Name: Mikroskopia bez wychwytu laserowego do mikrodysekcji dyskretnych regionów mózgu myszy w celu całkowitej izolacji RNA oraz sekwencjonowania nowej generacji i profilowania ekspresji genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Poznaj metodę mikrodysekcji bez wychwytu laserowego do izolacji RNA z dyskretnych regionów mózgu myszy. Technika zapewnia powtarzalne pobieranie tkanek o wysokiej jakości do sekwencjonowania RNA i profilowania transkryptomu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana przez Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) oraz Army Research Office (ARO), numer grantu W911NF-10-1-006.

1. Konfiguracja i przygotowanie do pobierania próbek
<ol>
	<li>Uzupełnić zrównoważony roztwór soli Earle'a (EBSS) wodorowęglanem sodu (0,44 g na 100 mL EBSS) i glukozą (0,884 g na 100 mL EBSS)9. Potraktować EBSS odczynnikiem DEPC (0,1 mL na 100 mL EBSS) przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 37 °C w butelce lub kolbie autoklawowalnej z nakrętką.</li>
	<li>Umieścić szklane pipety Pasteura o długości 5 ¾" w zlewce szklanej o pojemności 1000 mL, a pędzle artystyczne, włosiem skierowanym do góry, w szklanym cylindrze miernym o pojemności 100 mL. Dodać odpowiednią ilość roztworu DEPC (0,1 mL na 100 mL ddH2O), aby przykryć odpowiednio pipety i pędzle. Przykryć zlewkę i cylinder mierny folią aluminiową i inkubować przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 12-godzinnej inkubacji z DEPC podgrzać wszystkie materiały traktowane DEPC do temperatury &gt;100 °C przez co najmniej 15 minut. Odstawić EBSS i schłodzić do temperatury pokojowej przed przechowywaniem w 4 °C. Odlać ddH2O ze zlewki i cylindra miernego; kontynuować inkubację w temperaturze &gt;100 °C aż do wyschnięcia materiałów. Wyjąć, schłodzić do temperatury pokojowej i przechowywać do późniejszego użycia.</li>
	<li>W dniu eksperymentu potraktować wszystkie powierzchnie robocze preparatem RNaseZap.</li>
	<li>Umieścić i utrzymywać EBSS w kąpieli wodnej ustawionej na 40 °C. Aby zbuforować i natlenić EBSS, przesycić go mieszanką 95%/5% O2/CO2, umieszczając rurkę doprowadzającą gaz w wolnej od RNaz pipecie Pasteura, a następnie wkładając pipetę do EBSS. Przykryć otwór pojemnika z EBSS.</li>
	<li>Przygotować mikrotom do tkanek Stoelting do sekwencyjnego krojenia tkanki mózgowej. Potraktować górną i dolną powierzchnię mikrotomu preparatem RNaseZap. Przymocować prostokątny kawałek papieru filtracyjnego Whatman #4 do pleksiglasowej powierzchni urządzenia. Przymocować dwustronne ostrze brzytwy do ramienia urządzenia. Ustawić mikrometr na zero i dostosować minimalną wysokość ramienia tak, aby ostrze brzytwy przecięło papier filtracyjny, ale nie płytkę pleksiglasową.</li>
	<li>Przygotować wszystkie dodatkowe materiały potrzebne do mikrodysekcji, w tym wolne od RNaz szalki do hodowli komórkowej 60x15 mm, wycinaki do tkanek Harris Uni-Core, wolne od RNaz końcówki do mikropipet 200 μL do przymocowania do rurek gazowych w celu natleniania koronalnych przekrojów mózgu podczas wycinania mikropróbek, zakrzywione nożyczki, suchy lód oraz probówki do zbierania tkanek. Umieścić probówki na suchym lodzie.</li>
</ol>
2. Usunięcie mózgu i przekroje wieńcowe
<ol>
	<li>Umieść mysz w DecapiCone i dokonaj dekapitacji za pomocą gilotyny dla gryzoni. Wyjmij głowę z DecapiCone i połóż ją na płaskiej powierzchni. Za pomocą skalpela roztnij skórę wzdłuż linii środkowej czaszki, zaczynając około 3 mm za nozdrzami w kierunku ogona. Odchyl płaty skóry na boki, aby odsłonić czaszkę i oczodoły.</li>
	<li>Za pomocą zakrzywionych nożyczek przetnij oba nerwy wzrokowe, odcinając je od oka. Otwórz jamę czaszki, ostrożnie łamiąc kości potyliczne i międzyparietalne oraz usuwając grzbietowe kości ciemieniowe i czołowe. Używając kleszczy do kości (rongeura), rozbij kości nosowe i łzowe, aby odsłonić opłaty węchowe. Użyj zakrzywionych nożyczek, aby odciąć opłaty węchowe od przedniej części mózgu. Usuń cały mózg z nienaruszoną częścią tylną. Umieść mózg w górnej części wolnego od RNazy naczynia do hodowli komórkowej Cellstar o rozmiarze 60 x 15 mm. Przenieś naczynie na powierzchnię roboczą do pobierania próbek tkanki.</li>
