Name: Śledzenie morfogenetycznych deformacji tkanek we wczesnym zarodku piskląt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj techniki etykietowania i hodowli tkanek zarodków kurzych w celu śledzenia deformacji morfogenetycznych. Metody umożliwiają wysokorozdzielcze obrazowanie zmian tkanek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty NIH R01 GM075200 oraz R01 HL083393 (LAT). Dziękujemy za wsparcie stypendialne dla BAF z NIH T90 DA022871 oraz Mallinckrodt Institute of Radiology, a także dla VDV z grantu 09PRE2060795 z American Heart Association.

1. Ogólne przygotowanie eksperymentalne
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę do hodowli tkankowych w komorze z laminarnym przepływem powietrza. 
		<ol>
			<li>Rozcieńcz pożywkę Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (butelka 1 L z 4,5g/L glukozy, wodorowęglanem sodu i L-glutaminą). Dodaj 10 mL antybiotyków penicylina / streptomycyna / neomycyna.</li>
			<li>Pobierz 100 mL DMEM za pomocą sterylnej pipety transferowej i zastąp je 100 mL surowicy z kurczaka.</li>
			<li>Rozdziel DMEM/10% surowicy z kurczaka/1% antybiotyków do sterylnych stożkowych probówek o pojemności 15 mL i zamroź.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) uzupełniony o wapń i magnez. Wymieszaj 100 mL 10X PBS, 900 mL wody dejonizowanej oraz 1 mL stężonego roztworu wapnia i magnezu (100 mg/mL CaCl2•2H2O, 100mg/mL MgCl2•6H2O).</li>
	<li>Inkubuj jaja w orientacji podłużnej do pożądanego stopnia rozwoju zgodnie z klasyfikacją Hamburgera i Hamiltona1 (np. 23-25 godzin dla stadium HH5 lub 42-48 godzin dla stadiów HH11-12).</li>
	<li>Wyjmij embriony z jaja, stosując metodę nośnika z papieru filtrowanego.
		<ol>
			<li>Rozbij dno jaja o krawędź szalki Petriego o średnicy 150 mm. Odłam skorupkę od dołu i wlej zawartość jaja do szalki.</li>
			<li>Usuń z jaja gęste, lepkie białko za pomocą pęsety tępej.</li>
			<li>Wytnij z papieru filtrowanego Whatman nr 2 kółka o średnicy 2-3 cm. Używając dziurkacza jednootworowego, wykonaj otwory w środku papieru filtrowanego. Połóż jeden z pierścieni z papieru na żółtku w taki sposób, aby embrion był widoczny przez centralny otwór w pierścieniu.</li>
			<li>Wytnij wzdłuż zewnętrznej średnicy papieru filtrowanego za pomocą mikronarzędzi tnących. Usuń papier z żółtka za pomocą precyzyjnej pęsety.</li>
			<li>Delikatnie opłucz embrion w PBS, aby usunąć przylegające cząsteczki żółtka. (Embriony w stadium HH5 mogą wymagać namaczania przez 15-20 minut w celu usunięcia resztek żółtka). Wyjmij zestaw z papieru filtrowanego z kąpieli i połóż go stroną brzuszną do góry w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm. Połóż drugi pierścień z papieru filtrowanego na pierwszym, tak aby embrion znalazł się pomiędzy pierścieniami. Umieść metalowy pierścień wokół zewnętrznej strony „kanapki” z papieru filtrowanego (średnica ≈ 1,5 - 2 cm), aby zabezpieczyć embrion.</li>
			<li>Zanurz embrion w pożywce hodowlanej. Zweryfikuj poprawność morfologii i stadium embrionalne za pomocą mikroskopu w polu jasnym.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Użyj wyciągacza pipet do przygotowania szklanych igieł z cienką końcówką (średnica wewnętrzna 1,5 mm) (World Precision Instruments, Sarasota FL) do późniejszych sekcji tkanek i znakowania.</li>
</ol>
2. Znakowanie zarodków w stadium 5 HH barwnikiem DiI przy użyciu magnetycznych cząsteczek żelaza
<ol>
<li>Do niewielkiej ilości proszku żelaznego (żelazo zredukowane, Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) w temperaturze pokojowej dodać kilka kropli nasyconego roztworu DiI w alkoholu i pozostawić do wyschnięcia. (Zwykle powoduje to zlepianie się cząsteczek po odparowaniu alkoholu). Za pomocą końcówki dociąganej mikropipety rozbić grudki cząsteczek żelaza, przenieść je do probówki do mikrocentryfugi, kilkakrotnie wypłukać i przykryć wodą dejonizowaną.</li>
<li>Aby oznakować komórki ektodermy w embrionie w stadium HH 5, umieścić pobrany embrion (tj. cały zestaw na papierze filtrowacyjnym) stroną grzbietową do góry w 35 mm szalce hodowlanej pokrytej obfitą warstwą pożywki i ustawić szalkę pod mikroskopem stereologicznym. Za pomocą szklanej igły usunąć błonę witelinową i odsłonić komórki ektodermy. (Należy uważać, aby nie przebić embrionu).</li>
<li>Nabrać kolumnę oznakowanych cząsteczek żelaza (w wodzie dejonizowanej) do pipety Pasteura. Korzystając z mikroskopu stereologicznego, zanurzyć końcówkę pipety pod powierzchnią cieczy i ustawić bezpośrednio nad embrionem. Powoli tocząc pipetę między palcami, wytrząsnąć cząsteczki z pipety i rozsypać je na embrionie.</li>
<li>Gdy embrion zostanie pokryty cząsteczkami, ostrożnie umieścić go w inkubatorze w temperaturze 37°C na około 10 minut. Wyjąć embrion z inkubatora i usunąć cząsteczki za pomocą silnego magnesu.</li>
<li>Użyć mikroskopu fluorescencyjnego z podłączoną kamerą wideo i odpowiednimi ustawieniami filtrów, aby uzyskać obrazy embrionu w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym, jak pokazano na rysunku 2A,B.</li>
