Name: Obrazowanie zdarzeń sygnalizacyjnych za pośrednictwem receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR), które kontrolują chemotaksję Dictyostelium discoideum (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj zaawansowaną mikroskopię konfokalną do badania dynamiki sygnałowania podczas chemotaksji u Dictyostelium discoideum. Technika umożliwia wizualizację aktywacji białek G i produkcji PIP3 w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest finansowana ze środków wewnętrznych NIAID, NIH.

1. Przygotowanie komórek Dictyostelium discoideum kompetentnych chemotaktycznie
<ol>
<li>Aby uzyskać komórki D. discoideum wykazujące chemotaksję w kierunku chemoatraktanta cAMP, należy zebrać komórki hodowane w bogatym medium D3-T z hodowli z wytrząsaniem w temperaturze 22°C.</li>
<li>Komórki należy przemyć dwukrotnie w bezodżywczym buforze rozwojowym (bufor DB zawierający 5 mM Na2HPO4, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2 oraz 0,1 mM CaCl2).</li>
<li>Komórki należy zawiesić ponownie w buforze DB z zagęszczeniem 2x107 komórek/ml.</li>
<li>10 ml zawiesiny komórkowej w kolbie o pojemności 250 ml należy wytrząsać z prędkością 100 rpm w temperaturze 22°C przez jedną godzinę.</li>
<li>Co sześć minut przez okres 6 godzin należy dodać 100 μl roztworu cAMP o stężeniu 7,5 μM do 10 ml zawiesiny komórek, aby osiągnąć końcowe stężenie cAMP wynoszące 75 nM; proces ten określa się jako traktowanie pulsacyjne cAMP. Po 5-6 godzinach traktowania pulsacyjnego cAMP komórki D. discoideum stają się zdolne do chemotaksji w kierunku gradientu cAMP.</li>
<li>Komórki należy zebrać poprzez wirowanie przy 200 g przez 5 min, a następnie zawiesić ponownie w buforze DB zawierającym 2,5 mM kofeiny i wytrząsać z prędkością 200 rpm w temperaturze 22°C przez 20 min, aby sprowadzić stan komórek do poziomu bazowego przed rozpoczęciem chemotaksji.</li>
</ol>
2. Obrazowanie komórek chemotaktycznych w widocznym i manipulowalnym gradiencie chemoatraktanta
<ol>
<li>Wypełnij mikropipetę świeżo przygotowanym 30 μl roztworem 1 μM cAMP i Alexa 594 w stężeniu 0,1 μg/μl w buforze DB.</li>
<li>Zamocuj Femtotip w uchwycie do mikropipety i podłącz rurkę do urządzenia do podawania ciśnienia, systemu Eppendorf FemtoJet.</li>
<li>Zamocuj zestaw mikropipety w zmotoryzowanym mikromanipulatorze (Eppendorf TransferMan NK2), aby zapewnić stałe ciśnienie w celu ustanowienia stabilnego gradientu.</li>
<li>Umieść jednodoborkową komorę LabTek wypełnioną 6 ml buforu DB nad obiektywem olejowym 40X w mikroskopie konfokalnym i, korzystając z optyki pola jasnego, wycentruj Femtotip w polu widzenia.</li>
<li>Włącz zasilanie ciśnieniem i ustaw ciśnienie kompensacyjne (Pc) na 70 hPa, aby utworzyć gradient mieszaniny cAMP/Alexa 594.</li>
<li>Wizualizuj gradient cAMP, monitorując mieszaninę cAMP o pożądanym stężeniu oraz fluorescencję Alexa 594 przy użyciu wzbudzania linią lasera 543 nm.</li>
<li>Użyj funkcji autopozycjonowania mikromanipulatora, aby ustawić mikropipetę w wybranych punktach i zdefiniuj je jako Pozycję 1, Pozycję 2 oraz Pozycję 3, aby manipulować gradientem, na który wystawione są komórki.</li>
</ol>
3. Unieruchomiony system komórek niepolaryzowanych ułatwia obrazowanie zdarzeń sygnalizacyjnych związanych z wykrywaniem gradientu cAMP
<ol>
<li>Po traktowaniu kofeiną pobrać alikwot komórek i odwirować przy 500g przez 3 min.</li>
<li>Usunąć bufor i rozcieńczyć komórki do stężenia 5x105 komórek/ml świeżym buforem DB zawierającym 2,5 mM kofeiny.</li> 
<li>Nanieść 1 ml zawiesiny komórkowej do komory z jedną studnią lub 0,4 ml do każdej studni komory czterostudniowej.</li>
<li>Pozostawić komórki do przylgnięcia na 10 min, ostrożnie odpipetować bufor w celu usunięcia nieprzylgniętych komórek i zastąpić go taką samą objętością.</li>
<li>Zlokalizować wybrane komórki pod mikroskopem i rozpocząć obrazowanie.</li>
<li>W przypadku eksperymentu zaprojektowanego do monitorowania dynamiki komponentów sygnalizacyjnych w komórkach narażonych na stały gradient, traktować komórki Latrunculiną B w stężeniu 5,0 μM (stężenie końcowe) przez 10 min przed rozpoczęciem eksperymentów.</li>