	<li>Używając pipety wolnej od RNaz, ostrożnie zwilż papier filtracyjny przymocowany do przecinarki do tkanek za pomocą EBSS. Zwilż tkankę mózgu roztworem EBSS.</li>
	<li>Przenieś mózg na przecinarkę do tkanek i ustaw go w odpowiedniej orientacji. Uwaga: Mózg powinien być ułożony powierzchnią brzuszną na papierze filtracyjnym. Linia środkowa (szczelina międzyhemisferyczna) powinna być prostopadła do ostrza przecinarki, a przednia krawędź mózgu powinna przylegać do ostrza.</li>
	<li>Użyj pędzla artystycznego potraktowanego DEPC, aby unieruchomić mózg, wywierając lekki nacisk na jego powierzchnię grzbietową. Trzymając mózg nieruchomo, podnieś dźwignię uchwytu ostrza na wysokość około 4-5 cm nad powierzchnią tkanki i utrzymuj ją w tej pozycji. Usuń pędzel z powierzchni mózgu i ustaw wartość 750 μm za pomocą mikrometru. Puść dźwignię, aby przeciąć tkankę i utworzyć koronalny przekrój o grubości 750 μm.</li>
	<li>Podczas gdy ostrze przecinarki pozostaje w miejscu, użyj pędzla artystycznego w ruchu obrotowym, aby delikatnie odsunąć przekrój tkanki od powierzchni ostrza. Natychmiast umieść przekrój tkanki w natlenionym EBSS w szalce Petriego. Drugi badacz może rozpocząć od kroku 3.1.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 2.5 i 2.6, aż do uzyskania seryjnych przekrojów mózgu w całej płaszczyźnie przednio-tylnej.</li>
</ol>
3. Mikrodyssekcja obszarów mózgu
<ol>
	<li>Dostosuj oświetlenie, aby zapewnić, że iluminacja próbki nie zostanie zakłócona podczas mikrosekcji tkanki. Dostosuj położenie i przepływ mieszaniny 95%/5% O2/CO2, aby utrzymać buforowane i natlenione środowisko dla tkanki podczas mikrosekcji.</li>
	<li>Zidentyfikuj koronalny przekrój mózgu zawierający obszar zainteresowania. Używając pędzla artystycznego, ułóż przekrój mózgu płasko na dnie szalki Petriego. Wybierz wycinak do tkanek o odpowiedniej średnicy na podstawie Tabeli 1 lub innych źródeł. Przytrzymując koronalny przekrój tkanki pędzlem, opuść ostrze wycinaka nad powierzchnię przekroju tkanki.</li>
	<li>Wywierając nacisk, przebij końcówką wycinaka przekrój tkanki, dociskając go mocno do dna szalki Petriego. Wykonaj kolisty ruch obrotowy, aby upewnić się, że obszar zainteresowania został oddzielony od otaczającej go tkanki. Ostrożnie unieś wycinak z przekroju tkanki i uwolnij mikrowycinek, pozwalając mu unosić się w EBSS.</li>
	<li>Używając pędzla artystycznego, niezwłocznie przenieś mikrowycinek tkanki do probówki do przechowywania w temperaturze -80 °C, umieszczonej na suchym lodzie. Tkanka powinna łatwo przywrzeć do ścianki probówki. Włóż probówkę z mikropróbką z powrotem na suchy lód.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.2 – 3.4 dla każdego obszaru mózgu zainteresowania.</li>
</ol>
4. Archiwizacja tkanek
<ol>
	<li>Po zakończeniu mikrodysekcji należy użyć systemu skanującego VisionMate do zarejestrowania odpowiednich kodów kreskowych dla każdej probówki TrakMates zawierającej próbkę. Po zapełnieniu 96-miejscowego statywu na probówki TrakMates należy szybko zeskanować statyw i niezwłocznie umieścić próbki tkanek w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja całkowitego RNA
<ol>
	<li>Przygotować wolną od RNaz przestrzeń roboczą przy użyciu RNaseZap. Przygotować odpowiednią ilość mieszaniny kulek magnetycznych (Bead Mix) oraz roztworu do lizy i wiązania (Lysis/Binding Solution) zgodnie z opisem w protokole izolacji całkowitego RNA MagMAX-96 Total RNA Isolation Protocol10.</li>
	<li>Wyjąć próbki tkanek z zamrażarki -80 °C i umieścić probówki bezpośrednio na suchym lodzie.</li>
	<li>Do probówki TrakMates zawierającej próbkę dodać 100 μL roztworu Lysis/Binding Solution. Do miksera do homogenizacji przymocować tłuczek dopasowany do probówek o pojemności 0,5 ml, wolny od nukleaz, i zhomogenizować tkankę. Za pomocą niskoretencyjnego końcówki do pipety wolnej od nukleaz przenieść zhomogenizowaną próbkę do dołka okrągłodنnej płytki hodowlanej 96-dołkowej. Bezzwłocznie dodać do próbki 60 μL 100% izopropanolu, używając niskoretencyjnej końcówki do pipety wolnej od nukleaz, i wymieszać, pipetując w górę i w dół 3-4 razy.</li>
