Śledzenie morfogenetycznych deformacji tkanek we wczesnym zarodku piskląt

Ogólnym celem przedstawionych tutaj technik jest znakowanie i hodowla tkanek embrionalnych w celu pomiaru deformacji morfogenetycznej podczas wczesnego rozwoju w celu hodowli wczesnego zarodka pisklęcia, rozpoczynając od usunięcia zarodka z komórki jajowej za pomocą metody nośnika z bibuły filtracyjnej. W zależności od zastosowania eksperymentalnego, wyekstrahowany zarodek należy oznaczyć fluorescencyjnymi barwnikami lipofilowymi dostarczanymi za pośrednictwem magnetycznych cząstek żelaza lub mikrosferami polistyrenu. Następnie śledź znaczniki podczas hodowli za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub obrazowania optycznej koherentnej tomografii.

Obrazowanie uzyskane mapy odkształceń morfogenetycznych wskazują obszary wydłużania, skracania i ścinania tkanek zarówno w dwóch, jak i trzech wymiarach. Cześć, nazywam się Ben Philis i jestem doktorantem w laboratorium dr Larry'ego Tabora na Wydziale Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis. Przed rozpoczęciem tego typu eksperymentów ważne jest, aby wziąć pod uwagę odpowiednie techniki hodowli tkankowej w systemie modelowym, metody obrazowania, do których możesz mieć dostęp, a także rodzaj danych, które chcesz uzyskać z eksperymentów.

Na przykład, czy jesteś zainteresowany analizą deformacji tkanek w dwóch lub trzech wymiarach? Zajmiemy się dzisiaj niektórymi z tych pytań, pokazując dwie uzupełniające się techniki znakowania we wczesnym zarodku pisklęcia. Cześć, nazywam się Victor Varner i pracuję w laboratorium dr Larry'ego Tabora na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis.

W obu tych technikach szybko i jednocześnie znakujemy setki komórek we wczesnym zarodku pisklęcia. Śledzenie ruchu tych etykiet pozwala nam nie tylko określić tkanki, w których te komórki ostatecznie zamieszkują, ale także określić ilościowo deformację na poziomie tkanki, która formuje wczesny zarodek. Najpierw wysiaduj jaja w orientacji wzdłużnej do pożądanego etapu, jak określono przez hamburgera i Hamiltona.

Rozbij spód jajka na boku 150-milimetrowej szalki Petriego. Rozsuń skorupkę od dołu, opróżnij zawartość jajka do naczynia i za pomocą kleszczy usuń z żółtka grubszą lepką albuminę. Teraz przebij otwory przez środek okrągłej bibuły filtracyjnej.

Umieść jeden z pierścieni bibuły filtracyjnej na żółtku tak, aby zarodek był widoczny przez środkowy otwór pierścienia. Przyciąć na zewnętrznym obwodzie pierścienia bibuły filtracyjnej za pomocą mikronożyczek. Następnie usuń papier z dołączonym zarodkiem z żółtka za pomocą cienkich kleszczy i delikatnie namocz zarodek w kąpieli PBS Aby usunąć przylegające cząstki żółtka, przenieś zespół bibuły filtracyjnej do 35-milimetrowej naczynia hodowlanego.

Umieszczając go brzuszną stroną do góry, wyślij zarodek z drugim pierścieniem z bibuły filtracyjnej. Zabezpiecz go metalowym pierścieniem i zanurz zarodek w pożywce hodowlanej. Jeśli zarodek nie jest całkowicie zanurzony, geometria tkanki i późniejsza morfogeneza mogą być znacznie zmienione przez nienormalnie wysokie obciążenia napięciem powierzchniowym.

Podczas hodowli, przy użyciu mikroskopu jasnego pola, sprawdź prawidłową morfologię i stadium zarodkowe. Najpierw weź niewielką ilość żelaza w proszku i dodaj kilka kropli nasyconego barwnika i alkoholu, a następnie wysusz na powietrzu końcówką wyciągniętej mikropipety. Rozbij zbrylone cząsteczki żelaza i przenieś je do mikroprobówki wirówkowej.

Po kilku płukaniach pokrytych zjonizowaną wodą, pobrany zarodek znajduje się na grzbiecie w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym pokrytym obfitą warstwą pożywki hodowlanej. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj szklanej igły, aby usunąć błonę vilin i odsłonić komórki elektrodermalne. Teraz narysuj kolumnę oznaczonych cząstek żelaza do pipety peor.