</ol>
4. Jednoczesny monitoring aktywacji heterotrymerycznego białka G i produkcji PIP3
<ol>
<li>Stymuluj pulsacyjnie cAMP komórki koekspresujące GαCFP i YFPGβ (komórki G) oraz komórki ekspresujące wskaźnik PIP3 PH-GFP (komórki PH) 7.</li> 
<li>Zmieszaj te dwa typy komórek w stosunku 1:1 i wysiej je w komorach jedno- lub czterodotworowych.</li>
<li>Utwórz i zapisz referencyjną krzywą sygnatury emisyjnej dla CFP, YFP i GFP, korzystając z trybu Lambda Stack Acquisition w zakresie widmowym od 464 do 624 nm z szerokością 10 nm.</li>
<li>Wykonaj jednoczesne obrazowanie aktywacji białka G w komórkach G oraz produkcji PIP3 w komórkach PH, korzystając z tego samego trybu Lambda Stack Acquisition w zakresie widmowym od 464 do 544 nm z przyrostami 10 nm.</li>
<li>Zastosuj funkcję Linear Unmixing oprogramowania Zeiss 510META, wykorzystując zapisane sygnatury emisyjne CFP i YFP, aby matematycznie obliczyć udział każdego fluoroforu w Lambda Stack i rozdzielić intensywność CFP i YFP na oddzielne kanały w komórkach G.</li>
<li>Stosując tę samą strategię, użyj funkcji Linear Unmixing z zapisanymi sygnaturami emisyjnymi GFP i tła, aby matematycznie obliczyć intensywność GFP w komórkach PH.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
<ol>
<li>Doskonały system modelowy dla D. discoideum do chemotaksji pośredniczonej przez GPCR. Ameba społeczna, *D. discoideum* wykazuje uderzającą chemotaksję w cyklu życiowym. Dzięki swoim zaletom genetycznym i biochemicznym, D. d stanowi potężny system do badania chemotaksji.</li>
<li>Chemotaksja komórek w widocznych i manipulowalnych polach chemoatraktantów. W niniejszej części przedstawiamy najpierw prostą metodologię uzyskania liniowej zależności między stężeniem cAMP a intensywnością fluorescencji barwnika Alexa 594 poprzez wykonanie serii rozcieńczeń 2 μM cAMP wymieszany z 10 μg/mL Alexa 594 (Ryc. 2A). Następnie przedstawiamy prosty sposób wizualizacji gradientu, a ponadto metodę ilościowego pomiaru stężenia cAMP w gradiencie na podstawie intensywności Alexa 594 (Ryc. 2B).</li>
<li>Motywność komórek jest rozdzielona z polaryzacją komórek i wyczuwaniem kierunku. Inhibitor polimeryzacji aktyny eliminuje istniejącą wcześniej polarność morfologiczną i zapobiega również ruchowi komórek, zachowując jednocześnie ich zdolność do wyczuwania kierunku (Ryc. 3A). Wykorzystanie światła widzialnego i podatny na manipulację Stymulacja cAMP zapewnia sygnał wejściowy, na przykład w formie równomiernie przyłożonej stymulacji lub gradientu. Metoda ta pozwala na ilościową analizę indukowanej przez cAMP redystrybucji kluczowych komponentów sygnałowych w mechanizmie wykrywania gradientu. Pomiar dynamiki czasoprzestrzennej tych komponentów sygnałowych pozwala zrozumieć, w jaki sposób sieć sygnałowa osiąga adaptację do równomiernej stymulacji, generując jednocześnie spolaryzowane odpowiedzi biochemiczne na gradienty (Rys. 3B).</li> 
<li>Systematyczne pomiary kinetyki sieci sygnalizacyjnej chemosensorycznej po ekspozycji na stały gradient. Kluczowe jest zmierzenie dynamiki/kinetyki komponentów sygnałowych odpowiedzialnych za wykrywanie kierunku, aby zrozumieć, w jaki sposób każdy z tych komponentów przyczynia się do ustanowienia polaryzacji wewnątrzkomórkowej w momencie, gdy komórki po raz pierwszy napotykają gradient. Wykorzystując obrazowanie żywych komórek o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej, wykazaliśmy najpierw dwufazową produkcję PIP3 w komórce poddanej działaniu stałego gradientu cAMP (Rys. 4A-C). Stosując obrazowanie żywych komórek, systematycznie zmierzyliśmy dynamikę specyficznej sieci sygnałowej wykrywania kierunku – od stymulacji cAMP do produkcji PIP3 (Rys. 4D, E).</li>