	<li>Do próbki dodać 20 μL Bead Mix za pomocą niskoretencyjnej końcówki do pipety wolnej od nukleaz. Wymieszać, pipetując w górę i w dół 3-4 razy.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 5.3-5.4 dla wszystkich próbek tkanek.</li>
	<li>Postępować zgodnie z krokami protokołu MagMAX-96 Total RNA Isolation Protocol, zaczynając od punktu III.A.2, aby zakończyć ekstrakcję całkowitego RNA. UWAGA: W sprzedaży dostępne są inne zestawy do izolacji całkowitego RNA oparte na kuleczkach magnetycznych, jednak nie zostały one przebadane w niniejszym badaniu. W celu uzyskania szczegółowych informacji na temat izolacji całkowitego RNA przy użyciu odpowiednich produktów należy zapoznać się z instrukcjami producenta danego zestawu.</li>
	<li>Zmierzyć czystość i stężenie otrzymanego całkowitego RNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop 3300 lub innych technologii spektrofotometrycznych/fluorometrycznych do małych objętości.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Region mózgu/jądro</td>
			<td>Średnica wycinaka do tkanek (mm)</td>
			<td>Całkowity RNA (ng/μL)</td>
			<td>Stosunek 260/280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kora czołowa</td>
			<td>2.0</td>
			<td>27.03</td>
			<td>1.99</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jądro półkoliste</td>
			<td>1.0</td>
			<td>6.26</td>
			<td>2.77</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prążkowie</td>
			<td>1.5</td>
			<td>27.94</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kora obręczy</td>
			<td>1.5</td>
			<td>29.05</td>
			<td>2.07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podwzgórzem - jądro przykomorowe / jądro nadskrzyżowaniowe (PVN/SCN)</td>
			<td>2.0</td>
			<td>40.34</td>
			<td>2.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wzgórze</td>
			<td>2.0</td>
			<td>34.40</td>
			<td>2.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podwzgórze – jądro grzbietowo-przyśrodkowe / jądro brzuszno-przyśrodkowe (DMH/VMH)</td>
			<td>2.0</td>
			<td>44.83</td>
			<td>2.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciało migdałowate</td>
			<td>1.0</td>
			<td>10.06</td>
			<td>1.89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hipokamp - Ca 2/3</td>
			<td>1.5</td>
			<td>7.31</td>
			<td>2.32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hipokamp – obszar CA1/zakręt zębaty</td>
			<td>1.5</td>
			<td>5.20</td>
			<td>2.24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szara substancja okołowodociągowa</td>
			<td>1.0</td>
			<td>48.21</td>
			<td>2.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jądro raphe grzbietowe</td>
			<td>1.0</td>
			<td>6.56</td>
			<td>2.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formacja siateczkowata</td>
			<td>2.0</td>
			<td>35.35</td>
			<td>2.27</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Wykaz mikrodyssekowanych obszarów mózgu myszy wraz z odpowiednimi optymalnymi średnicami wycinaków do tkanek, reprezentatywną wydajnością i czystością całkowitego RNA. 13 mikrodyssekowanych obszarów mózgu, wymienionych w kolejności od przedniej do tylnej, różni się wielkością i orientacją. Mikrowykrawacz PVN/SCN obejmuje przednio-przyśrodkowe jądro przykomorowe, części jądra okołokomorowego, strefę podprzykomorową oraz inne neurony parvocellularne. Mikrowykrawacz wzgórza obejmuje przednie jądra wzgórza znajdujące się w tej samej płaszczyźnie wieńcowej co obszar mikrowykrawacza PVN/SCN. Mikrowykrawacz DMH/VMH obejmuje dodatkowe jądra magnocellularne oraz inne neurony parvocellularne znajdujące się pomiędzy jądrem grzbietowo-przyśrodkowym a jądrem brzuszno-przyśrodkowym. Próbka ciała migdałowatego obejmuje zarówno podregion centralny, jak i boczno-podstawny. Wydajność RNA oraz stosunki 260/280 są pojedynczymi wartościami uzyskanymi z odpowiednich próbek mikrodyssekcji, aby zaprezentować odczyty otrzymane z każdego obszaru mózgu.

