In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u Drosophila melanogaster

Napraw muchę z mózgiem odsłoniętym w komorze obrazowania.

Mucha wykazuje ekspresję genetycznie zakodowanego wskaźnika wapnia lub GECI zlokalizowanego w dendrytach ciała grzyba lub neuronach MB.

Połącz muchę z przewodami elektrycznymi i umieść igłę dostarczającą zapach w pobliżu jej anteny.

Dodaj kroplę buforową na odsłonięty mózg, umieść muchę pod mikroskopem i podłącz igłę do systemu dostarczania zapachu.

Pobudź GECI i dostarcz bodziec zapachowy.

Substancja zapachowa wiąże się z receptorami neuronów czuciowych anteny, generując potencjały czynnościowe.

Potencjały czynnościowe rozchodzą się z neuronów czuciowych do neuronów projekcyjnych, indukując uwalnianie neuroprzekaźników i ułatwiając napływ wapnia i fluorescencję GECI w postsynaptycznych neuronach MB.

Powtórz z drugim i trzecim środkiem zapachowym.

Następnie zastosuj pierwszy zapach z porażeniem prądem, a drugi bez.

Na koniec dostarcz trzy zapachy bez wstrząsów. Zapisz fluorescencję.

Zmniejszona fluorescencja w odpowiedzi na bodziec związany z wstrząsem w porównaniu z grupą kontrolną ujawnia plastyczność synaptyczną wywołaną uczeniem się.

Aby zobrazować wskaźniki wapnia oparte na GFP, należy dostroić laser mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w laser na podczerwień i obiektyw zanurzający w wodzie zainstalowany na stole z izolacją drgań do długości fali wzbudzenia 920 nanometrów i zainstalować filtr pasmowo-przepustowy GFP. Za pomocą pokrętła regulacji zgrubnej litery Z przeskanuj oś Z mózgu, aby zlokalizować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania.

Użyj funkcji Crop (Przykadruj), aby ustawić ostrość skanowania tylko na obszarze zainteresowania, aby zminimalizować czas skanowania, i obróć widok skanowania tak, aby przednia część głowy była skierowana w dół. Następnie dostosuj rozmiar klatki do 512 na 512 pikseli i wybierz region do skanowania, biorąc pod uwagę obliczony czas skanowania dla każdej klatki, aby osiągnąć częstotliwość odświeżania co najmniej 4 herców.

W celu wizualizacji stanu przejściowego wapnia wywołanego zapachem, zainicjuj wstępnie zaprogramowany pakiet makro, który może połączyć oprogramowanie do akwizycji obrazu w programie dostarczania zapachu i rozpocznij pomiar w oprogramowaniu mikroskopu na 6,25 sekundy, aby ustalić wartość bazową F0.

W systemie dostarczania zapachów należy dostarczyć 2,5-sekundowy bodziec zapachowy wskazywany tutaj przez podświetlenie diod LED wyzwalane otwieraniem i zamykaniem określonych zaworów kubków zapachowych, a następnie 12,5 sekundy nagrywania na końcu kompensacji zapachu. Następnie powtórz podawanie drugiego i trzeciego środka zapachowego w ten sam sposób.

Aby przeprowadzić warunkowanie asocjacyjne w tej konfiguracji, użyj sterowanego komputerowo systemu dostarczania zapachów, aby przedstawić kondycjonowany bodziec plus zapach przez 60 sekund wraz z wstrząsami elektrycznymi 12-90 V. Po 60-sekundowej przerwie prezentuj sam bodziec kondycjonowany minus zapach przez 60 sekund bez porażenia prądem. Ponownie zmierz przejściowość wapnia wywołaną przez nieprzyjemny zapach po treningu, powtarzając protokół stymulacji zapachu przed treningiem, trzy minuty po zakończeniu fazy treningu