Mikroskopia bez wychwytu laserowego do mikrodysekcji dyskretnych regionów mózgu myszy w celu całkowitej izolacji RNA oraz sekwencjonowania nowej generacji i profilowania ekspresji genów
13 listopada 2011
Profilowanie ekspresji RNA w dyskretnych regionach mózgu myszy wymaga precyzyjnej i powtarzalnej strategii pobierania tkanek. Opisany jest tutaj protokół, który wykorzystuje zarówno koronalne cięcie mózgu, jak i mikrodysekcję wspomaganą rdzeniem tkankowym. Wydajność i jakość całkowitego RNA uzyskanego z otrzymanych próbek potwierdza użyteczność przedstawionej metody.
Ogólnym celem tej procedury jest zebranie całkowitego RNA z dyskretnych jąder mózgu w sposób powtarzalny, spójny, efektywny kosztowo i wolny od RNA. Osiąga się to poprzez przygotowanie środowiska pracy wolnego od RN i usunięcie całego mózgu z odciętej myszy. Następnie za pomocą mikrometrycznego rozdrabniacza tkanek wycina się seryjne odcinki tkanek o jednolitych rozmiarach.
Następnie obszary mózgu będące przedmiotem zainteresowania są mikropreparowane przy użyciu rdzenia tkankowego o ustalonej średnicy, utrzymując tkankę w środowisku wolnym od RNA. Na koniec całkowity RNA jest izolowany z wyciętych jąder mózgu. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na wystarczającą całkowitą wydajność i jakość RNA do przygotowania biblioteki CDNA i profilowania transkryptomu za pomocą testów widmowych, fotometrycznych lub fluorometrycznych.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wycinanie obszarów mózgu wspomagane mikroskopią anatomiczną lub laserową, jest to, że z pojedynczego mózgu myszy można pobrać wiele dyskretnych obszarów mózgu w sposób powtarzalny i wystarczający kosztowo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak to, czy odrębne profile ekspresji transkryptu w regionach mózgu związanych z brakiem obwodów neuronalnych mogą być skorelowane z pewnymi cechami behawioralnymi, reakcjami środowiskowymi i/lub stanem chorobowym. Aby przygotować się do mikrodysekcji, uzupełnij 100 mililitrów zbilansowanego roztworu soli Earla lub EBSS 0,44 grama wodorowęglanu sodu i 0,884 grama glukozy.
Traktuj EBSS 0,1 mililitra DEPC w autoklawowalnej butelce lub kolbie z zakrętką przez co najmniej 12 godzin. W 37 stopniach Celsjusza. Umieść szklane pipety o średnicy pięciu i trzech czwartych cala w litrowej szklanej zlewce i umieść pędzle artystyczne z włosiem skierowanym do góry w szklanym cylindrze z podziałką o pojemności 100 mililitrów.
Dodaj wystarczającą ilość roztworu wody uzdatnionej DEPC, aby przykryć pipety i szczoteczki. Przykryć zlewkę i cylinder z podziałką folią aluminiową i inkubować przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza po 12-godzinnej inkubacji z DEPC, podgrzać, a wszystkie materiały poddane działaniu DEPC do temperatury wyższej niż 100 stopni Celsjusza przez co najmniej 15 minut. Chłodny. EBSS w temperaturze pokojowej przed przechowywaniem w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Wylać DD H2O ze zlewki i cylindra miarowego i kontynuować inkubację w temperaturze powyżej 100 stopni Celsjusza, aż materiały wyschną. Wyjmij je z inkubatora, schłodzić do temperatury pokojowej i przechowuj do późniejszego wykorzystania. W dniu eksperymentu należy poddać wszystkie powierzchnie robocze działaniu w celu usunięcia zanieczyszczenia RNA i utrzymać EBSS w łaźni wodnej ustawionej na 40 stopni Celsjusza w celu buforowania i natleniania.
