Obrazowanie zdarzeń sygnalizacyjnych za pośrednictwem receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR), które kontrolują chemotaksję Dictyostelium discoideum

Ogólnym celem tej procedury jest zastosowanie zaawansowanej fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej do monitorowania czasoprzestrzennej dynamiki zdarzeń sygnalizacyjnych podczas chemodetekcji w dyskoidalnych komórkach dium dictyostelium, najpierw przygotowywane są chemotaktyczne, kompetentne dyskoidalne komórki dium dictyostelium. Następnie obrazuje się kontrolowany gradient atraktantu chemo, aby ustalić liniową zależność między stężeniem atraktantu chemioterapii a atraktantem chemioterapii o intensywności fluorescencji. Trzecim krokiem jest uzyskanie nieruchomego systemu komórkowego do obrazowania zdarzeń sygnalizacyjnych związanych z cyklicznym wykrywaniem gradientu A MP.

Ostatnim krokiem jest jednoczesne monitorowanie dwóch zdarzeń sygnalizacyjnych kontrolowanych metodą G PCR R w żywych komórkach, heterotrimerycznej aktywacji białka G i produkcji three. Ostatecznie czasoprzestrzenne zmiany intensywności fluorescencji w pojedynczych komórkach, które są symulowane za pomocą atraktantu chemicznego. Cykliczny MP można wizualizować za pomocą obrazowania żywych komórek za pomocą zaawansowanej mikroskopii konfokalnej.

Główną zaletą tej techniki jest umożliwienie nam uzyskania przestrzennej informacji czasowej na temat zdarzenia sygnalizacyjnego w żywych komórkach. Te pomiary stylu życia pozwalają lepiej zrozumieć, w jaki sposób sieć sygnalizacyjna A-G-P-C-R jest w stanie wykryć składnik atraktantu chemioterapii i wygenerować odpowiednie reakcje. Demonstracją procedury będzie dr Shu, który jest ekspertem w metodach obrazowania stylu życia W celu wygenerowania komórek dium dsco, które są chemotaktyczne do cyklicznego atraktantu chemioterapii A MP zbiera komórki rosnące w pożywce D three trich z kultury wstrząsającej w temperaturze 22 stopni Celsjusza.

Umyć komórki dwukrotnie w niezawierającym składników odżywczych buforze rozwojowym przez odwirowanie w temperaturze 400 g przez pięć minut. W temperaturze pokojowej resus zawiesić komórki w buforze DB o gęstości dwa razy 10 siódmych komórek na mililitr. Przenieś 20 milionów komórek w 10 mililitrach buforu rozwojowego do kolby o pojemności 250 mililitrów, a następnie potrząsaj komórkami w temperaturze 100 RP M w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez godzinę.

Następnie dostarczaj 100 mikrolitrów 7,5 mikromolowego cyklicznego zapasu MP do 10 mililitrów komórek co sześć minut przez następne sześć godzin, aby osiągnąć końcowe stężenie 75 anomolowych cyklicznych A MP. Teraz zbierz kompetentne komórki atraktantu chemioterapii cyklicznego A MP przez odwirowanie, tym razem w temperaturze 200 Gs, a następnie ponownie zawiesić komórki za pomocą buforu DB zawierającego 2,5 milimolową kofeinę. Ponownie potrząśnij komórkami w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez 20 minut. Tym razem przy 200 obr./min, aby nasycić komórki do chemotaksji.

Najpierw napełnij mikropipetę świeżo przygotowanym 30-mililitrowym roztworem jednego mikromolowego cyklicznego A MP i Alexa 5 94 w stężeniu 0,1 mikrograma na mikrolitr w buforze DB. Następnie przymocuj końcówkę Femto do uchwytu na mikropipety i podłącz rurkę do aparatu doprowadzającego ciśnienie. Aby uzyskać stabilny gradient, przymocuj zespół mikropipet do zmotoryzowanego mikromanipulatora.

Napełnij jednostudzienną komorę technologiczną laboratorium sześcioma mililitrami bufora DB, a następnie zamontuj komorę nad 40-krotną soczewką olejową na mikroskopie konfokalnym za pomocą środka optyki Brightfield, końcówka Femto w polu widzenia. Następnie włącz dopływ ciśnienia i ustaw ciśnienie kompensacyjne na 70 hektorowych paskali, aby ustalić gradient cyklicznej mieszaniny A MP Alexa 5 94. Wizualizacja cyklicznego gradientu A MP poprzez monitorowanie mieszaniny pożądanego stężenia cyklicznej fluorescencji A MP i Alexa 5 94 za pomocą wzbudzenia za pomocą linii laserowej o długości 543 nanometrów.

Na koniec użyj funkcji automatycznego pozycjonowania mikromanipulatora, aby ustawić mikropipetę w żądanych pozycjach i ustawić pozycję pierwszą, pozycję drugą i pozycję trzecią, aby manipulować gradientem, na który narażone są komórki. Po podaniu kofeiny należy usunąć porcję komórek i osadzać komórki w temperaturze 500 g przez trzy minuty. W temperaturze pokojowej usuń bufor i rozcieńcz komórki do pięć razy 10 piątych komórek na mililitr.