<li>Jednoczesne monitorowanie aktywacji heterotrymerycznych białek G i PIP3 produkcja po jednorodnej stymulacji cAMP. Transfer energii rezonansowej Förstera (w skrócie FRET) stanowi wydajną metodę monitorowania aktywacji (dysocjacji) heterotrymerycznych białek G po stymulacji cAMP. W niniejszym opracowaniu opisano wygodny i łatwy do wdrożenia system do jednoczesnego pomiaru aktywacji heterotrymerycznych białek G oraz PIP3 produkcja poprzez monitorowanie zmian FRET oraz translokacji błonowej PIP3 sonda, odpowiednio PH-GFP w komórkach G i PH (rys. 5). Jednorodne pobudzenie cAMP wywołuje trwałą aktywację białka G, podczas gdy wywołuje przejściową odpowiedź PIP3 produkcja</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig1.jpg" alt="Schemat sygnalizacji GPCR; eksperyment aktywacji białek; fluorescencja PH-GFP i cAMP:Alexa594." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1: Doskonały system modelowy D. discoideum dla chemotaksji pośredniczonej przez GPCR. A. Schemat przedstawia skrócony szlak sygnalizacyjny wyczuwania kierunkowego. B. Gradient cAMP indukuje szybką chemotaksję komórek D. discoideum. Komórki wykazują ekspresję sondy PIP3, PH-GFP (zielony). Gradient (czerwony) jest wizualizowany za pomocą Alexa 594. Pasek skali=50μm.
<img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig2.jpg" alt="Wykres intensywności Alexa 594 w funkcji stężenia cAMP; eksperyment mierzy intensywność fluorescencji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2: Chemotaksja komórek w widocznym i manipulowalnym polu chemoatraktantów. A. Wykres przedstawia liniową zależność między stężeniem cAMP a intensywnością barwnika fluorescencyjnego Alexa 594 w serii rozcieńczeń 2 μM cAMP zmieszanego z 10 μg/mL Alexa 594. B. Ilościowy pomiar stężenia cAMP w gradiencie na podstawie liniowej zależności między stężeniem cAMP a intensywnością barwnika fluorescencyjnego Alexa 594 przedstawionej w A.
<img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig3.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna, PH-GFP cAMP/Alexa594, lokalizacja białek, wyniki obrazowania komórkowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3: Motywność komórek jest rozsprzęgana z polaryzacją komórkową i wyczuwaniem kierunkowym. A. Obraz pokazuje, że komórki unieruchomione za pomocą inhibitora polimeryzacji aktyny Latrunculiny B zachowują zdolność do wyczuwania kierunkowego. Komórki wykazują ekspresję sondy PIP3, PH-GFP (zielony). Gradient (czerwony) jest wizualizowany za pomocą Alexa 594. B. Możliwość manipulacji stymulacją cAMP oraz system unieruchomionych komórek pozwalają na rozstrzygnięcie kluczowych pytań dotyczących wyczuwania kierunkowego. Pasek skali=10μm.
<img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig4.jpg" alt="Time-lapse sygnalizacji komórkowej; aktywacja GPCR; mikroskopia fluorescencyjna; wykres dynamiki fosfoinozytoldów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4: Systemowe pomiary kinetyki sieci sygnalizacyjnej chemosensacji po ekspozycji na stały gradient. A. Montaż przedstawia dwufazową produkcję PIP3 (kolor zielony) w komórce poddanej działaniu stałego gradientu cAMP (kolor czerwony). B. Obraz przedstawia obszary zainteresowania (ROI) służące do pomiaru kinetyki produkcji PIP3, zaprezentowanej w części C. C. Kinetyka produkcji PIP3 w komórkach poddanych działaniu stałego gradientu. D. Schemat przedstawia sieć sygnalizacyjną wykrywania kierunkowego, od stymulacji cAMP do produkcji PIP3. Kinetyka tych procesów po ekspozycji na stały gradient jest przedstawiona w części E za pomocą pełnych linii w odpowiadających im kolorach.
<img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig5.jpg" alt="Schemat translokacji FRET i wykres analizujący efekty stymulacji cAMP na komponenty komórkowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> Rysunek 5: Jednoczesny monitoring wielu zdarzeń w sieciach sygnalizacyjnych GPCR. A. Schemat przedstawia jednoczesny pomiar aktywacji heterotrymerycznego białka G oraz produkcji PIP3 poprzez monitorowanie zmiany FRET oraz translokacji błonowej sondy PIP3, PH-GFP w komórkach G i PH, odpowiednio. B. Montaż obrazów tęczowych komórek G i PH pokazuje, że jednorodna stymulacja cAMP wywołuje trwałą aktywację białka G na obwodzie komórki, podczas gdy indukuje przejściową produkcję PIP3. Punkty czasowe obejmują stan przed stymulacją (0s) oraz po stymulacji w czasie 4,9s, 10,2s i 20,4s. C. Kinetyka aktywacji białka G i produkcji PIP3 po jednorodnej stymulacji cAMP.