<li>Ocenić gęstość oznakowania. Jeśli pożądane jest gęstsze rozmieszczenie, ponownie oznakować embrion dodatkowymi cząsteczkami (zgodnie z powyższym opisem) i odpowiednio wydłużyć czas inkubacji. Jeśli oznakowanie jest zbyt gęste, dodać niewielką ilość nieoznakowanych cząsteczek żelaza do probówki do mikrocentryfugi wypełnionej już oznakowanymi cząsteczkami i wymieszać zawartość probówki. Powtórzyć proces oznakowania na nowym embrionie i ponownie ocenić gęstość oznakowania.</li>
</ol>
3. Znakowanie mikro sfer polistyrenowych do obrazowania optycznej koherentnej tomografii (OCT) zarodków HH11-12
<ol>
<li>Przygotować w 35 mm szalce Petri roztwór czarnych mikrosfer o średnicy 10 μm (Polysciences Inc., Warrington, PA) w PBS. (Kuleczki powinny być na tyle duże, aby zapewnić kontrast w obrazowaniu OCT, ale jednocześnie na tyle małe, aby ich rozmiar był zbliżony do rozmiaru pojedynczych komórek. Konkretne wartości będą zależeć od rozdzielczości systemu OCT oraz badanych tkanek). Zazwyczaj wystarczy jedna kropla roztworu stokowego (2,6% ciał stałych-lateksu) na 1 mL PBS. Nabrać ten roztwór do strzykawki 10cc za pomocą igły o rozmiarze 22 G. Wymieszać roztwór w wortexie przez 30 sekund, aby zapewnić jednorodne rozmieszczenie kuleczek.</li>
<li>Uciąć pod kątem końcówki wyciągniętych igieł szklanych, używając talerza dysku twardego komputera2. Średnica końcówki powinna być na tyle duża, aby kuleczki mogły przejść przez otwór, ale jednocześnie jak najmniejsza, aby zminimalizować uszkodzenie tkanki podczas wstrzykiwania.</li>
<li>Napełnić ściętą igłę szklaną roztworem kuleczek za pomocą strzykawki. Delikatnie opukać mikropipetę, aby upewnić się, że roztwór dotarł do końcówki.</li>
<li>Za pomocą mikromanipulatora umieścić igłę szklaną w tym samym polu widzenia co embrion. Kuleczki powinny wypływać z końcówki pipety.<ol>
<li>Jeśli z mikropipety nie wypływają kuleczki, może to oznaczać zator. W takim przypadku powtórzyć kroki 3.2-3.4 z nową igłą szklaną.</li>
<li>Jeśli zbyt wiele kuleczek przysłania pole widzenia, końcówka pipety może być zbyt szeroka. Powtórzyć kroki 3.2-3.4 z nową pipetą i nowym embrionem.</li></ol></li>
<li>Wprowadzić końcówkę pipety do światła rurki mózgowej. Należy uważać, aby nie przebić brzusznej strony tkanki. Podczas wprowadzania kuleczek i cieczy do światła zaobserwowane zostanie przejściowe obrzęknięcie tkanki. Oznacza to poprawną intubację; należy wówczas szybko wycofać igłę szklaną.</li>
<li>Zweryfikować pod mikroskopem w świetle przechodzącym, czy w świetle rurki mózgowej znajduje się wystarczająca gęstość kuleczek. Pozostawić kuleczki do osadzenia się na 20 - 30 minut przed przejściem do sekcji 4.</li>
</ol>
4. Pozyskiwanie danych
* Poniższe metody dobrze nadają się do opisanej powyżej techniki znakowania fluorescencyjnego. Jednak w przypadku techniki znakowania mikrośferami, kuleczki mogą się odczepić podczas przenoszenia próbek między inkubatorami a systemami obrazowania. W takim przypadku najlepiej przejść bezpośrednio do kroku 4.2 (co pozwala całkowicie uniknąć przemieszczania/wstrząsania próbką). W obu metodach embriony są hodowane w pełnym zanurzeniu w płynnej pożywce hodowlanej. Jeśli embrion nie jest całkowicie zanurzony (co ma miejsce w niektórych konwencjonalnych technikach hodowli tkanek), geometria tkanki ulega znacznym zmianom z powodu nienaturalnie wysokiego napięcia powierzchniowego, a rozkłady odkształceń nie oddadzą dokładnie przebiegu normalnej morfogenezy 3-D3, 4. Co więcej, zanurzenie tkanki zapobiega maskowaniu morfologii embrionu i współrzędnych markerów przez silny kontrast obserwowany na granicy fazy ciekłej i gazowej podczas obrazowania OCT. 
<ol>
<li>Kultura zarodków (ogólna)<ol>
<li>Po uzyskaniu pierwszych obrazów (w świetle przechodzącym, fluorescencji lub OCT), umieść do siedmiu szalek hodowlanych 35 mm (z zarodkami) w szalce Petriego 150 mm i włóż cały zestaw do małej plastikowej torebki. Dodaj do torebki kilka kropli wody dejonizowanej w celu nawilżenia i napełnij torebkę mieszaniną 95% O2 / 5% CO2. Umieść zarodki w inkubatorze w temperaturze 37°C (Queue Stabiletherm, Asheville, NC) na wymagany czas aż do kolejnego punktu czasowego obrazowania. Stosując tę metodę, eksperymenty można przeprowadzić na wielu zarodkach tego samego dnia.</li></ol></li>
<li>Kultura time-lapse (zautomatyzowana)<ol>
<li>Umieść oznakowane zarodki w szalce Delta T (średnica zewnętrzna 35 mm, otwór centralny 23 mm ze zwężającą się ścianką boczną, szkło o grubości 0,17 mm; Bioptechs, Butler, PA) zawierającej 1,2 mL pożywki hodowlanej.</li>
<li>Przykryj szalkę szklaną pokrywką utrzymywaną w temperaturze 37°C za pomocą kontrolera szalek hodowlanych Bioptechs Delta T4 (aby zapobiec kondensacji). Przepływaj nad zarodkiem mieszaninę gazową 95% O2 / 5% CO2 dostarczaną przez urządzenie Mini-Pump Variable Flow (Fisher Scientific). Przed dotarciem do zarodka podgrzej i nawilż gaz, przepuszczając go przez wodę dejonizowaną na ciepłej (&lt;100°C) płycie grzejnej. Schemat tego układu eksperymentalnego przedstawiono na Rysunku 1.</li>
