 5I z kolby tkankowej o wymiarach 25 cm² poprzez trypsynizację i wirowanie, zawieszając osad komórkowy w 10 ml pełnej pożywki DMEM. Następnie dodaj 1,5 ml tej zawiesiny komórkowej do naczynia hodowlanego potraktowanego fibronektyną i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez dwa do trzech dni, aż kultura osiągnie 50 do 100% konfluencji; w ten sposób kultury będą gotowe do analizy cytokinowej w dniu przeprowadzenia testu.Kultura HBE powinna osiągnąć od 50 do 100% zbieżności. Z kolei kultura pasożytów powinna znajdować się w stadium pigmentowanych trofozoitów z zawartością co najmniej 5 do 10% pasożytów i 2% hematokrytu. Najpierw odpipetuj 1,5 ml kultury pasożytów z kolby hodowlanej i przenieś do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.Odwiruj kulturę przy 500 G przez pięć minut i ponownie zawieś w 10 mililitrach świeżo przygotowanej, ogrzanej, niepełnej pożywki DMEM. Powtórz ten etap płukania po raz drugi po zakończeniu końcowego wirowania.Odmierz niepełne podłoże DMEM i resuspender pellet o objętości 30 µL w 1,5 mL niepełnego podłoża DMEM uzupełnionego o 1% BSA. Następnie wyjmij szalkę 60 mm z hvac.Five.Odessać pożywkę z komórek oka i przemyć je dwukrotnie 3 ml niepełnego pożywki DMEM. Dodać zawiesinę pasożytów do naczynia z komórkami HPE5 i inkubować w inkubatorze do hodowli tkanek przez łącznie 75 minut.Dwukrotnie podczas inkubacji resuspendować pasożyty, delikatnie kołysząc i obracając naczyniem po zakończeniu inkubacji. Przemyć naczynie pięciokrotnie, odsysając medium za pomocą plastikowej pipety Pasteura i dodając 3 mL ciepłej niepełnej pożywki DMEM; po ostatnim płukaniu delikatnie zakołysać płytką i zbadać naczynie pod mikroskopem odwróconym. Jeśli nadal widoczne są liczne niezarażone erytrocyty, powtórzyć procedurę płukania zgodnie z powyższym opisem, aby je usunąć.Po odessaniu pożywki z szalki, resuspenduj 40 µL upakowanej objętości świeżych erytrocytów w ogrzanym pełnym medium RPMI, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do szalki. Umieść szalkę w szczelnej komorze inkubacyjnej. Następnie przepłucz szalkę mieszaniną gazów zawierającą 3% carbon dioxide, 1% oxygen i 96% nitrogen przez trzy minuty.Następnie umieść komorę w inkubatorze w temperaturze 37°C na noc. Podczas inkubacji pasożyty w stadium schizontów pękają, a merozoity reinfekują erytrocyty. Następnego dnia zbierz pasożyty w stadium pierścienia poprzez przemywanie.Przy użyciu niepełnego medium RPMI w podobny sposób jak poprzednio, lecz z bardziej intensywnym pipetowaniem medium i kołysaniem płytki. Całe zużyte medium zawierające resuspenderowane erytrocyty należy zachować w probówce stożkowej o pojemności 15 mililitrów. Płytkę należy sprawdzić pod mikroskopem odwróconym, aby upewnić się, że wszystkie erytrocyty zostały usunięte z wirówki do naczyń.Z probówki zawierającej medium z wypłukanej płytki, służącej do pelletowania pasożytów, należy odrzucić nadsącz. Przesuspender osad w pięciu mililitrach kompletnego medium RPMI i przenieść mieszaninę do kolby o pojemności 25 cm² w celu hodowli. Pasożyty hoduje się od dwóch do czterech tygodni, aż do uzyskania wystarczającej ilości materiału, co umożliwi przeprowadzenie kolejnej rundy selekcji.Nie wyselekcjonowane pasożyty HB three wykazują niski poziom wiązania z komórkami hbe five eye. Na obrazie przedstawiono komórki hbe five eye utrwalone 2% glutaraldehydem i zabarwione giemsą, wizualizowane pod mikroskopem przy powiększeniu 1000x; zdjęcia wykonano po wypłukaniu niezinfekowanych erytrocytów oraz niezwiązanych zainfekowanych erytrocytów. Po każdej rundzie selekcji coraz więcej pasożytów wiąże się z komórkami śródbłonkowymi, a selekcję można powtarzać w krótszych odstępach czasu po pięciu rundach selekcji.Populacje pasożytów o wysokim powinowactwie wiązania uzyskuje się w sposób przedstawiony tutaj z pasożytami HB three HBE. Tabela ta zawiera podsumowanie szczepów plasmodium alspar, które zostały pomyślnie wyselekcjonowane pod kątem wiązania z HE five. Zauważam, że HB three został również wyselekcjonowany na TNF aktywowanym HE five I po pięciu rundach selekcji.Szczep DD dwa nie wykazał zwiększonego wiązania z HBE pięć I w porównaniu do niepoddanego selekcji szczepu DD dwa. Ten obraz przy 400-krotnym powiększeniu przedstawia wiązanie pasożytów plasmodium alspar HB trzy z dermalnymi komórkami śródbłonka HD MEK przed selekcją. Tutaj pokazano wiązanie pasożytów plasmodium alspar HB trzy z tą samą linią dermalnych komórek śródbłonka po czterech rundach selekcji.Rysunek ten przedstawia wiązanie pasożytów Plasmodium spar HB3 z komórkami śródbłonka płuc HPME przed selekcją. Obecnie wiązanie pasożytów Plasmodium spar HB3 z komórkami H HPME wzrosło po czterech rundach selekcji. Chociaż pożywka hodowlana dla hd e, C i H HP EC nieco się różni, protokół użyty do selekcji był identyczny jak w przypadku hbe five I. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić metody takie jak RT-PCR lub mikroanalizę w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące charakterystyki transkrypcji wariantowego antygenu powierzchniowego w pasożytach nieselekcjonowanych i selekcjonowanych.