<ol><li>Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+regulation+of+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial regulation of chemotaxis.</a> Dev Cell. 3, 469-469 (2002).</li>
<li>Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+leukocyte+chemoattractant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors.</a> Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).</li>
<li>Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-linked+signaling+pathways+control+the+developmental+program+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium.</a> Neuron. 12, 235-235 (1994).</li>
<li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%2C+chemokine+receptors+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-1 (2008).</li>
<li>Meier-Schellersheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+local+regulation+in+chemosensing+revealed+by+a+new+molecular+interaction-based+modeling+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method.</a> PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).</li>
<li>Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+mechanism+of+a+GPCR+and+a+heterotrimeric+G+protein+during+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Sci Signal. 3, 71-71 (2010).</li>
<li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+single+live+cells+reveals+spatiotemporal+dynamics+of+multistep+signaling+events+of+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).</li>
<li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+controlled+inhibitory+mechanisms+are+involved+in+eukaryotic+GPCR-mediated+chemosensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing.</a> J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).</li>
<li>Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+G+protein+betagamma+complex+in+living+cells+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis.</a> Science. 287, 1034-1034 (2000).</li>
<li>Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+activation+of+heterotrimeric+G-proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells.</a> Science. 291, 2408-2408 (2001).</li>
<li>Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phosphatidylinositol+3%27+kinase+and+a+downstream+pleckstrin+homology+domain-containing+protein+in+controlling+chemotaxis+in+dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium.</a> J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).</li>
<li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+PLC-beta2+and+-beta3+and+PI3Kgamma+in+chemoattractant-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction.</a> Science. 287, 1046-1046 (2000).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).</li>
<li>Meili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattractant-mediated+transient+activation+and+membrane+localization+of+Akt%2FPKB+is+required+for+efficient+chemotaxis+to+cAMP+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium.</a> EMBO J. 18, 2092-2092 Forthcoming.</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein+signaling+events+are+activated+at+the+leading+edge+of+chemotactic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells.</a> Cell. 95, 81-81 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+regulation+of+3-phosphoinositides+by+PI+3-kinase+and+PTEN+mediates+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis.</a> Cell. 109, 611-611 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PTEN+mediates+sensing+of+chemoattractant+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients.</a> Cell. 109, 599-599 (2002).</li>
<li>Haastert, P. J. V. an, Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%3A+signalling+the+way+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis: signalling the way forward.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Procesy osiągania przez komórki stanu kompetencji chemotaktycznej
W przypadku komórek typu dzikiego D. discoideum potrzeba około 5 ˜ 6 godzin pulsacyjnego rozwoju w temperaturze pokojowej, aby wprowadzić je w stan pełnej kompetencji chemotaktycznej, podczas którego komórki wykazują wyraźną polaryzację morfologiczną oraz szybką migrację (Ryc. 1). Na proces osiągania stanu kompetencji chemotaktycznej może wpływać szereg czynników, takich jak stężenie cAMP podczas pulsacji, temperatura oraz...