<ol><li>Pickrell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+mechanisms+underlying+human+gene+expression+variation+with+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing.</a> Nature. 464, 768-772 (2010).</li>
<li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).</li>
<li>Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+method+for+comprehensive+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).</li>
<li>Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+small+RNAs+with+big+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: small RNAs with big effects.</a> Transplantation. 90, 105-112 (2010).</li>
<li>Forrest, A. R., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA.+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole genome transcriptome analysis.</a> RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).</li>
<li>Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+transcriptome+sequencing+reveals+gene+expression+and+splicing+differences+in+brain+regions+affected+by+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease.</a> PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).</li>
<li>Paulsen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+individual+hypothalamic+nuclei+from+single+animals+using+laser+capture+microdissection+and+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays.</a> J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).</li>
<li>Winrow, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+anatomical+isolation+of+functional+sleep+circuits+exhibits+distinctive+regional+and+circadian+gene+transcriptional+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles.</a> Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).</li>
<li>Atkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+integration+of+glutamatergic+signals+by+little+SAAS+in+novel+suprachiasmatic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits.</a> PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).</li>
<li>Technologies, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTechnologies%2C+L+%22MagMAX-96+Total+RNA+Isolation+Kit+Instruction+Manual%22">MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual</a>. , Forthcoming.</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym protokole istnieje wiele krytycznych etapów, które wymagają szczególnej uwagi i rozważenia. W celu usunięcia każdego z obszarów zainteresowania należy dobrać odpowiednią średnicę biopsyjnika do tkanek. Choć średnice biopsyjników przedstawione w Tabeli 1 są odpowiednie do pobierania wymienionych obszarów mózgu, każdy badacz powinien dobrać biopsyjnik o rozmiarze zapewniającym optymalne pobranie odpowiednich tkanek. Po drugie, grubość przekrojów czołowych podana w tej metodzie (750 μm) została określona doświa...

