Wywołane światłem reakcje postsynaptyczne w neuronach wycinków siatkówki myszy

Weź dostosowany do ciemności plaster siatkówki myszy w komorze nagraniowej w ciemnym pokoju. Siatkówka znajduje się na podtrzymującej sztucznej podstawie umieszczonej na szkiełku nakrywkowym. Wykonaj wycinek za pomocą CSF.

Sieć neuronowa siatkówki obejmuje fotoreceptory synaptycznie połączone z komórkami dwubiegunowymi, które synapsują się z komórkami zwojowymi.

Umieść pipetę rejestrującą w pobliżu siatkówki.

Pod mikroskopem zastosuj nadciśnienie, zbliżając się do docelowej komórki zwojowej.

Przełącz się na podciśnienie, aby wciągnąć łatkę błony, a następnie rozerwij ją, aby ustanowić ciągłość z cytoplazmą.

W ciemności błona fotoreceptora pozostaje zdepolaryzowana, co prowadzi do uwolnienia neuroprzekaźnika.

Neuroprzekaźniki wiążące się z receptorami komórek dwubiegunowych powodują zamknięcie kanału kationowego, hamując transmisję sygnału.

Zastosuj impuls świetlny, aby hiperpolaryzować fotoreceptory. Zmniejszone uwalnianie neuroprzekaźników powoduje otwarcie kanału kationowego w komórkach dwubiegunowych.

Napływ kationów indukuje uwalnianie neuroprzekaźników, które wiążą się z receptorami komórek zwojowych, generując pobudzający potencjał postsynaptyczny rejestrowany przez pipetę.

W przypadku nagrań typu patch-clamp należy zalać rurki perfuzyjne pożywką Amesa i pozwolić, aby wszystkie pęcherzyki przeszły z rurki. Po wykonaniu zapisu pipet za pomocą ściągacza do szkła, napełnij końcówkę roztworem pipety. Następnie użyj napełniacza do mikropipet, aby napełnić około jednej trzeciej pipety. Po napełnieniu każdą pipetę należy przechowywać w wilgotnym pudełku na pipety.

Następnie włącz sprzęt do nagrań typu patch-clamp, w tym komputer, wzmacniacz, kamerę CCD i mikroskop. Pracując w ciemnych warunkach, umieść preparat plastra siatkówki na stoliku mikroskopowym za pomocą wizjera na podczerwień. Po unieruchomieniu rozpocznij ciągłą perfuzję.

Ustaw temperaturę perfuzji na 33 do 37 stopni Celsjusza. Wyświetl powierzchnię przekroju za pomocą kamery CCD. Skoncentruj się na lokalizacji docelowej, w której znajdują się typy komórek docelowych. Wybierz zdrowo wyglądającą komórkę do nagrywania z użyciem zacisku krosowego. Po zidentyfikowaniu zdrowej komórki umieść pipetę rejestrującą w uchwycie na pipety i przesuń pipetę do przygotowania plastrów.

Gdy znajdzie się w pobliżu miejsca przygotowania plastrów, znajdź końcówkę pipety pod mikroskopem. Gdy końcówka pipety będzie widoczna pod mikroskopem, przesuń końcówkę w dół w kierunku komórki docelowej. Następnie ustaw wzmacniacz i wyreguluj pipetę na picoamp 5 woltów na nanoamper. Uruchom dwa ciągłe impulsy elektryczne o napięciu około 5 miliwoltów i około 10 hercach i sprawdź rezystancję pipety.

Idealna rezystancja wynosi od 5 do 12 megaomów dla większości neuronów siatkówki. Gdy będziesz gotowy, użyj ustnika lub strzykawki, aby wydmuchać roztwór wewnętrzny, aż końcówka pipety znajdzie się na powierzchni komórki docelowej. Gdy nadciśnienie utworzy małe wgłębienie na powierzchni komórki, lekko przesuń końcówkę i przestań wydmuchiwać.

Jeśli rezystancja pipety stale rośnie, pozostaw ją i monitoruj rezystancję, aż osiągnie wartość większą niż 1 gigaom. Jeśli opór nie wzrasta spontanicznie, delikatnie zastosuj podciśnienie, aż stanie się gigasealem. Po osiągnięciu gigaseal zmień potencjał utrzymywania na minus 70 miliwoltów.

Następnie należy stosować okresowe podciśnienie, aby rozerwać membranę wewnątrz końcówki pipety. Po wykonaniu konfiguracji całej kuwety rezystancja pipety może wynosić od 500 megaomów do jednego gigaoma, a prąd pojemnościowy jest obserwowalny. Zapisz zależność I-V od minus 80 do 40 miliwoltów. W zależności od typu ogniwa aktywowane będą różne typy kanałów bramkowanych napięciem. Na koniec zarejestruj wywołane światłem prądy lub napięcia synaptyczne.