EBSS infiltruje go 5% CO2 i 95% tlenu, umieszczając rurkę gazową w pipecie do pastwiska bez RNA. A włożenie pipety do EBSS zasłania otwór pojemnika EBSS. Skonfiguruj krajalnicę do tkanek do seryjnego cięcia tkanki mózgowej.
Zabezpiecz górną i dolną powierzchnię krajalnicy do tkanek. Aby usunąć zanieczyszczenie RNA, przymocuj prostokątny kawałek watmana numer cztery, bibułę filtracyjną do powierzchni pleksi rozdrabniacza tkanek. Przymocuj obosieczną żyletkę do ramienia rozdrabniacza.
Ustaw mikrometr na zero i wyreguluj minimalną wysokość ramienia rozdrabniacza, aby żyletka mogła przeciąć bibułę filtracyjną, ale nie płytkę z pleksi. Zbierz wszystkie dodatkowe materiały potrzebne do mikropreparacji, w tym naczynia do hodowli komórkowych bez RNA o wymiarach 60 na 15 milimetrów, końcówki do mikropipet o pojemności 200 mikrolitrów bez RNA, zakrzywione nożyczki, suchy lód i probówki do pobierania tkanek. Umieść rurki na suchym lodzie po odcięciu głowy myszy za pomocą gilotyny dla gryzoni i usunięciu całego mózgu z nienaruszonym tyłem zarówno tylnego mózgu, jak i nerwów wzrokowych.
Umieść mózg w górnej części naczynia do hodowli komórkowej o wymiarach 60 na 15 milimetrów wolnych od RNA. Następnie przenieś go na powierzchnię roboczą do pobierania próbek tkanek. Użyj pipety bez RNA, aby zachowawczo zwilżyć bibułę filtracyjną dołączoną do rozdrabniacza tkanek za pomocą EBSS.
Zwilż tkankę mózgową za pomocą EBSS. Przenieś mózg do rozdrabniacza tkanek i ustaw go tak, aby powierzchnia brzuszna spoczywała na bibule filtracyjnej. Linia środkowa prostopadła do ostrza siekacza i krawędź rostralna mózgu przylegająca do ostrza.
Użyj pędzla artystycznego poddanego działaniu A-D-E-P-C, aby utrzymać mózg nieruchomo, wywierając delikatny nacisk na grzbietową powierzchnię mózgu, jednocześnie utrzymując mózg nieruchomo. Podnieś dźwignię uchwytu ostrza około czterech do pięciu centymetrów nad powierzchnię tkanki grzbietowej i przytrzymaj ją w tej pozycji. Usuń szczoteczkę z powierzchni mózgu i wybierz 750 mikrometrów.
Za pomocą mikrometru. Pozwól, aby dźwignia opadła, siekając tkankę i tworząc przekrój koronalny o długości 750 mikrometrów, podczas gdy ostrze rozdrabniacza pozostaje nieruchome. Użyj ruchu tocznego pędzlem artysty, aby delikatnie odsunąć część tkanki od powierzchni ostrza.
Natychmiast umieścić wycinek tkanki w natlenionym EBSS na szalce Petriego. Ten plasterek jest teraz gotowy do mikropreparacji. Powtarzaj procedurę krojenia, aż uzyskasz seryjne skrawki mózgu na całej płaszczyźnie kodalnej rost w celu przeprowadzenia mikrosekcji.
Najpierw sprawdź oświetlenie, aby upewnić się, że sample oświetlenie nie będzie zakłócone. Dostosuj położenie i przepływ mieszanki O2 CO2, aby utrzymać buforowane, natlenione środowisko dla tkanki. Podczas zabiegu zidentyfikuj koronalną część mózgu, która obejmuje obszar zainteresowania i za pomocą pędzla artystycznego ustaw ją płasko na dnie szalki Petriego.
Wybierz rdzeń tkankowy o odpowiedniej średnicy. Przytrzymaj wycinek tkanki koronalnej na miejscu za pomocą pędzla artysty i przesuń końcówkę tnącą rdzenia tkanki w dół po powierzchni sekcji tkanki. Wywierając nacisk, wciśnij końcówkę rdzenia tkanki przez przekrój tkanki i mocno w dół na dno szalki Petriego.