<li>Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby automatycznie pozyskiwało obrazy w określonych przez użytkownika odstępach czasu. W przypadku naszego mikroskopu fluorescencyjnego używamy oprogramowania Openlab (PerkinElmer, Waltham, MA), a w przypadku systemu OCT używamy oprogramowania swept source Thorlabs (Newton, NJ). Ponieważ ta metoda pozwala obecnie na przeprowadzenie tylko jednego eksperymentu time-lapse w danym czasie, najlepiej jest często pozostawić tego typu kultury na noc. Można obejść to ograniczenie, instalując zautomatyzowany stolik przesuwny kompatybilny zarówno z sprzętem, jak i oprogramowaniem systemu obrazowania5.</li></ol></li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Etykiety są śledzone automatycznie (przy użyciu oprogramowania Volocity, PerkinElmer) lub ręcznie (przy użyciu wtyczki Manual Tracking w programie ImageJ, NIH) w każdym eksperymencie. W technice znakowania fluorescencyjnego stosujemy rutynę Matlab gridfit do dopasowania powierzchni 2D do współrzędnych markerów, co umożliwia obliczenie odkształceń powierzchni morfogenetycznych6, 7. Do przekształcenia tych wartości w odpowiedni układ współrzędnych embrionalnych stosowane są standardowe równania. Alternatywnie, w technice OCT, powierzchnie są generowane z segmentowanych objętości obrazu (uzyskanych za pomocą standardowego oprogramowania, takiego jak Matlab lub Caret8), a odkształcenia mogą być obliczane w kierunku maksymalnego lub minimalnego zakrzywienia próbki9.
Wykorzystaliśmy naszą technikę z użyciem cząsteczek żelaza do znakowania i śledzenia ruchu komórek ektodermalnych podczas formowania się fałdu głowowego we wczesnym embrionie kurczaka. Jak pokazano na rysunku 2A, komórki znakowane fluorescencyjnie zostały rozmieszczone w całym embrionie. Obrazy embrionu w świetle przechodzącym i fluorescencyjne wykonano w różnych odstępach czasu podczas hodowli ex ovo. Ruchy śledzonych znaczników (rys. 2B,C) posłużyły następnie do obliczenia ewoluujących rozkładów odkształceń morfogenetycznych podczas formowania się fałdu głowowego (rys. 2D-F).
Podobnie, nasza technika z użyciem polistyrenowych mikrosfer została wykorzystana do śledzenia ruchów tkanek na granicy śródmózgowia i tylnego mózgowia wczesnego zarodka kurczaka. Jak pokazano na rysunku 3 B-D, ruchy kulek śledzono przez 6 godzin, a na podstawie współrzędnych markerów obliczono odkształcenia charakteryzujące deformację tkanki w kierunkach podłużnym i obwodowym. Należy zauważyć, że metoda ta pozwala na analizę wyraźnych deformacji 3-D, ponieważ kuleczki mają tendencję do przylegania do wszystkich ścian wewnętrznego światła mózgu (rys. 3A). 
<img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig1.jpg" alt="Schemat systemu perfuzji do inkubacji embrionów z kontrolą temperatury i przepływem mieszaniny gazów." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Schemat układu do hodowli tkankowej w technice time-lapse.
<img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig2.jpg" alt="Schemat rozwoju zarodkowego; pola wektorowe, linia pośrodkowa, fałd głowy, analiza konturów w czasie." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Ilościowe określanie dwuwymiarowych odkształceń tkanek we wczesnym zarodku kury z wykorzystaniem śledzonych znaczników fluorescencyjnych. (A) Zestawienie obrazu w jasnym polu i obrazu fluorescencyjnego zarodka w stadium HH 5 po usunięciu cząsteczek żelaza. Komórki ektodermalne znakowane DiI (czerwone) są rozmieszczone w całym zarodku. (B,C) Ruch znakowanych komórek śledzono przy użyciu programu ImageJ. Przesunięcia znaczników obliczono w układzie współrzędnych zarodka (X,Y). Należy zauważyć, że A i B to ten sam obraz. (D-F) Wykresy konturowe ewoluujących rozkładów odkształceń wzdłużnych podczas formowania się fałdu głowy. Lagrangianowskie odkształcenia wzdłużne obliczono względem stadium HH 5 (tj. A i B) po (D) 75 min, (E) 120 min i (F) 165 min inkubacji. Odkształcenia te charakteryzują zmiany długości elementów liniowych pierwotnie zorientowanych wzdłuż osi Y (w zarodku w stadium 5). Dalsze szczegóły dotyczące wykorzystania współrzędnych śledzonych znaczników do obliczania odkształceń morfogenetycznych znajdują się w pracach Filas et al. (2007)6 oraz Varner et al. (2010)7. Należy zauważyć, że C i F to ten sam obraz. Pasek skali = 500 μm.
<img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig3.jpg" alt="Dynamika i deformacja komórkowa; obrazy mikroskopowe; schemat z mapami naprężeń Ezz, Eθθ; analiza danych." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Ilościowe określanie trójwymiarowych deformacji tkanek w wczesnym mózgu kurczaka. (A) Polistyrenowe mikrosfery przylegające do strony grzbietowej (czarna strzałka) i brzusznej (biała strzałka) rurki mózgowej są łatwo rozróżnialne od tkanek otaczających w przekroju poprzecznym. Widoki brzuszne rekonstrukcji OCT pokazują położenie mikrosfer w pobliżu granicy śródmózwia i rombencefalonu w stadium (B) HH12 oraz po (C) 6 h inkubacji (M: śródmózwie, H: rombencefalon). Zaznaczono kilka grup kulek, aby wyróżnić ogólną deformację tkanki. (D) Obliczono podłużne (Ezz) i obwodowe (Eθθ) odkształcenia Lagrange'a na podstawie tych deformacji. Dodatnie odkształcenia podłużne i ujemne obwodowe na granicy śródmózwia i rombencefalonu odzwierciedlają osiowe wydłużenie i obwodowe skrócenie tego regionu podczas hodowli. Dalsze szczegóły dotyczące obliczania odkształceń morfogenetycznych dla złożonych powierzchni podczas morfogenezy znajdują się w pracy Filas et al. (2008)9. Pasek skali = 200 μm.