<table><tbody><tr><td>Pożywka wzrostowa D3-T</td><td>KD Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kofeina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Latrunkulina B</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Programowalny timer ChronTrol XT</td><td>ChronTrol Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna Miniplus 3</td><td>Gilbson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platformowy wstrząsarkowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrokapilarne źródło ciśnienia FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jedno- i czterodochowe komory z nakładką szklaną Lab-Tek II</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny LSM 510 META lub równoważny</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>obiektyw olejowy DIC Plan-Neofluar 40X 1.3 NA lub 60X 1.4 NA</td></tr><tr><td>Olympus X81 lub równoważny</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Wymagany obiektyw TIRF 100X 1.47 NA</td></tr></tbody></table>

obrazowanie zdarzeń sygnalizacyjnych pośredniczonych przez receptory sprzężone z białkiem g (gpcr), które kontrolują chemotaksję dictyostelium discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Wiele komórek eukariotycznych potrafi wykrywać gradienty sygnałów chemicznych w swoim otoczeniu i migrować zgodnie z nimi 1. Ta sterowana migracja komórek nazywana jest chemotaksją, która jest niezbędna dla wielu typów komórek do pełnienia ich funkcji, takich jak ruch komórek odpornościowych czy organizacja komórek neuronalnych 2, 3. Duża rodzina receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR) wykrywa różnorodne małe peptydy, znane jako chemokiny, aby kierować migracją komórek in vivo 4. Nadrzędnym celem badań nad chemotaksją jest zrozumienie, w jaki sposób mechanizm GPCR wyczuwa gradienty chemokin i kontroluje zdarzenia sygnalizacyjne prowadzące do chemotaksji. W tym celu wykorzystujemy techniki obrazowania do monitorowania w czasie rzeczywistym spatiotemporalnych stężeń chemoatraktantów, ruchu komórek w gradiencie chemoatraktanta, zależnej od GPCR aktywacji heterotrymerycznych białek G oraz wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych zaangażowanych w chemotaksję komórek eukariotycznych 5-8. Prosty organizm eukariotyczny, Dictyostelium discoideum, wykazuje zachowania chemotaktyczne podobne do leukocytów, przez co D. discoideum stanowi kluczowy system modelowy do badania chemotaksji eukariotów. Jako wolnożyjące ameby, komórki D. discoideum dzielą się w bogatym medium. W warunkach głodu komórki wchodzą w program rozwojowy, w którym agregują poprzez chemotaksję zależną od cAMP, tworząc struktury wielokomórkowe. W D. discoideum zidentyfikowano wiele komponentów zaangażowanych w chemotaksję w kierunku cAMP. Wiązanie cAMP do GPCR (cAR1) indukuje dysocjację heterotrymerycznych białek G na podjednostki Gγ i Gβγ 7, 9, 10. Podjednostki Gβγ aktywują Ras, który z kolei aktywuje PI3K, przekształcając PIP2 w PIP3 na błonie komórkowej 11-13. PIP3 służy jako miejsce wiązania dla białek z domenami homologii pleckstryny (PH), rekrutując tym samym te białka do błony 14, 15. Aktywacja receptorów cAR1 kontroluje również asocjację PTEN z błoną, który defosforyluje PIP3 do PIP2 16, 17. Mechanizmy molekularne te są ewolucyjnie konserwatywne w chemotaksji zależnej od GPCR chemokin w komórkach ludzkich, takich jak neutrofile 18. Przedstawiamy następujące metody badania chemotaksji komórek D. discoideum: 1. Przygotowanie komórek do badań chemotaktycznych. 2. Obrazowanie chemotaksji komórek w gradiencie cAMP. 3. Monitorowanie indukowanej przez GPCR aktywacji heterotrymerycznego białka G w pojedynczych żywych komórkach. 4. Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamicznych odpowiedzi PIP3 wywołanych chemoatraktantem w pojedynczych żywych komórkach. Opracowane przez nas metody obrazowania mogą być zastosowane do badania chemotaksji ludzkich leukocytów.

W niniejszej pracy opisujemy szczegółowe metody obrazowania żywych komórek służące do badania chemotaksji. Przedstawiamy metody mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania dynamiki czasowo-przestrzennej zdarzeń sygnalizacyjnych w migrujących komórkach. Pomiar zdarzeń sygnalizacyjnych pozwala nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób sieć sygnalizacyjna GPCR umożliwia wyczuwanie gradientu chemoatraktantów i kontroluje kierunkową migrację komórek eukariotycznych.

Obrazowanie zdarzeń sygnalizacyjnych pośredniczonych przez receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), które kontrolują chemotaksję Dictyostelium discoideum

Wiele komórek eukariotycznych potrafi wykrywać gradienty sygnałów chemicznych w swoim otoczeniu i migrować zgodnie z nimi 1. Ta kierowana migracja komórek nazywana jest ...

