Wybór pasożytów Plasmodium falciparum pod kątem cytoadhezji do ludzkich komórek śródbłonka mózgu

Ogólnym celem tej procedury jest wyselekcjonowanie pasożytów z gatunku Plasmodium falciparum wykazujących zdolność do wiązania się z ludzkimi komórkami śródbłonka mózgu. Osiąga się to poprzez inkubację kultury Plasmodium falciparum i pasożytów, zawierającej mieszaninę zainfekowanych i niezainfekowanych erytrocytów, z warstwą ludzkich komórek śródbłonka mózgu; kolejnym krokiem jest usunięcie niezainfekowanych i niewiązanych erytrocytów poprzez kilkukrotne przemycie ich pożywką hodowlaną. Następnie dodaje się świeże erytrocyty, aby umożliwić dalszy wzrost populacji pasożytów.

Ostatnim krokiem, wykonanym kilka tygodni później, jest powtórzenie całego procesu selekcji, gdy tylko osiągnięta zostanie wystarczająca liczba pasożytów. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię, aby wykazać wysoką liczbę pasożytów związanych z HBE five i. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie malarii mózgowej, takie jak identyfikacja ligandów pasożytów lub cząsteczek receptorowych gospodarza zaangażowanych w proces cytoadherencji.

Przygotuj ludzkie erytrocyty z krwi pełnej grupy O dodatniej, oddzielając krwinki czerwone od białych krwinek poprzez przepuszczenie ich przez filtr do leukocytredukcji. Odwiruj komórki przy 1000 G przez 10 minut i przemyj osad w PMI Incomplete medium.

Powtórz ten etap płukania jeszcze raz, a następnie ponownie zawiesić osad. W naszym niepełnym medium PMI przy hematokrycie 50%, erytrocyty są przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsius przez tydzień. Hoduj erytrocyty zakażone Odium Valspar.

Uzupełnić pożywką RPMI z 2% hematokrytem i inkubować codziennie w temperaturze 37 °C przy 3% carbon dioxide, 1% oxygen i 96% nitrogen. Wykonać rozmaz Giemsy, aby ocenić stopień rozwoju pasożytów. Wymieniać pożywkę codziennie, wirując kulturę przy 500 G przez pięć minut.

Odsysanie supernatantu i dodawanie świeżej kompletnej pożywki RPMI około raz w tygodniu. Synchronizacja pasożytów poprzezy traktowanie 5% wodnym roztworem sorbitolu. Test selekcyjny można przeprowadzić dzień po zaobserwowaniu w hodowli stadium pierścionka w ilości minimum 5% do 10% Parsit.

Dodatkowo, na każdą płytkę 60 mm z komórkami hbe five eye wymagana jest ilość kultury pasożytów wystarczająca do utworzenia 30 µL objętości komórek P. Przygotuj 60-milimetrową płytkę do hodowli tkankowej dla linii ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka mózgu lub H back fivei, dodając do płytki 2 µg/cm² fibronektyny i sterylną sól fizjologiczną.

Inkubuj naczynie w temperaturze 37 °C przez 5 do 20 minut, a następnie odessij roztwór fibronektyny. Następnie pobierz komórki HBE 5I z kolby tkankowej o wymiarach 25 cm² poprzez trypsynizację i wirowanie, zawieszając osad komórkowy w 10 ml pełnej pożywki DMEM. Następnie dodaj 1,5 ml tej zawiesiny komórkowej do naczynia hodowlanego potraktowanego fibronektyną i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez dwa do trzech dni, aż kultura osiągnie 50 do 100% konfluencji; w ten sposób kultury będą gotowe do analizy cytokinowej w dniu przeprowadzenia testu.

Kultura HBE powinna osiągnąć od 50 do 100% zbieżności. Z kolei kultura pasożytów powinna znajdować się w stadium pigmentowanych trofozoitów z zawartością co najmniej 5 do 10% pasożytów i 2% hematokrytu. Najpierw odpipetuj 1,5 ml kultury pasożytów z kolby hodowlanej i przenieś do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.

Odwiruj kulturę przy 500 G przez pięć minut i ponownie zawieś w 10 mililitrach świeżo przygotowanej, ogrzanej, niepełnej pożywki DMEM. Powtórz ten etap płukania po raz drugi po zakończeniu końcowego wirowania.

Odmierz niepełne podłoże DMEM i resuspender pellet o objętości 30 µL w 1,5 mL niepełnego podłoża DMEM uzupełnionego o 1% BSA. Następnie wyjmij szalkę 60 mm z hvac.Five.