<ol><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+beveling+micropipettes+using+a+computer+hard+drive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dry beveling micropipettes using a computer hard drive.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).</li>
<li>Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+looping+in+experimental+conditions%3A+the+effects+of+extraembryonic+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces.</a> Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).</li>
<li>Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+as+a+regulator+of+cytoskeletal+contractility+and+nuclear+shape+in+embryonic+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia.</a> Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).</li>
<li>Kozel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+fiber+formation%3A+a+dynamic+view+of+extracellular+matrix+assembly+using+timer+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters.</a> J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).</li>
<li>Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+as+a+tool+for+measuring+morphogenetic+deformation+of+the+looping+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart.</a> Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).</li>
<li>Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+head+fold+formation%3A+investigating+tissue-level+forces+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development.</a> Development. 137, 3801-3811 (2010).</li>
<li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+software+suite+for+surface-based+analyses+of+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Med.+Inform.+Assoc%22%5BJournal%5D)">An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex.</a> J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).</li>
<li>Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+measuring+deformation+of+folding+surfaces+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis.</a> J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).</li>
<li>Yuan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-registered+optical+coherence+tomography+and+fluorescence+molecular+imaging+for+simultaneous+morphological+and+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging.</a> Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).</li>
<li>Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+image-based+method+for+computational+tissue+fate+mapping+during+early+avian+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis.</a> Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).</li>
<li>Blanchard, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+tectonics%3A+morphogenetic+strain+rates%2C+cell+shape+change+and+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation.</a> Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Przedstawiono dwie techniki znakowania tkanek dla hodowli ex ovo wczesnych embrionów kurzych. Pierwsza z nich wykorzystuje fluorescencyjne barwniki lipofilowe dostarczane za pomocą magnetycznych cząstek żelaza w celu jednoczesnego znakowania setek komórek. Metoda ta nie jest jednak obecnie kompatybilna z optyczną tomografią koherencyjną, ponieważ barwniki fluorescencyjne wykazują zazwyczaj niewielki kontrast względem otaczających tkanek w badaniu OCT10. Przedstawiono zatem alternatywną technikę z wyko...