<table><tbody><tr><td>łaźnia wodna Isotemp 102</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-3Q</td><td></td></tr><tr><td>RNase Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9782</td><td></td></tr><tr><td>Rotator laboratoryjny (mieszalnik orbitalny)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>2314 &amp;#8211;- 1CEQ</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik do pelletowania</td><td>VWR international</td><td>47747-370</td><td></td></tr><tr><td>pestle 0,5 ml wolny od RNaz</td><td>VWR international</td><td>KT749521-0590</td><td>wolny od nukleaz</td></tr><tr><td>piroseczniarz etylowy (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki dwukrawędziowe</td><td>Stoelting Co.</td><td>51427</td><td></td></tr><tr><td>St&amp;#8211;stykowa slicer do tkanek z manualnym mikrometrem</td><td>Stoelting Co.</td><td>51425</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel okrągły 2/0&amp;rsquo;szczoteczka</td><td>Pędzel Princeton Art</td><td>4350R</td><td></td></tr><tr><td>biopsyjnik tkankowy Harris Uni-Core (0,75 mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15072</td><td></td></tr><tr><td>igła do biopsji rdzeniowej Harris Uni-Core (1,0 mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15099</td><td></td></tr><tr><td>biopsja igłowa Harris Uni-Core (1,5 mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15075</td><td></td></tr><tr><td>biopsja igłowa Harris Uni-Core (2,0 mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15076</td><td></td></tr><tr><td>Gilotyna</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>RG-100</td><td></td></tr><tr><td>DecapiCones</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MDC-200</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Earle&amp;rsquo;zrównoważony roztwór soli (EBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30029.02</td><td></td></tr><tr><td>pipety 25 ml</td><td>Corning</td><td>4489</td><td>wolny od nukleaz</td></tr><tr><td>końcówki do pipet epT.I.P.S. LoRetention Dualfilter, 20 µl &amp;mdash; 300 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>0030 077.636</td><td></td></tr><tr><td>Probówki TrakMates z zakrętkami i nakrętkami</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>3741</td><td></td></tr><tr><td>bezprzewodowy czytnik kodów 2D VisionMate</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>3122MTX</td><td></td></tr><tr><td>czytnik kodów 2D VisionMate SR do pojedynczego regału</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>3115</td><td></td></tr><tr><td>1-200 &amp;mu;uniwersalne końcówki do pipet L</td><td>Corning</td><td>4864</td><td>wolne od nukleaz</td></tr><tr><td>naczynia do hodowli komórkowych Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td>wolny od nukleaz</td></tr><tr><td>96-dołkowa polistyrenowa płytka do hodowli komórkowych Cellstar firmy Greiner Bio-One, dno w kształcie litery U</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>5665-0180</td><td>wolny od nukleaz</td></tr><tr><td>#4 Papier filtracyjny</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1004 150</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowy gruszkowy zapobiegacz zasysania do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-102A</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego rna oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Jako platformy technologiczne, podejścia takie jak sekwencjonowanie następnej generacji, mikromacierze oraz qRT-PCR dają duże nadzieje na poszerzenie naszej wiedzy na temat zakresu regulacji molekularnej. Nowsze metody, takie jak wysokorozdzielcze sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq)1, dostarczają nowych i obszernych informacji o ekspresji specyficznej dla tkanek lub stanów, takich jak względne poziomy transkryptów, alternatywny splicing oraz mikroRNA2-4. Perspektywy zastosowania metody RNA-Seq w porównawczym profilowaniu całego transkryptomu5 w obrębie poszczególnych tkanek lub pomiędzy osobnikami o odmiennych fenotypach otwierają nowe możliwości wyjaśnienia mechanizmów molekularnych uczestniczących zarówno w prawidłowych, jak i patologicznych stanach fizjologicznych. Niedawno przeprowadzono profilowanie całego transkryptomu w tkance mózgu człowieka, identyfikując różnice w ekspresji genów powiązane z progresją choroby6. Jednak zastosowanie sekwencjonowania następnej generacji nie zostało jeszcze w pełni zintegrowane z badaniami nad ssakami.
Badania ekspresji genów w modelach mysich wykazały odmienne profile w różnych jądrach mózgu przy zastosowaniu mikroskopii z przechwytywaniem laserowym (LCM) do wycinania próbek7,8. Chociaż LCM umożliwia pobieranie próbek z precyzją na poziomie pojedynczych komórek i dyskretnych obszarów mózgu, stosunkowo niska całkowita wydajność RNA uzyskiwana tą metodą może być ograniczająca dla RNA-Seq i innych metod profilowania w tkankach mózgu myszy, co może wymagać zastosowania suboptymalnych etapów amplifikacji próbek. W niniejszym protokole przedstawiono metodę mikrodyssekcji i ekstrakcji całkowitego RNA z dyskretnych obszarów mózgu myszy. Do wyizolowania 13 tkanek z seryjnych przekrojów coronalnych o grubości 750-μm z pojedynczego mózgu myszy zastosowano wycinaki tkankowe o określonej średnicy. Próbki pobrane metodą mikropunching zostają natychmiast zamrożone i zarchiwizowane. Całkowite RNA otrzymuje się z próbek przy użyciu technologii izolacji całkowitego RNA opartej na kuleczkach magnetycznych. Uzyskane próbki RNA charakteryzują się wydajnością i jakością odpowiednią do dalszego profilowania ekspresji. Ta strategia mikrodyssekcji stanowi realną alternatywę dla istniejących strategii pobierania próbek w celu uzyskania całkowitego RNA z dyskretnych obszarów mózgu, otwierając możliwości dla nowych odkryć w zakresie ekspresji genów.