Ogólnym celem tej procedury jest zastosowanie zaawansowanej konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania dynamiki czasowo-przestrzennej zdarzeń sygnalizacyjnych podczas chemotaksji w komórkach dictyostelium discoideum. W pierwszej kolejności przygotowywane są chemotaktycznie kompetentne komórki dictyostelium discoideum. Następnie obrazowany jest kontrolowany gradient chemoatraktanta w celu ustalenia liniowej zależności między stężeniem chemoatraktanta a intensywnością fluorescencji chemoatraktanta. Trzecim krokiem jest uzyskanie systemu unieruchomionych komórek do obrazowania zdarzeń sygnalizacyjnych zaangażowanych w wykrywanie gradientu cyclic AMP.Ostatnim krokiem jest jednoczesne monitorowanie dwóch kontrolowanych zdarzeń sygnalizacyjnych G PCR w żywych komórkach: aktywacji heterotrymerycznego białka G oraz produkcji PIP three. Ostatecznie analizowane są czasoprzestrzenne zmiany intensywności fluorescencji w pojedynczych komórkach stymulowanych chemoatraktantem. Cyclic A MP można wizualizować za pomocą obrazowania żywych komórek z wykorzystaniem zaawansowanej mikroskopii konfokalnej.Główną zaletą tej techniki jest umożliwienie uzyskania czasowo-przestrzennych informacji o zdarzeniach sygnalizacyjnych w żywych komórkach. Pomiary w czasie rzeczywistym pozwalają na lepsze zrozumienie, w jaki sposób sieć sygnalizacyjna A-G-P-C-R jest w stanie wykryć składnik chemoatraktanta i generować odpowiednie odpowiedzi. Procedurę zaprezentuje dr Shu, specjalista w zakresie metod obrazowania w czasie rzeczywistym. Aby przygotować komórki Dictyostelium chemotaktyczne względem chemoatraktanta cyklicznego A MP, należy zebrać komórki hodowane w medium D3 w kulturze wstrząsanej w temperaturze 22 °C.Komórki przemyć dwukrotnie w bezodżywczym buforze rozwojowym (non nutrient developmental buffer) poprzez wirowanie przy 400 Gs przez pięć minut. W temperaturze pokojowej ponownie zawiesić komórki w buforze DB w zagęszczeniu 2 × 10⁷ komórek na mililitr. Przenieść 20 milionów komórek w 10 mililitrach bufora rozwojowego do kolby o pojemności 250 mililitrów, a następnie inkubować komórki przy wytrząsaniu z prędkością 100 RPM w temperaturze 22 °C przez jedną godzinę.Następnie dozuj 100 µL roztworu zapasu cyclic AMP o stężeniu 7,5 µM do 10 ml komórek co sześć minut przez kolejne sześć godzin, aby uzyskać końcowe stężenie cyclic AMP wynoszące 75 nM. Teraz zbierz komórki kompetentne do chemoatraktanta cyclic AMP poprzez wirowanie, tym razem przy 200 ×g, a następnie resuspenduj komórki w buforze DB zawierającym 2,5 mM kofeiny. Ponownie inkubuj komórki w wytrząsarce w temperaturze 22 °C przez 20 minut, tym razem przy 200 RPM, aby przygotować komórki do chemotaksji.Najpierw należy napełnić mikro-pipetę świeżo przygotowanym 30 mililitrowym roztworem 1 µM cyklicznego AMP i Alexa 594 w stężeniu 0,1 µg/µL w buforze DB. Następnie należy przymocować końcówkę Femto do uchwytu mikro-pipety i podłączyć przewody do urządzenia zasilającego ciśnieniem. Aby ustabilizować gradient, należy przymocować zespół mikro-pipety do zmotoryzowanego mikromanipulatora.Napełnij jednodobojową komorę laboratoryjną sześcioma mililitrami buforu DB, a następnie zamontuj komorę nad obiektywem olejowym 40x w mikroskopie konfokalnym, korzystając z optyki Brightfield, ustawiając końcówkę Femto w polu widzenia. Następnie włącz zasilanie ciśnieniowe i ustaw ciśnienie kompensacyjne na 70 hPa, aby ustanowić gradient mieszaniny cAMP i Alexa 594. Wizualizuj gradient cAMP, monitorując mieszaninę cAMP o pożądanym stężeniu oraz fluorescencję Alexa 594, stosując wzbudzanie linią lasera o długości fali 543 nm.Na koniec należy użyć funkcji automatycznego pozycjonowania mikromanipulatora, aby umieścić mikropipetę w pożądanych położeniach oraz ustawić pozycję pierwszą, drugą i trzecią w celu kontrolowania gradientu, któremu wystawione są komórki. Po traktowaniu kofeiną należy pobrać aalikwot komórek i odwirować je przy 500 Gs przez trzy minuty. W temperaturze pokojowej należy usunąć bufor i rozcieńczyć komórki do stężenia 5 × 10⁵ komórek na mililitr.Z nowym buforem DB zawierającym 2,5 mM kofeiny. Następnie nanieś jeden mililitr zawiesiny komórkowej do pojedynczej komory dołka. Po odczekaniu 10 minut w celu przytwierdzenia komórek, ostrożnie odessaj bufor