<table><tbody><tr><td>DMEM &amp;mdash; wysoka zawartość glukozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna/Neomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kurzyka</td><td>Invitrogen</td><td>16110-082</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td>10X</td></tr><tr><td>Papier filtracyjny Whatman #2</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1002 090</td><td>średnica 90mm</td></tr><tr><td>Szklane mikropipety</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW150-6</td><td>średnica wewnętrzna 1.5mm</td></tr><tr><td>DiI</td><td>Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>Żelazo zredukowane</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>5320</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosfery o średnicy 10 &amp;mu;m (czarne)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>24294</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Delta T (do hodowli w trybie time-lapse)</td><td>Bioptechs</td><td>04200415B</td><td>grubość 0.17mm, czarna</td></tr><tr><td>Kontroler szalek hodowlanych Delta T4</td><td>Bioptechs</td><td>0420-4-03</td><td></td></tr><tr><td>Minipompa o zmiennym przepływie</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Śledzenie deformacji tkankowych w procesach morfogenetycznych we wczesnym zarodku kurczaka

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo 

Nabłonk de embrionalne ulegają złożonym deformacjom (np. zginaniu, skręcaniu, fałdowaniu i rozciąganiu), aby utworzyć pierwotne organy wczesnego zarodka. Śledzenie markerów fiducjalnych na powierzchniach tych arkuszy komórkowych jest uznaną metodą szacowania wielkości morfogenetycznych, takich jak wzrost, kurczenie się i ścinanie. Jednak nie wszystkie techniki znakowania powierzchni są łatwo dostosowalne do konwencjonalnych metod obrazowania i każda z nich posiada inne zalety oraz ograniczenia. W niniejszej pracy opisujemy dwie metody znakowania i ilustrujemy użyteczność każdej z nich. W pierwszej metodzie setki znaczników fluorescencyjnych są aplikowane jednocześnie do zarodka przy użyciu magnetycznych cząsteczek żelaza. Znaczniki te są następnie wykorzystywane do ilościowej oceny dwuwymiarowych (2-D) deformacji tkanki podczas morfogenezy. W drugiej metodzie mikrosfery polistyrenowe są wykorzystywane jako środki kontrastowe w nieinwazyjnym obrazowaniu metodą optycznej koherentnej tomografii (OCT) w celu śledzenia trójwymiarowych (3-D) deformacji tkanki. Techniki te zostały z sukcesem wdrożone w naszym laboratorium do badania fizycznych mechanizmów rozwoju wczesnego fałdu głownego, serca i mózgu i powinny być możliwe do dostosowania do szerokiego zakresu procesów morfogenetycznych.

Niniejszy artykuł opisuje znakowanie powierzchniowe oraz hodowlę tkanek ex ovo we wczesnym embrionie kurczaka. Przedstawiono techniki umożliwiające obrazowanie w jasnym polu, fluorescencyjne oraz z wykorzystaniem tomografii optycznej koherencyjnej w trybie time-lapse. Śledzenie znaczników powierzchniowych z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną pozwala na obliczenie wielkości kinematycznych, takich jak odkształcenia morfogenetyczne, zarówno w dwóch, jak i w trzech wymiarach.

Nabłonkii zarodkowe ulegają złożonym deformacjom (np. wyginaniu, skręcaniu, fałdowaniu i rozciąganiu), aby utworzyć pierwotne organy wczesnego zarodka. ...