Profilowanie ekspresji RNA w oddzielnych regionach mózgu myszy wymaga precyzyjnej i powtarzalnej strategii pobierania tkanek. W niniejszym opracowaniu opisano protokół wykorzystujący zarówno sekcjonowanie mózgu w płaszczyźnie czołowej, jak i mikrodysekcję wspomaganą wycinakiem do tkanek. Wydajność i jakość całkowitego RNA uzyskanego z otrzymanych próbek potwierdzają użyteczność przedstawionej metody.

Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Jako platformy technologiczne, podejścia takie jak sekwencjonowanie nowej generacji, mikromacierze oraz qRT-PCR dają duże nadzieje na poszerzenie naszej wiedzy na temat...

Ogólnym celem tej procedury jest izolacja całkowitego RNA z poszczególnych jąder mózgu w sposób powtarzalny, spójny, kosztowo efektywny i wolny od zanieczyszczeń RNazami. Cel ten osiąga się poprzez przygotowanie środowiska pracy wolnego od RNaz, a następnie wyjęcie całego mózgu z od decapitated myszy. Następnie, przy użyciu mikrometrycznego sekcjomierza do tkanek, wykonuje się seryjne przekroje tkankowe o jednolitej wielkości.Następnie interesujące obszary mózgu poddaje się mikrosekcji przy użyciu rdzeni tkankowych o określonej średnicy, utrzymując tkankę w środowisku medium wolnym od RNA. Na koniec z wyciętych jąder mózgowia izoluje się całkowite RNA. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące wystarczającą wydajność i jakość całkowitego RNA do dalszego przygotowania biblioteki cDNA oraz profilowania transkryptomu za pomocą analiz spektrofotometrycznych lub fluorometrycznych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak makroskopowa anatomia lub wycinanie obszarów mózgu wspomagane mikroskopią laserową (laser capture microscopy), jest możliwość powtarzalnego i ekonomicznego pobrania wielu oddzielnych obszarów mózgu z jednego mózgu myszy. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, na przykład czy odmienne profile ekspresji transkrypcyjnej w obszarach mózgu powiązanych z określonymi obwodami neuronalnymi mogą korelować z konkretnymi cechami behawioralnymi, odpowiedziami na czynniki środowiskowe lub stanem chorobowym. Aby przygotować się do mikrodyssekcji, do 100 ml zrównoważonego roztworu soli Earla (EBSS) należy dodać 0,44 g wodorowęglanu sodu oraz 0,884 g glukozy.Potraktuj EBSS 0,1 mililitrów DEPC w autoklawowalnej butelce lub kolbie z nakrętką przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 37°C. Umieść szklane pipety o długości pięciu i trzy czwarte cala w jednolitrowym zlewce szklanym, a pędzle artystyczne z włosiem skierowanym do góry umieść w szklanym cylindrze miernym o pojemności 100 mililitrów.Dodać odpowiednią ilość wody traktowanej DEPC, aby przykryć pipety i pędzle. Przykryć zlew i cylinder miarkowy folią aluminiową i inkubować przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 37 °C. Po 12-godzinnej inkubacji z DEPC poddać wszystkie materiały traktowane DEPC działaniu temperatury powyżej 100 °C przez co najmniej 15 minut. Schłodzić EBSS do temperatury pokojowej przed przechowywaniem w temperaturze 4 °C.Wylej DD H2O z zlewki i cylindra miernego, a następnie kontynuuj inkubację w temperaturze powyżej 100 °C aż do całkowitego wyschnięcia materiałów. Wyjmij je z inkubatora, ostudź do temperatury pokojowej i przechowuj do późniejszego użycia. W dniu eksperymentu oczyść wszystkie powierzchnie robocze w celu usunięcia kontaminacji RNA, a EBSS umieść i utrzymuj w kąpieli wodnej ustawionej na 40 °C w celu buforowania i natlenienia.Roztwór EBSS nasyca się 5% CO2 i 95% tlenem, umieszczając rurkę gazową w pipecie Pasteura wolnej od RNA. Po włożeniu pipety do EBSS należy zakryć otwór pojemnika z EBSS. Następnie należy przygotować slicer do seryjnego cięcia tkanki mózgowej.Przetrzyj górną i dolną powierzchnię urządzenia do krojenia tkanek. Aby usunąć zanieczyszczenia RNA, przymocuj prostokątny kawałek papieru filtrującego Watman nr 4 do pleksiglasowej powierzchni urządzenia. Przymocuj dwukrawędziową żyletkę do ramienia urządzenia.Ustaw mikrometr na zero i dostosuj minimalną wysokość ramienia siekacza tak, aby żyletka przecięła papier filtracyjny, ale nie płytkę z pleksiglasu. Przygotuj wszystkie dodatkowe materiały niezbędne do mikrodysekcji, w tym wolne od RNA szalki hodowlane o wymiarach 60 by 15 milimetrów, 200 µL końcówki do mikropipet wolne od RNA, zakrzywione nożyczki, suchy lód oraz probówki do pobierania tkanek. Umieść probówki na suchym lodzie po zdekapitowaniu myszy za pomocą gilotyny dla gryzoni i usunięciu całego mózgu z nienaruszonymi nerwami wzrokowymi oraz strukturami rombencefalu.Umieść mózg w górnej części sterylnej szalki hodowlanej do komórek o wymiarach 60 na 15 mm, wolnej od RNaz. Następnie