Ze świeżym buforem DB zawierającym 2,5 milimolową kofeinę. Następnie nanieść jeden mililitr zawiesiny komórek do pojedynczej studzienki. Po pozostawieniu komórek do przylegania przez 10 minut, ostrożnie odpipetuj bufor, aby usunąć nieprzyłączone komórki, a następnie zastąp taką samą objętością świeżego buforu DB z kofeiną, aby rozpocząć obrazowanie, zlokalizuj żądane komórki pod mikroskopem.

Następnie monitorowanie dynamiki składowych sygnalizacyjnych w komórkach wystawionych na stały gradient. Traktuj komórki pięcioma mikromolowymi LA truculentem B przez 10 minut przed jakimikolwiek eksperymentami. Ten schemat pokazuje krótką ścieżkę sygnalizacyjną detekcji kierunkowej w tym filmie.

Można zaobserwować, jak cykliczny gradient A MP indukuje szybką chemotaksję komórek dyskosztowych D, komórek wyrażających sondę three. P-H-G-F-P są wyświetlane na zielono. Gradient wizualizowany przez Alexa 5 94 jest wyświetlany na czerwono. Tu.

Prosta metoda uzyskania liniowej zależności między cyklicznym stężeniem A MP a intensywnością barwnika fluorescencyjnego. Alexa 5 94 przez serię rozcieńczeń dwóch mikromolowych cyklicznych A MP zmieszanych z 10 mikrogramami na mililitr Alexa. Pokazano 5 94.

Następnie przedstawiono graficznie prosty sposób na ustalenie ilościowego pomiaru cyklicznego stężenia A MP gradientu przez intensywność Alexa 5 94. Ten rysunek pokazuje, w jaki sposób komórki, których ruchliwość została stłumiona przez lattrukulent B, inhibitor polimeryzacji aktonów, nadal zachowują zdolność wykrywania kierunkowego. Komórki wyrażają sondę three, P-H-G-F-P i wydają się zielone, podczas gdy gradient w kolorze czerwonym jest wizualizowany przez Lexi 5 94.

W tym filmie można zobaczyć, jak zastosowanie niespolaryzowanego, uproszczonego systemu komórkowego i manipulowalnej cyklicznej stymulacji A MP może rozwiązać podstawowe pytania dotyczące detekcji kierunkowej. Aby zademonstrować zastosowanie obrazowania żywych komórek z rozdzielczością przestrzenną o wysokim tempie, tutaj komórka w kolorze zielonym wykazująca dwufazową ekspresję trzy. W odpowiedzi na ekspozycję na stały cykliczny gradient A MP jest pokazany na czerwono.

Na tym zdjęciu przedstawiono obszary zainteresowania pomiarem kinetyki produkcji three. Kinetyka produkcji 3 z przodu i z tyłu komórek po wystawieniu na stały gradient jest tutaj przedstawiona z produkcją 3 z przodu i z tyłu, reprezentowaną odpowiednio w kolorze czarnym i szarym. Stosując obrazowanie żywych komórek, systematycznie mierzyliśmy dynamikę sieci sygnalizacyjnej specyficznej dla detekcji kierunkowej od cyklicznej stymulacji A MP do produkcji three.

Schemat ten pokazuje sieć sygnalizacyjną detekcji kierunkowej od cyklicznej stymulacji A MP do produkcji trzeciej. Kinetyka każdego składnika jest przedstawiona za pomocą linii w tym samym kolorze. Na tym pierwszym rysunku pokazano, w jaki sposób równomiernie stosowana cykliczna stymulacja A MP wyzwala trwałą aktywację białka G, która wyzwala przejściową produkcję 3, jest przedstawiona w tym filmie.

Tęcza obrazów komórek G i pH pokazuje, że równomiernie stosowana cykliczna stymulacja A MP wyzwala trwałą aktywację białka G na obrzeżach komórki, co jednocześnie wyzwala przejściową produkcję 3. W tym miejscu pokazano kinetykę aktywacji białka G i produkcji 3 po równomiernie zastosowanej cyklicznej stymulacji A MP. Wypróbowując te eksperymenty, należy pamiętać, że kluczem jest uzyskanie komórek reaktywnych, różnego tła genetycznego komórek i warunków środowiskowych.

Warunki akwizycji obrazowania zmieniają fizjologię komórki i mogą sprawić, że komórka będzie mniej wrażliwa. Zgodnie z tą procedurą, modelowanie obliczeniowe może być stosowane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób dynamiczne interakcje w sieci sygnalizacyjnej powodują zachowanie komórki. Metody te torują drogę naukowcom w dziedzinie opodatkowania chemii eukariotycznej.

Możemy opracować model obliczeniowy wykrywania chemoatraktantów. Model ten można wykorzystać do symulacji dynamiki zdarzenia sygnalizacyjnego. Wzajemne oddziaływanie między udoskonalaniem modelu a pomiarem stylu życia może prowadzić do głębszego zrozumienia podatków od chemioterapii.

Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu lepiej rozumiesz, jak zastosować zaawansowaną fluorescencyjną mikroskopię konfokalną do monitorowania zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach. Mam nadzieję, że możesz zastosować tę metodę w swoim badaniu.