Za pomocą mikroskopu preparacyjnego zanurz pipetę tak, aby znajdowała się tuż nad zarodkiem. Powoli obracaj pipetę w przód iw tył między opuszkami palców, aby rozsypać cząstki po zarodku. Po 10 minutach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza usuń cząstki za pomocą silnego magnesu.

W razie potrzeby przymocuj magnes do magnetycznej pary cienkich kleszczy i użyj namagnesowanych kleszczyków, aby ostrożnie usunąć wszelkie resztki cząstek żelaza. Przystąp do pozyskiwania zarówno obrazów jasnego, jak i fluorescencyjnych zarodka. Z igłą o rozmiarze 22.

Pobrać roztwór czarnych mikrosfer o średnicy 10 mikrometrów z PBS do strzykawki o pojemności 10 cm3. Następnie skosuj końcówki wyciągniętych szklanych igieł za pomocą dysku twardego komputera i wypełnij roztworem kulek. Delikatnie potrząśnij mikropipetą, aby roztwór dotarł do końcówki za pomocą mikromanipulatora.

Umieścić szklaną igłę w tym samym polu widzenia co zarodek. Potwierdź wypływ kulek z końcówki pipety. Teraz włóż końcówkę pipety do światła rurki mózgowej.

Uważając, aby nie przebić dna brzusznego tkanki. Monitoruj przejściowy obrzęk tkanki, gdy kulki i płyn dostają się do światła. Następnie szybko wyjmij szklaną igłę.

Na koniec sprawdź wystarczającą gęstość kulek w wewnętrznym świetle rurki mózgowej. Używając mikroskopu jasnego pola, pozwól kulkom osiąść przez 20 do 30 minut przed uzyskaniem obrazów jasnego pola lub zestawu danych optycznej tomografii koherentnej. Po uzyskaniu pierwszych obrazów umieść do 7 35-milimetrowych szalek hodowlanych próbek na 150-milimetrowej szalce Petriego i umieść cały zestaw w małej plastikowej torbie.

Dodaj krople wody dejonizowanej do worka w celu nawilżenia, a następnie napełnij worek mieszaniną 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Umieść zarodki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza do następnego punktu czasowego obrazowania, umieść oznaczone zarodki w szalce delta T zawierającej 1,2 mililitra pożywki hodowlanej i przykryj naczynie szklaną pokrywką utrzymywaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza, Super połącz zarodek z mieszaniną gazów 95% O2 5% CO2 dostarczaną z urządzenia o zmiennym przepływie mini pompy. Teraz skonfiguruj oprogramowanie tak, aby automatycznie pobierało obrazy, które wymagają interwałów czasowych.

W trakcie eksperymentu etykiety mogą być śledzone automatycznie lub ręcznie, a mapy morfogenetyczne szczepów mogą być obliczane dla współrzędnych znaczników. W tym przypadku technika cząstek żelaza została wykorzystana do znakowania i śledzenia ruchu komórek elektrodermalnych podczas tworzenia fałdu głowy. We wczesnym zarodku pisklęcia znakowane fluorescencyjnie komórki były rozmieszczone w całym zarodku.

Obrazy zarodka w jasnym polu i fluorescencyjne zostały uchwycone w różnych odstępach czasu podczas hodowli ex ovo. Do monitorowania ruchów etykiet traktów. Dane skumulowane pozwalają na obliczenie zmieniającego się rozkładu szczepów morfogenetycznych podczas tworzenia fałdu głowy.

Podobnie, technika mikrosfery polistyrenowej została wykorzystana do śledzenia ruchów tkanek na środkowej granicy tylnej półmózgowia wczesnego mózgu piskląt. Należy pamiętać, że ta metoda jest w stanie poradzić sobie z wyraźną deformacją 3D, ponieważ koraliki mają tendencję do przyklejania się ze wszystkich stron wewnętrznego światła mózgu. Po śledzeniu ruchów ściegu przez sześć godzin, współrzędne znacznika umożliwiają obliczenie odkształceń, charakteryzujących deformację tkanki w kierunku podłużnym i obwodowym.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o niektórych krokach eksperymentalnych wymaganych do wdrożenia własnej hodowli tkankowej i etykietowania. Przedstawione tutaj techniki protokolarne są szczególnie korzystne, ponieważ są minimalnie inwazyjne dla tkanek natywnych, a także obejmują tanie i łatwo dostępne materiały. Eksperymenty te są szczególnie przydatne w badaniach nad mechaniką rozwoju embrionalnego.

Ponieważ pola deformacji obliczone przy użyciu śledzonego ruchu znakowanych komórek mogą być wykorzystywane zarówno do testowania, jak i konstruowania fizycznych modeli morfogenezy.