Użyj toczących się ruchów okrężnych, aby upewnić się, że obszar zainteresowania został oddzielony od otaczającej tkanki. Ostrożnie podnieś rdzeń tkanki z sekcji tkanki i uwolnij mikrodziurkacz, pozwalając mu unosić się w EBSS za pomocą pędzla artystycznego. Natychmiast umieść mikrodziurkacz tkankowy w stabilnej rurce do przechowywania o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przechowywanej na suchym lodzie.
Tkanka powinna łatwo przylegać do boku rurki. Umieścić probówkę zawierającą mikropróbkę z powrotem w suchym lodzie. Powtórz tę mikrodysekcję dla każdego obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania.
Po zakończeniu mikrodysekcji zapisz odpowiednią etykietę lub kody kreskowe dla każdej próbki zawierającej probówkę. Umieść próbki tkanek w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu ekstrakcji RNA w celu ekstrakcji RNA z próbek tkanek. Najpierw przygotuj przestrzeń roboczą wolną od RNA.
Przygotuj wystarczającą ilość mieszanki kulek magnetycznych i roztworu wiążącego lizę, zgodnie z opisem w instrukcji całkowitego zestawu do izolacji RNA. Wyjmij próbki tkanek z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i umieść probówki bezpośrednio na suchym lodzie. Dodać 100 mikrolitrów roztworu wiążącego lizę do probówki z próbką.
Podłącz wolny od nukleaz tłuczek o wielkości 0,5 mililitra do mieszalnika do peletów i homogenizuj tkankę za pomocą końcówki pipety o niskiej retencji bez nukleazy. Przenieść homogenizowaną próbkę do studzienki na okrągłej płytce do hodowli tkankowej z 96 dołkami przy użyciu tego samego typu końcówki natychmiast. Dodać 60 mikrolitrów 100% izopropanolu do próbki.
Dodać 20 mikrolitrów mieszanki kulek do próbki i mieszać, pipetując w górę i w dół trzy do czterech razy. Postępuj zgodnie z protokołem całkowitego zestawu do izolacji RNA: Kroki, aby zakończyć całkowitą ekstrakcję RNA. Na koniec zmierz czystość i stężenie uzyskanego całkowitego RNA Dane z mikrodziurek różnych obszarów mózgu przedstawiono w tej tabeli.
Próbki RNA z 30 mikrolitrami evolution Buffer dostarczyły wystarczającą ilość całkowitego RNA do stosowania z dostępnymi na rynku produktami do przygotowania CD NA do zastosowań sekwencjonowania RNA. Dodatkowo, wydajność RNA i dwa stosunki 60 do dwóch 80 są pojedynczymi wartościami uzyskanymi z odpowiednich próbek mikrodysekcyjnych w celu wykazania odczytów uzyskanych z każdego regionu mózgu i potwierdzają wysoką czystość próbki Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu ośmiu do 10 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zminimalizowaniu ryzyka zanieczyszczenia RNA powierzchni roboczych lub próbek tkanek poprzez stosowanie wyłącznie materiałów wolnych od RNA lub poddanych działaniu dsy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje protokół profilowania ekspresji RNA w wybranych regionach mózgu myszy, kładąc nacisk na precyzyjną i powtarzalną strategię pobierania tkanki. Metoda łączy przekroje koronarne mózgu z mikrodyssekcją wspomaganą rdzeniobierakiem tkanki, aby uzyskać wysokiej jakości całkowitą RNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia molekularna
- Profilowanie RNA
Tło
- Profilowanie ekspresji RNA jest kluczowe dla zrozumienia funkcji mózgu.
- Dyskretne jądra mózgu wymagają starannego rozkroju dla dokładnej analizy.
- Utrzymanie środowiska wolnego od RNazy jest niezbędne dla integralności RNA.
- Poprzednie metody brakowały spójności i powtarzalności.
Cel badania
- Ustanowienie niezawodnego protokołu ekstrakcji RNA z regionów mózgu myszy.