przenieś ją na powierzchnię roboczą do pobierania próbek tkanek. Używając pipety wolnej od RNaz, ostrożnie zwilż papier filtracyjny przymocowany do rozdrabniacza tkanek roztworem EBSS.Nawilż tkankę mózgu roztworem EBSS. Przenieś mózg do przecinarki tkankowej i ułóż go tak, aby powierzchnia brzuszna spoczywała na papierze filtracyjnym. Linia środkowa powinna być prostopadła do ostrza przecinarki, a krawędź rostralna mózgu powinna przylegać do ostrza.Użyj pędzla artystycznego potraktowanego A-D-E-P-C, aby unieruchomić mózg, przykładając delikatny nacisk do jego powierzchni grzbietowej. Podnieś dźwignię uchwytu ostrza na wysokość około czterech do pięciu centymetrów nad powierzchnią tkanki grzbietowej i utrzymaj ją w tej pozycji. Zdejmij pędzel z powierzchni mózgu i ustaw wartość 750 micrometers.Użycie mikrometru. Należy opuścić dźwignię, aby przeciąć tkankę i utworzyć 750 µm przekrój czołowy, podczas gdy ostrze sekcjomatu pozostaje w spoczynku. Przy użyciu pędzla artystycznego, wykonując ruch obrotowy, należy delikatnie odsunąć przekrój tkanki od powierzchni ostrza.Natychmiast umieść przekrój tkanki w natlenionym EBSS w szalce Petriego. Przekrój ten jest teraz gotowy do mikrodysekcji. Powtarzaj procedurę krojenia, aż do uzyskania seryjnych przekrojów mózgu w całej płaszczyźnie rostralno-kaudalnej w celu przeprowadzenia mikrodysekcji.Najpierw należy sprawdzić oświetlenie, aby upewnić się, że iluminacja próbki nie będzie utrudniona. Dostosuj położenie i przepływ mieszaniny O2 i CO2, aby utrzymać buforowane, natlenione środowisko dla tkanki. W trakcie procedury zidentyfikuj coronalny przekrój mózgu zawierający badany obszar i za pomocą pędzla artystycznego ułóż go płasko na dnie szalki Petriego.Wybierz wycinak do tkanek o odpowiedniej średnicy. Przytrzymaj koronalny przekrój tkanki za pomocą pędzla artystycznego i opuść ostrze wycinaka na powierzchnię przekroju. Wywierając nacisk, przebij końcówką wycinaka przekrój tkanki, dociskając go mocno do dna szalki Petriego.Stosując kolisty ruch toczenia, upewnij się, że obszar zainteresowania został oddzielony od otaczającej tkanki. Ostrożnie unieś rdzeń tkanki z przekroju i uwolnij mikro-wycinek, pozwalając mu swobodnie pływać w EBSS, używając do tego pędzla artystycznego. Natychmiast przenieś mikro-wycinek tkanki do probówki do stabilnego przechowywania w temperaturze -80 °C, umieszczonej na suchym lodzie.Tkanka powinna łatwo przylegać do ścianki probówki. Przenieś probówkę zawierającą próbkę mikrodysekcyjną z powrotem do suchego lodu. Powtórz tę mikrodysekcję dla każdego interesującego obszaru mózgu.Po zakończeniu mikrodysekcji zapisz odpowiednią etykietę lub kody kreskowe dla każdej probówki zawierającej próbkę. Umieść próbki tkanek w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA z próbek tkankowych. W pierwszej kolejności przygotuj wolną od RNA przestrzeń roboczą.Przygotować odpowiednią ilość mieszaniny kulek magnetycznych oraz roztworu wiążąco-lizującego zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu do izolacji całkowitego RNA. Wyjąć próbki tkanek z zamrażarki ustawionej na -80 °C i umieścić probówki bezpośrednio na suchym lodzie. Do probówki z próbką dodać 100 µL roztworu wiążąco-lizującego.Do mieszalnika do peletów przymocuj tłuczek dopasowany do probówek o pojemności 0,5 ml i zhomogenizuj tkankę, używając końcówki do pipety wolnej od nukleaz o niskiej retencji. Natychmiast przenieś zhomogenizowaną próbkę do dołka okrągłego 96-dołkowego płytki do hodowli tkankowej, używając tego samego typu końcówki. Do próbki dodaj 60 µL 100% izopropanolu.Dodaj 20 µL mieszaniny kulek do próbki i wymieszaj, pipetując ciecz w górę i w dół trzy do czterech razy. Postępuj zgodnie z krokami protokołu zestawu do izolacji całkowitego RNA, aby zakończyć ekstrakcję całkowitego RNA. Na koniec zmierz czystość i stężenie otrzymanego całkowitego RNA. Dane dotyczące całkowitego RNA z mikrobiopsji różnych obszarów mózgu przedstawiono w tej tabeli.Próbki RNA eluowane 30 µL buforu do elucji dostarczyły wystarczającą ilość całkowitego RNA do zastosowania z komercyjnie dostępnymi zestawami do przygotowania cDNA do sekwencjonowania RNA. Ponadto wydajność RNA oraz wartości stosunku 260 do 280 są pojedynczymi wartościami uzyskanymi z odpowiednich próbek po mikrodissekcji, aby zademonstrować odczyty z każdego regionu mózgu, co potwierdza wysoką czystość próbek. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje od 8 do 10 minut. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zminimalizowanie ryzyka kontaminacji RNA powierzchni roboczych lub próbek tkanek poprzez stosowanie wyłącznie materiałów wolnych od RNazy lub traktowanych DEPC.