Odessać pożywkę z komórek oka i przemyć je dwukrotnie 3 ml niepełnego pożywki DMEM. Dodać zawiesinę pasożytów do naczynia z komórkami HPE5 i inkubować w inkubatorze do hodowli tkanek przez łącznie 75 minut.

Dwukrotnie podczas inkubacji resuspendować pasożyty, delikatnie kołysząc i obracając naczyniem po zakończeniu inkubacji. Przemyć naczynie pięciokrotnie, odsysając medium za pomocą plastikowej pipety Pasteura i dodając 3 mL ciepłej niepełnej pożywki DMEM; po ostatnim płukaniu delikatnie zakołysać płytką i zbadać naczynie pod mikroskopem odwróconym. Jeśli nadal widoczne są liczne niezarażone erytrocyty, powtórzyć procedurę płukania zgodnie z powyższym opisem, aby je usunąć.

Po odessaniu pożywki z szalki, resuspenduj 40 µL upakowanej objętości świeżych erytrocytów w ogrzanym pełnym medium RPMI, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do szalki. Umieść szalkę w szczelnej komorze inkubacyjnej. Następnie przepłucz szalkę mieszaniną gazów zawierającą 3% carbon dioxide, 1% oxygen i 96% nitrogen przez trzy minuty.

Następnie umieść komorę w inkubatorze w temperaturze 37°C na noc. Podczas inkubacji pasożyty w stadium schizontów pękają, a merozoity reinfekują erytrocyty. Następnego dnia zbierz pasożyty w stadium pierścienia poprzez przemywanie.

Przy użyciu niepełnego medium RPMI w podobny sposób jak poprzednio, lecz z bardziej intensywnym pipetowaniem medium i kołysaniem płytki. Całe zużyte medium zawierające resuspenderowane erytrocyty należy zachować w probówce stożkowej o pojemności 15 mililitrów. Płytkę należy sprawdzić pod mikroskopem odwróconym, aby upewnić się, że wszystkie erytrocyty zostały usunięte z wirówki do naczyń.

Z probówki zawierającej medium z wypłukanej płytki, służącej do pelletowania pasożytów, należy odrzucić nadsącz. Przesuspender osad w pięciu mililitrach kompletnego medium RPMI i przenieść mieszaninę do kolby o pojemności 25 cm² w celu hodowli. Pasożyty hoduje się od dwóch do czterech tygodni, aż do uzyskania wystarczającej ilości materiału, co umożliwi przeprowadzenie kolejnej rundy selekcji.

Nie wyselekcjonowane pasożyty HB three wykazują niski poziom wiązania z komórkami hbe five eye. Na obrazie przedstawiono komórki hbe five eye utrwalone 2% glutaraldehydem i zabarwione giemsą, wizualizowane pod mikroskopem przy powiększeniu 1000x; zdjęcia wykonano po wypłukaniu niezinfekowanych erytrocytów oraz niezwiązanych zainfekowanych erytrocytów. Po każdej rundzie selekcji coraz więcej pasożytów wiąże się z komórkami śródbłonkowymi, a selekcję można powtarzać w krótszych odstępach czasu po pięciu rundach selekcji.

Populacje pasożytów o wysokim powinowactwie wiązania uzyskuje się w sposób przedstawiony tutaj z pasożytami HB three HBE. Tabela ta zawiera podsumowanie szczepów plasmodium alspar, które zostały pomyślnie wyselekcjonowane pod kątem wiązania z HE five. Zauważam, że HB three został również wyselekcjonowany na TNF aktywowanym HE five I po pięciu rundach selekcji.

Szczep DD dwa nie wykazał zwiększonego wiązania z HBE pięć I w porównaniu do niepoddanego selekcji szczepu DD dwa. Ten obraz przy 400-krotnym powiększeniu przedstawia wiązanie pasożytów plasmodium alspar HB trzy z dermalnymi komórkami śródbłonka HD MEK przed selekcją. Tutaj pokazano wiązanie pasożytów plasmodium alspar HB trzy z tą samą linią dermalnych komórek śródbłonka po czterech rundach selekcji.

Rysunek ten przedstawia wiązanie pasożytów Plasmodium spar HB3 z komórkami śródbłonka płuc HPME przed selekcją. Obecnie wiązanie pasożytów Plasmodium spar HB3 z komórkami H HPME wzrosło po czterech rundach selekcji. Chociaż pożywka hodowlana dla hd e, C i H HP EC nieco się różni, protokół użyty do selekcji był identyczny jak w przypadku hbe five I. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić metody takie jak RT-PCR lub mikroanalizę w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące charakterystyki transkrypcji wariantowego antygenu powierzchniowego w pasożytach nieselekcjonowanych i selekcjonowanych.