pipetą, aby usunąć nieprzytwierdzone komórki, a następnie zastąp go taką samą objętością świeżego buforu DB z kofeiną; aby rozpocząć obrazowanie, zlokalizuj wybrane komórki pod mikroskopem.Następnie, aby monitorować dynamikę komponentów sygnałowych w komórkach wystawionych na stały gradient, należy potraktować komórki pięcioma mikromolarnymi LA truculent B przez 10 minut przed rozpoczęciem jakichkolwiek doświadczeń. Ten schemat przedstawia skróconą ścieżkę sygnałową kierunkowego wyczuwania w tym filmie.Widać, jak cykliczny gradient cAMP indukuje szybką chemotaksję komórek D. discost wykazujących ekspresję sondy PIP3. PH-GFP widoczne są w kolorze zielonym. Gradient, wizualizowany za pomocą Alexa 594, widoczny jest w kolorze czerwonym.Przedstawiono prostą metodę uzyskania liniowej zależności między stężeniem cyklicznego AMP a intensywnością barwnika fluorescencyjnego Alexa 594, za pomocą serii rozcieńczeń 2 µM cyklicznego AMP zmieszanego z 10 µg/mL Alexa 594.Następnie graficznie zaprezentowano prosty sposób ustalenia ilościowego pomiaru stężenia cyklicznego AMP w gradiencie na podstawie intensywności Alexa 594. Rysunek ten pokazuje, że komórki, w których ruchliwość została zahamowana przez latrunkulinę B (inhibitor polimeryzacji aktyny), nadal zachowują zdolność do wyczuwania kierunku. Komórki wykazują ekspresję sondy PIP3, PH-GFP i są widoczne na zielono, natomiast gradient w kolorze czerwonym jest wizualizowany za pomocą Alexa 594.W tym filmie pokazano, jak zastosowanie uproszczonego, niepolaryzowanego systemu komórkowego oraz sterowalnej stymulacji cyklicznym AMP pozwala odpowiedzieć na fundamentalne pytania dotyczące wyczuwania kierunku. Aby zademonstrować zastosowanie obrazowania żywych komórek z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną, przedstawiono tutaj komórkę w kolorze zielonym, wykazującą dwufazową ekspresję PIP3 w odpowiedzi na ekspozycję na stały gradient cyklicznego AMP zaznaczony kolorem czerwonym.Na tym obrazie przedstawiono obszary zainteresowania dla pomiaru kinetyki produkcji PIP3. Kinetyka produkcji PIP3 w przedniej i tylnej części komórek po ekspozycji na stały gradient jest tutaj zaprezentowana z produkcją PIP3 z przodu i z tyłu, odpowiednio w kolorze czarnym i szarym. Stosując obrazowanie żywych komórek, systematycznie zmierzyliśmy dynamikę specyficznej sieci sygnalizacyjnej wykrywania kierunku, od stymulacji cyklicznym AMP do produkcji PIP3.Ten schemat przedstawia sieć sygnalizacyjną kierunkowego wyczuwania, od stymulacji cyklicznym AMP do produkcji PIP3. Kinetyka każdego komponentu jest przedstawiona linią w tym samym kolorze. Na tej pierwszej rycinie przedstawiono, w jaki sposób jednorodna stymulacja cyklicznym AMP wywołuje trwałą aktywację białka G, która z kolei prowadzi do przejściowej produkcji PIP3.Zestaw obrazów komórek z zaznaczonymi białkami G i pH pokazuje, że jednorodna stymulacja cAMP wywołuje trwałą aktywację białek G na obwodzie komórki, co jednocześnie prowadzi do przejściowej produkcji PIP3. Tutaj przedstawiono kinetykę aktywacji białek G oraz produkcji PIP3 po zastosowaniu jednorodnej stymulacji cAMP. Podczas przeprowadzania tych doświadczeń należy pamiętać, że kluczowe jest uzyskanie reaktywnych komórek, a wyniki mogą zależeć od tła genetycznego komórek oraz warunków środowiskowych.Warunki akwizycji obrazu zmieniają fizjologię komórki i mogą sprawić, że stanie się ona mniej responsywna. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać modelowanie obliczeniowe, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób dynamiczne interakcje w sieci sygnalizacyjnej wpływają na zachowanie komórki. Metody te torują drogę badaczom w dziedzinie chemotaksji eukariotycznej.Możemy opracować model obliczeniowy wykrywania chemoatraktantów. Model ten może być wykorzystany do symulowania dynamiki zdarzenia sygnałowego. Współzależność między udoskonaleniem modelu a pomiarami w warunkach rzeczywistych może prowadzić do głębszego zrozumienia chemotaksji.Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu lepiej rozumieją Państwo, jak zastosować zaawansowaną konfokalną mikroskopię fluorescencyjną do monitorowania zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach. Mamy nadzieję, że będą Państwo mogli wykorzystać tę metodę w swoich badaniach.