selection-plasmodium-falciparum-parasites-for-cytoadhesion-to-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wybór pasożytów Plasmodium falciparum do cytoadhezji do ludzkich komórek śródbłonka mózgowych

Opracowaliśmy model koinfekcji malarią i HIV-1 in vitro, aby zbadać wpływ Plasmodium falciparum na cykl replikacyjny HIV-1 w ludzkich pierwotnych makrofagach pochodzących z monocytów. Ten wszechstronny system można łatwo dostosować do innych typów komórek pierwotnych podatnych na zakażenie HIV-1.

Model koinfekcji In vitro do badania interakcji między Plasmodium falciparum a HIV-1 w ludzkich pierwotnych komórkach odpornościowych pochodzących z monocytów

Metoda ta bada fenotyp agregacji erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum (pRBC) pośredniczonej przez płytki krwi w izolatach klinicznych. Jest to realizowane poprzez izolację oraz wspólną inkubację osocza bogatopłytkowego i zawiesiny pRBC.

Prosty protokół badania agregacji erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum indukowanej przez płytki krwi w warunkach ograniczonego dostępu do zasobów

Opisano metodę izolacji przylegających leukocytów zapalnych z naczyń krwionośnych mózgu myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA. Metoda umożliwia kwantyfikację oraz charakterystykę fenotypową wyizolowanych leukocytów po barwieniu przeciwciałami fluorescencyjnymi, a następnie analizie za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza sekwestrowanych w mózgu leukocytów myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA

Pomiar funkcji przeciwciał jest kluczem do zrozumienia odporności na malarię Plasmodium falciparum. Metoda ta opisuje oczyszczanie żywotnych merozoitów i pomiar fagocytozy zależnej od opsonizacji za pomocą cytometrii przepływowej.

Wysokowydajne oczyszczanie merozoitów Plasmodium falciparum do stosowania w testach przeciwciał opsonizujących

Pasożyt malarii atakuje i replikuje się w czerwonych krwinkach. Dokładna ocena inwazji merozoitu i parazytemii ma zatem kluczowe znaczenie w ocenie przebiegu zakażenia malarią. W tym miejscu opisujemy protokół oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru tych parametrów w mysim modelu malarii.

In vivo (in vivo) Ocena pasożytytemii zarodźca gryzoni i inwazji merozoitu za pomocą cytometrii przepływowej

Ekspresja białek malarycznych w systemach komórkowych pozostaje wyzwaniem. Pokazujemy dwuetapowe i jednoetapowe systemy ekspresji komórkowej IVT (translacja in vitro) do ekspresji rekombinowanych białek rhoptrii malarii z komórek HeLa. Do oczyszczania białek rhoptrii używamy systemu oczyszczania opartego na powinowactwie do żywicy Ni.

Oparte na HeLa systemy ekspresji bezkomórkowej do ekspresji białek Plasmodium Rhoptry

Szczegółowe badania nad stadiami pasożytów malarii u komarów są niezbędne do opracowania skutecznych strategii blokowania transmisji. Protokół ten pokazuje, jak skutecznie hodować zakaźne gametocyty, a następnie karmić te gametocyty komarami w celu wytworzenia stadiów komara P. falciparum.

Plasmodium falciparum (Plasmodium falciparum) Hodowla gametocytów i infekcja komarów poprzez sztuczne karmienie błoną

Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie instrukcji, jak mierzyć zdolność przeciwciał obecnych w surowicach lub osoczu osób, naturalnie narażonych na zakażenie Plasmodium falciparum, do opsonizacji i indukowania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami (IE).

Pomiar naturalnie nabytych przeciwciał indukujących fagocytozę przeciwko pasożytom Plasmodium falciparum za pomocą testu opartego na cytometrii przepływowej

Używanie mielenia skupionej wiązki jonów do produkcji szklistych blaszek na siatce z zamrożonych próbek biologicznych do krioelektronowej tomografii.

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Standardowy test karmienia membranowego (SMFA) jest uważany za złoty standard oceny i identyfikacji potencjalnych związków przeciwmalarycznych. Ten sztuczny system karmienia jest używany do zakażania komarów w celu dalszej oceny wpływu takich związków na intensywność i częstość występowania pasożyta Plasmodium falciparum.

Standardowy test karmienia membranowego do wykrywania zakażenia Plasmodium falciparum u wektorów komarów Anopheles

Genetyka chemiczna polega na zastąpieniu reszty strażnika aminokwasem zawierającym inny łańcuch boczny w docelowym locus. W tym przypadku wygenerowaliśmy zmutowanego pasożyta zawierającego hipomorficzny allel cdpk1 i zidentyfikowaliśmy szlaki kompensacyjne przyjęte przez pasożyta na tle mutacji.

Zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych

Poznaj metodę selekcji Plasmodium falciparum do cytoadhezji do komórek śródbłonka mózgu człowieka. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów malarii mózgowej i identyfikację potencjalnych celów terapeutycznych.

Wybór pasożytów Plasmodium falciparum pod kątem cytoadhezji do ludzkich komórek śródbłonka mózgu

Przeglądaj więcej filmów