Ogólnym celem przedstawionych tutaj technik jest znakowanie i hodowla tkanek embrionalnych w celu pomiaru deformacji morfogenetycznych podczas wczesnego rozwoju. W przypadku hodowli wczesnego zarodka kurczaka, należy rozpocząć od usunięcia zarodka z jaja przy użyciu metody przenoszenia na papierze filtracyjnym. W zależności od zastosowania eksperymentalnego, należy oznakować wyizolowany zarodek fluorescencyjnymi barwnikami lipofilowymi dostarczanymi za pomocą magnetycznych cząstek żelaza lub mikrosferami polistyrenowymi. Następnie należy śledzić znaczniki podczas hodowli, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną lub obrazowanie metodą optycznej koherencyjnej tomografii.Obrazowanie wynikających z tego map odkształceń morfogenetycznych wskazuje obszary wydłużania, skracania i ścinania tkanki w dwóch i trzech wymiarach. Cześć, nazywam się Ben Philis i jestem doktorantem w laboratorium dr. Larry'ego Tabora w Katedrze Inżynierii Biomedycznej na Washington University in St.Louis. Przed rozpoczęciem tego typu eksperymentów ważne jest rozważenie odpowiednich technik hodowli tkanek w systemie modelowym, dostępnych metod obrazowania, a także rodzaju danych, które chcą Państwo uzyskać z przeprowadzonych badań.Na przykład, czy interesuje Państwa analiza deformacji tkanek w dwóch lub trzech wymiarach? Odpowiemy na niektóre z tych pytań, prezentując dwie komplementarne techniki znakowania we wczesnym zarodku kurczaka. Witam, nazywam się Victor Varner i pracuję w laboratorium dr. Larry'ego Tabora na Washington University w St. Louis.W obu tych technikach szybko i jednocześnie znakujemy setki komórek we wczesnym zarodku kurczaka. Śledzenie ruchu tych znaczników pozwala nam nie tylko określić tkanki, w których komórki te ostatecznie się osiedlają, ale także ilościowo ocenić deformacje na poziomie tkankowym, które kształtują wczesny zarodek. Najpierw inkubuj jaja w orientacji podłużnej do pożądanego stadium zgodnie z klasyfikacją Hamburgera i Hamiltona.Rozbij dno jaja o krawędź szalki Petriego o średnicy 150 milimetrów. Odsuń skorupkę od dna, przelej zawartość jaja do szalki, a następnie za pomocą pęsety tępowej usuń gęstsze, lepkie białko z żółtka. Następnie wykonaj otwory w środku okrągłego papieru filtracyjnego.Umieść jeden z pierścieni z papieru filtracyjnego na żółtku w taki sposób, aby embrion był widoczny przez centralny otwór pierścienia. Przytnij zewnętrzny obrys pierścienia z papieru filtracyjnego za pomocą mikronozyczek. Następnie usuń papier z przytwierdzonym embrionem z żółtka za pomocą precyzyjnych pincet i delikatnie zanurz embrion w kąpieli z PBS. Aby usunąć przylegające cząsteczki żółtka, przenieś zespół z papierem filtracyjnym do 35 milimetrowej szalki hodowlanej.Kładąc go stroną brzuszna do góry, zabezpiecz zarodek drugim pierścieniem z papieru filtracyjnego. Przymocuj go metalowym pierścieniem i zanurz zarodek w pożywce hodowlanej. Jeśli zarodek nie zostanie całkowicie zanurzony, geometria tkanki i późniejsza morfogeneza mogą ulec znacznym zmianom z powodu nienaturalnie wysokiego napięcia powierzchniowego.Podczas hodowli, używając mikroskopu w polu jasnym, należy zweryfikować prawidłową morfologię oraz stadium embrionalne. Najpierw pobierz niewielką ilość proszku żelaznego, dodaj kilka kropel nasyconego barwnika i alkoholu, a następnie wysusz na powietrzu za pomocą końcówki dociągniętej mikropipety. Rozbij skupione cząsteczki żelaza i przenieś je do probówki do mikrocentryfugi.Po kilkukrotnym płukaniu wodą zjonizowaną, zebrany embrion umieść grzbietem do góry w 35 milimetrowej szalce hodowlanej, pokrytej obfitą warstwą pożywki. Pod mikroskopem stereotypowym, za pomocą szklanej igły, usuń błonę vilin i odsłoń komórki elektrodermalne. Następnie nabierz kolumnę znakowanych cząsteczek żelaza do pipety Pasteura.Używając mikroskopu stereoskopowego, zanurz pipetę tak, aby znajdowała się tuż nad embrionem. Powoli przesuwaj pipetę przód-tył między opuszkami palców, aby rozprowadzić cząsteczki na embrionie. Po 10 minutach inkubacji