imaging-g-protein-coupled-receptor-gpcr-mediated-signaling-events

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie związanych z białkami G (GPCR) zdarzeń sygnałowych kontrolujących chemotaksję Dictyostelium Discoideum

System ECIS/Taxis to zautomatyzowany test w czasie rzeczywistym, który służy do pomiaru chemotaksji komórkowej. W tym teście komórki przemieszczają się pod warstwą agarozy, aby dotrzeć do elektrody docelowej. Ruch komórkowy jest mierzony poprzez pojawienie się oporu dla prądu AC 0.

Pomiar chemotaksji komórkowej za pomocą systemu ECIS/Taxis

Opisano metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktycznej Caenorhabditis elegans. Zastosowano wskaźnik chemotaksyczny (CI) jako sposób dokładnej oceny reakcji robaków na określone cele oraz jako platformę porównawczą między odmianami i związkami interesującymi.

C. elegans Test chemotaktyksy

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Wizualne testy chemotaksji są niezbędne do lepszego zrozumienia, w jaki sposób komórki eukariotyczne kontrolują kierunkową migrację komórek za pośrednictwem chemoatraktantu. W tym miejscu opisujemy szczegółowe metody dla: 1) monitorowania w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości wielu testów chemotaksji oraz 2) jednoczesnej wizualizacji gradientu chemoatraktantu i czasoprzestrzennej dynamiki zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilopodobnych komórkach HL60.

Obrazowanie chemotaksji sprzężonej z białkiem G i jej zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilowych komórkach HL60

Użycie dostosowanego "chipa węchowego" do efektywnego obrazowania wapnia u samców C. elegans jest opisane tutaj. Pokazano również badania dotyczące narażenia mężczyzn na glicerol i feromon.

Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

Tutaj opisujemy metody oceny odpowiedzi komórkowej na ostrą stymulację mechaniczną. W teście opartym na mikroskopii badamy lokalizację biosensorów znakowanych fluorescencyjnie po krótkiej stymulacji przepływem ścinającym. Badamy również biochemicznie aktywację różnych interesujących nas białek w odpowiedzi na ostrą stymulację mechaniczną.

Ocena odpowiedzi Dictyostelium discoideum na ostrą stymulację mechaniczną

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

S1P wywiera swoje różnorodne efekty fizjologiczne poprzez podrodzinę receptorów S1P (S1PRs). W tym miejscu opisano potok w celu wyjaśnienia struktur i funkcji S1PR.

Rurociąg do badania struktur i szlaków sygnałowych receptorów sfingozyno-fosforanowych

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Wykorzystując system obrazowania z dwufotonową mikroskopią o rozdzielczości spektralnej, uzyskano mapy wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli dla komórek ekspresujących receptory błonowe, w których przypuszcza się tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych. Na podstawie map wydajności FRET możliwe jest oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanego kompleksu oligomeru.

In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

Poznaj zaawansowaną mikroskopię konfokalną do badania dynamiki sygnałowania podczas chemotaksji u Dictyostelium discoideum. Technika umożliwia wizualizację aktywacji białek G i produkcji PIP3 w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie zdarzeń sygnalizacyjnych za pośrednictwem receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR), które kontrolują chemotaksję Dictyostelium discoideum (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie zdarzeń sygnalizacyjnych pośredniczonych przez receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), które kontrolują chemotaksję Dictyostelium discoideum

Przeglądaj więcej filmów