- Zapewnić wysoki wydajność i jakość RNA dla zastosowań w dalszym ciągu.
- Ułatwienie profilowania transkryptomu poprzez ulepszone metody pobierania tkanki.
Stosowane metody
- Przygotowanie środowiska roboczego wolnego od RNazy.
- Odcięcie głowy i usunięcie całego mózgu od myszy.
- Jednolite przekrojenie tkanki mózgowej za pomocą cięcarki tkankowej sterowanej mikrometrycznie.
- Mikrodyssekcja ukierunkowanych regionów mózgu za pomocą rdzenia tkanki w środowisku wolnym od RNA.
Główne wyniki
- Uzyskano wysoki wydajność całkowitej RNA z rozkrojonych jąder mózgowych.
- Jakość RNA została potwierdzona jako nadająca się do przygotowania biblioteki cDNA.
- Wyniki potwierdzają użyteczność metody do profilowania transkryptomu.
- Analizy wykazały wystarczającą jakość RNA dla zastosowań w dalszym ciągu.
Wnioski
- Opisany protokół zapewnia niezawodne podejście do ekstrakcji RNA.
- Poprawia spójność i jakość próbek RNA z regionów mózgu myszy.
- Ta metoda jest korzystna dla przyszłych badań neuronaukowych z udziałem analizy RNA.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This microdissection approach enables reproducible, high-yield total RNA isolation from discrete mouse brain regions, addressing a key bottleneck in neuroscience target validation where low RNA yields from laser capture microscopy hinder transcriptome profiling. By providing consistent RNA quality suitable for next-generation sequencing, the method supports mechanistic de-risking of CNS targets and improves predictive confidence in early discovery workflows. It positions as a scalable, cost-efficient alternative for brain region-specific gene expression studies in preclinical target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating RNA from specific brain nuclei to correlate transcript expression with neuronal circuit function and behavioral phenotypes.
- Operational Value: Provides repeatable, cost-efficient sample collection from multiple discrete regions per mouse, reducing animal use and increasing throughput for target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers total RNA with sufficient yield and purity for downstream RNA-Seq and qRT-PCR, enabling reliable assay development for gene expression screening in brain tissue models.
- Operational Value: Uses magnetic bead-enabled RNA isolation compatible with high-throughput workflows, supporting standardization across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant transcriptomic profiling in mouse models, aligning with translational biomarker discovery efforts in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders.
- Operational Value: Ensures RNA integrity through RNase-free protocols, improving reproducibility in longitudinal preclinical studies and cross-laboratory data comparability.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, where precise brain region RNA profiling informs target selection and prioritization before preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by enabling transcriptomic comparison across discrete brain regions linked to specific neural circuits.
- Screening: Produces standardized RNA inputs suitable for quantitative gene expression screening, enhancing reproducibility in target engagement assays.
- Analytics: Generates high-quality RNA for spectrophotometric and fluorometric quantification, enabling precise input normalization for sequencing and PCR-based applications.
- Translational Research: Connects discovery-phase expression profiling to preclinical continuity by providing disease-relevant transcriptomic data from defined brain regions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue collection and RNA isolation platform applicable across multiple neuroscience projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through precise brain region-specific expression data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via RNase-free workflows and minimal hands-on time (8–10 minutes per sample).
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling multiple regional samples from a single animal, reducing costs associated with low-yield methods requiring amplification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by delivering reliable transcriptome data for go/no-go decisions in CNS drug discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy and RNase-free technique to maintain sample integrity during dissection and RNA extraction.
- Depends on access to a micrometer-operated tissue chopper, set-diameter tissue corers, and magnetic bead-based RNA isolation kits.
- Necessitates standardized RNase-free environment protocols across teams to ensure cross-study consistency in RNA quality.
- Adaptation to other brain regions or species may require optimization of tissue core diameter and sectioning parameters.
- Practical limitation: Manual tissue punching may limit ultra-high-throughput applications compared to automated laser capture systems, though it offers superior RNA yield.