w temperaturze 37 °C usuń cząsteczki za pomocą silnego magnesu.W razie potrzeby przymocuj magnes do precyzyjnej pęsety magnetycznej i za pomocą namagnesowanej pęsety ostrożnie usuń wszelkie pozostałe cząsteczki żelaza. Następnie wykonaj obrazy zarodka w jasnym polu oraz w fluorescencji. Używając igły o rozmiarze 22 G.Naciągnij roztwór czarnych mikrosfer o średnicy 10 µm w PBS do strzykawki o pojemności 10 cc. Następnie ścinij końcówki wyciągniętych szklanych igieł, używając dysku twardego komputera, i napełnij je roztworem kulek. Delikatnie stuknij mikropipetę, aby roztwór dotarł do końcówki, posługując się mikromanipulatorem.Umieścić szklaną igłę w tym samym polu widzenia co embrion. Potwierdzić wypływ kulek z końcówki pipety. Następnie wprowadzić końcówkę pipety do światła rurki mózgowej.Należy uważać, aby nie przebić brzusznej ściany tkanki. Monitoruj przejściowe obrzęki tkanki w momencie wprowadzania kulek i płynu do światła naczynia. Następnie szybko wyjmij szklaną igłę.Na koniec należy zweryfikować, czy w wewnętrznym świetle rurki mózgowej uzyskano wystarczającą gęstość kulek. Przy użyciu mikroskopu w świetle przechodzącym należy odczekać od 20 do 30 minut, aż kulki opadną, przed wykonaniem obrazów w świetle przechodzącym lub zestawu danych optycznej tomografii koherentnej. Po wykonaniu pierwszych obrazów należy umieścić do 7 szalek hodowlanych o średnicy 35 mm z próbkami w szalce Petriego o średnicy 150 mm, a następnie całe zestaw umieścić w małej plastikowej torebce.Do worka dodaj krople wody dejonizowanej w celu nawilżenia, a następnie napełnij worek mieszaniną 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Umieść zarodki w inkubatorze o temperaturze 37°C do czasu kolejnego punktu czasowego obrazowania. Przenieś oznakowane zarodki do szalki delta T zawierającej 1,2 ml pożywki hodowlanej i przykryj szalkę szklaną pokrywką utrzymywaną w temperaturze 37°C. Przeprowadzaj superfuzję zarodka mieszaniną gazów 95% O2 i 5% CO2 dostarczaną z urządzenia do regulacji przepływu typu minipompa. Następnie skonfiguruj oprogramowanie do automatycznego pozyskiwania obrazów w wybranych odstępach czasu.W trakcie eksperymentu znaczniki mogą być śledzone automatycznie lub ręcznie, a dla współrzędnych markerów można obliczyć mapy odkształceń morfogenetycznych. W niniejszym przypadku zastosowano technikę cząsteczek żelaza w celu oznakowania i śledzenia ruchu komórek elektrodermalnych podczas formowania się fałdu głowy. Wczesny embrion kurczaka został wypełniony fluorescencyjnie oznakowanymi komórkami, które rozmieszczono w całym embrionie.Obrazy zarodka w jasnym polu i fluorescencyjne wykonano w różnych odstępach czasu podczas hodowli ex ovo. Służyło to monitorowaniu ruchów markerów traktu. Skumulowane dane pozwalają na obliczenie ewoluujących rozkładów odkształceń morfogenetycznych podczas formowania się fałdu głowowego.Podobnie, technika z użyciem polistyrenowych mikrosfer została wykorzystana do śledzenia ruchów tkanek na granicy środkowej i tylnej części mózgu wczesnego zarodka kurczaka. Należy zauważyć, że metoda ta pozwala na analizę wyraźnych odkształceń 3D, ponieważ kule mają tendencję do przylegania do wszystkich ścian wewnętrznego światła mózgu. Po śledzeniu ruchu kulek przez sześć godzin, współrzędne markerów umożliwiają obliczenie odkształceń, co pozwala na charakterystykę deformacji tkanek w kierunku podłużnym i obwodowym.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiąść wiedzę na temat niektórych kroków eksperymentalnych niezbędnych do przeprowadzenia własnej hodowli i znakowania tkanek. Przedstawione tutaj techniki protokołu są szczególnie korzystne, ponieważ są one minimalnie inwazyjne dla tkanek rodzimych, a ponadto wykorzystują niedrogie i łatwo dostępne materiały. Eksperymenty te są szczególnie użyteczne w badaniach nad mechaniką rozwoju embrionalnego.Ponieważ pola deformacji obliczone na podstawie śledzenia ruchu znakowanych komórek mogą służyć zarówno do testowania, jak i konstruowania fizycznych modeli morfogenezy.