non-laser-capture-microscopy-approach-for-microdissection-discrete

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mikroskopia bez wychwytu laserowego do mikrodysekcji dyskretnych regionów mózgu myszy w celu całkowitej izolacji RNA oraz sekwencjonowania nowej generacji i profilowania ekspresji genów

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji pojedynczych lub wielu neuronów dopaminergicznych (da) Drosophila z larw trzeciego stadium za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM) w klasie przechwytywania podczerwienią (IR). RNA uzyskane z wyizolowanych neuronów może być łatwo wykorzystane w dalszych zastosowaniach, w tym w analizach qRT-PCR lub mikromacierzach.

Mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych Drosophila

Opisujemy, jak korzystać z mikrodysekcji laserowej (LCM) w celu uzyskania wzbogaconych populacji neuronów hipokampa lub pojedynczych neuronów z zamrożonych fragmentów uszkodzonego mózgu szczura do późniejszej analizy ekspresji genów przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i/lub mikromacierzy całego genomu.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu

Wysokiej jakości całkowite RNA zostało przygotowane z ciał komórkowych mysich neuronów ruchowych rdzenia kręgowego za pomocą laserowej mikrodysekcji po zabarwieniu odcinków rdzenia kręgowego Azure B w 70% etanolu. Wystarczająca ilość RNA (~40-60 ng) jest odzyskiwana z 3 000-4 000 neuronów ruchowych, aby umożliwić dalszą analizę RNA za pomocą sekwencji RNA i qRT-PCR.

Produkcja RNA do analizy transkryptomicznej z ciał komórek neuronów ruchowych rdzenia kręgowego myszy za pomocą mikrodysekcji wychwytywania laserowego

Analiza ekspresji genów w podzbiorze komórek w określonej tkance stanowi duże wyzwanie. W tym artykule opisano, jak wyizolować wysokiej jakości całkowite RNA z określonej populacji komórek, łącząc metodę szybkiego znakowania immunologicznego z mikrodysekcją wychwytu laserowego.

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

Protokół mikrodysekcji laserowej (LCM) został opracowany w celu uzyskania wystarczającej ilości wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów w komórkach kostnych. Obecne badanie koncentruje się na mysich odcinkach kości udowej. Jednak opisany tutaj protokół LCM może być wykorzystany do badania ekspresji genów w komórkach dowolnej tkanki twardej.

Protokół mikrodysekcji z wychwytem laserowym, który zapewnia wysokiej jakości RNA ze świeżo zamrożonych kości myszy

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Ta procedura opisuje zbieranie dyskretnie zamrożonych obszarów mózgu w celu uzyskania wysokiej jakości białka i RNA przy użyciu tanich i powszechnie dostępnych narzędzi.

Gromadzenie zamrożonych obszarów mózgu gryzoni do dalszych analiz

Ten protokół opisuje mikrodysekcję laserową do izolacji chrząstki i kości ze świeżo zamrożonych fragmentów zarodka myszy. Chrząstka i kość mogą być szybko uwidocznione przez barwienie fioletem krezylo i precyzyjnie zebrane w celu uzyskania wysokiej jakości RNA do analizy transkryptomicznej.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki embrionalnej i kości myszy w celu analizy ekspresji genów

Przedstawiamy praktyczny, krok po kroku, szybki protokół usuwania mózgu myszy i preparowania dyskretnych obszarów z świeżej tkanki mózgowej. Pozyskiwanie regionów mózgu do analizy molekularnej stało się rutyną w wielu laboratoriach neurobiologicznych. Te obszary mózgu są natychmiast zamrażane w celu uzyskania wysokiej jakości danych transkryptomicznych do analizy na poziomie systemu.

Mikrodysekcja mózgu myszy na funkcjonalnie i anatomicznie różne regiony

Opisano protokół, który wykorzystuje laserową mikrodysekcję do izolowania pojedynczych tkanek nicieni do sekwencjonowania RNA. Protokół nie wymaga zestawów narzędzi genetycznych specyficznych dla danego gatunku, co pozwala na porównywanie profili ekspresji genów między różnymi gatunkami na poziomie próbek jednotkankowych.

Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

Protokół ten opisuje metodę izolowania RNA z określonych histologicznych obszarów tkanki wątroby myszy z unieruchomioną o Optymalnej Temperaturze Cięcia z zastosowaniem złożonego tkanki wątroby za pomocą mikrosekcji laserowej, umożliwiającej ukierunkowaną analizę ekspresji genów w dalszej fazie.

Mikroskop laserowego przechwytywania tkanki wątroby myszy utrwalonej paraformaldehydem do analizy RNA

Poznaj metodę mikrodysekcji bez wychwytu laserowego do izolacji RNA z dyskretnych regionów mózgu myszy. Technika zapewnia powtarzalne pobieranie tkanek o wysokiej jakości do sekwencjonowania RNA i profilowania transkryptomu.

Mikroskopia bez wychwytu laserowego do mikrodysekcji dyskretnych regionów mózgu myszy w celu całkowitej izolacji RNA oraz sekwencjonowania nowej generacji i profilowania ekspresji genów (Wideo) | JoVE Journal

Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Przeglądaj więcej filmów