tracking-morphogenetic-tissue-deformations-in-the-early-chick-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Śledzenie morfogenetycznych deformacji tkanek we wczesnym zarodku piskląt 

W niniejszym artykule opisano technikę transplantacji tkanek, która została opracowana w celu zbadania właściwości sygnalizacyjnych i wzorowania powierzchniowego ektodermy głownej podczas rozwoju kraniofacjalnego.

Ocena właściwości sygnalizacyjnych nabłonków ektodermalnych podczas rozwoju kraniofacjalnego

Oglądanie i dostęp do zarodka kurczaka podczas rozwoju może być wyzwaniem. Opracowaliśmy metodę ex ovo, która jest prosta, opłacalna i może być łatwo stosowana w klasie lub w środowisku badawczym. Metoda ta zapewnia dostęp do zarodka w późnych stadiach rozwoju zarodkowego (HH 40).

Zoptymalizowana hodowla ex-ovo zarodków piskląt do zaawansowanych etapów rozwoju

Poprzez szczepienie koralików nasączonych czynnikami wzrostu lub specyficznymi inhibitorami szlaków sygnałowych do rozwijających się zarodków, możliwe jest bezpośrednie testowanie ich efektów in vivo. W tym protokole kulki są szczepione w zawiązku kończyny w celu określenia wpływu tych cząsteczek na ekspresję genów i transdukcję sygnału.

Szczepienie kulek w rozwijających się kończynach zarodka kurczaka w celu identyfikacji szlaków transdukcji sygnału wpływających na ekspresję genów

Opisane są protokoły wykorzystujące nieprzepuszczalne bariery do blokowania zdarzeń indukcyjnych między tkankami głównej osi ciała a bokiem zarodka pisklęcia, wymagane do tworzenia kończyn. Koraliki nasączone potencjalnymi sygnałami indukcyjnymi są wykorzystywane do przezwyciężenia efektu umieszczania bariery, a analiza ekspresji genów to potwierdza.

Zastosowanie nieprzepuszczalnych barier w połączeniu z kulkami nasączonymi czynnikiem kandydującym do badania sygnałów indukcyjnych w pisklątku

Tutaj prezentujemy protokół wprowadzający zestaw nowych eksperymentów ex-ovo i podejść do modelowania fizycznego do badania mechaniki morfogenezy podczas wczesnego skręcania mózgu u zarodków piskląt.

Badanie roli sił fizycznych we wczesnej morfogenezie embrionalnej piskląt

Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.

Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych

Ten artykuł opisuje technikę przeszczepu tkanek, która została zaprojektowana w celu przetestowania właściwości sygnalizacyjnych i wzorcowych podstawy przodomózgowia podczas rozwoju twarzoczaszki.

Tworzenie ptasich chimer przodomózgowia w celu oceny rozwoju twarzy

Rekombinowane kończyny to potężny model eksperymentalny, który pozwala badać proces różnicowania komórek i generowania wzorców pod wpływem sygnałów embrionalnych. Protokół ten przedstawia szczegółową metodę generowania rekombinowanych kończyn z komórkami mezodermalnymi kończyn kurczaka, które można dostosować do innych typów komórek uzyskanych z różnych organizmów.

Test rekombinowanych kończyn kurczaka w celu zrozumienia morfogenezy, wzorca i wczesnych etapów różnicowania komórek

Test nasiąkniętych kulek polega na ukierunkowanym dostarczeniu odczynnika testowego w dowolnym momencie rozwoju w celu zbadania regulacji różnicowania i morfogenezy komórek. Przedstawiono szczegółowy protokół, mający zastosowanie do każdego doświadczalnego modelu zwierzęcego, dotyczący przygotowania trzech różnych rodzajów namoczonych koralików i wszczepienia ich w komórkę międzypalcową zarodka kurczaka.

Analiza różnicowania komórek, morfogenezy i wzorcowania podczas embriogenezy kurczaka przy użyciu testu z namoczonymi kulkami

Tutaj opisujemy protokoły dla trzech typów hodowli eksplantatów skóry embrionalnej ptaków, które mogą być użyte do badania interakcji tkankowych, obrazowania 4D filmu poklatkowego (3D plus czas), globalnych lub lokalnych zaburzeń funkcji molekularnych oraz charakterystyki biologii systemów.

Wykorzystanie eksplantatów ze skóry ptaków do badania wzorców tkanek i organogenezy

Ten protokół został opracowany do podłużnego monitorowania właściwości mechanicznych tkanki płytki nerwowej podczas neurulacji zarodka pisklęcia. Opiera się on na integracji mikroskopu Brillouin i systemu inkubacji na etapie, umożliwiającego mechaniczne obrazowanie na żywo tkanki płytki nerwowej w zarodkach piskląt hodowanych ex ovo.

Monitorowanie mechanicznej ewolucji tkanki podczas zamykania cewy nerwowej zarodka pisklęcia

Poznaj techniki etykietowania i hodowli tkanek zarodków kurzych w celu śledzenia deformacji morfogenetycznych. Metody umożliwiają wysokorozdzielcze obrazowanie zmian tkanek w czasie rzeczywistym.

Śledzenie deformacji tkankowych w procesach morfogenetycznych we wczesnym zarodku kurczaka

Przeglądaj więcej filmów