PCR allelotypowania w celu identyfikacji serowarów Salmonella enterica: Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest identyfikacja specyficznych alleli antygenowych salmonelli. Jest to osiągane poprzez zastosowanie reakcji PCR w celu zidentyfikowania specyficznych różnic w sekwencji związanych z tymi allelami. Matrycę próbki dodaje się do mieszaniny reakcyjnej PCR zawierającej primery specyficzne dla alleli oraz typowanie alleli OH1 i H2.

Reakcje PCR przeprowadza się w termocyklerze. Następnie próbki PCR rozdziela się według wielkości za pomocą elektroforezy żelowej, aby określić wielkość amplikonu w każdej próbce (jeśli występuje) lub go wyizolować. Wielkość amplikonu koreluje się następnie z oczekiwaną wielkością dla każdego z zestawów starterów użytych w PCR; uzyskane wyniki pozwalają na identyfikację specyficznego antygenu salmonelli.

Wyznaczenie serowaru na podstawie alleli uzyskanych metodą PCR odbywa się następnie w oparciu o wyniki multipleksowych testów PCR dla OH1 oraz H2. Główną zaletą protokołu opisanego w tym filmie w porównaniu z metodą SYP jest to, że jest on szybki, łatwiejszy w interpretacji i mniej kosztowny. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu epidemiologii, takie jak określenie rozprzestrzeniania się i trwałości wariantów salmonelli w obrębie lub pomiędzy fermami drobiu lub gospodarstwami mlecznymi.

Zastosowanie tej techniki obejmuje szybką diagnostykę salmonellozy wywołanej przez serowary Salmonella arius lub urian. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa dla zrozumienia sposobu wykorzystania tej metody opartej na PCR do typowania salmonelli na poziomie serowaru. Procedurę tę zaprezentują Adriana Pedroso i Yin Chang, naukowcy z laboratoriów Lee Mauera na University of Georgia, w celu przygotowania matrycy DNA z całych komórek do późniejszej reakcji PCR.

W pierwszej kolejności zaszczep jeden mililitr bulionu LB bakteriami salmonella. Wyizoluj je z pojedynczej kolonii. Inkubuj kulturę w warunkach wstrząsania przy 200 do 250 obrotach na minutę i temperaturze inkubacji 37 °C.

Następnego dnia przenieś 1 mL kultury do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i wiruj zawiesinę przez około dwie minuty przy 4 500 ×g, aby osadzić komórki; następnie odessij nadsącz i resuspenduj osad bakteryjny w 1 mL 100% etanolu. Inkubuj komórki w zawiesinie etanolowej w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie odwiruj komórki w taki sam sposób jak poprzednio. Resuspenduj osad w 1 mL PBS. Po wirowaniu odessij nadsącz i ponownie resuspenduj osad w 1 mL sterylnej wody destylowanej. Na koniec rozcieńcz zawiesinę komórkową.

Rozcieńczyć w stosunku 1:20 w wodzie destylowanej i przechowywać w temperaturze -20 °C do jednego miesiąca. Przygotowanie do PCR oraz dozowanie mieszaniny reakcyjnej PCR należy przeprowadzić w fizycznie oddzielonym pomieszczeniu, najlepiej na dedykowanym stanowisku do PCR wyposażonym w lampę UV. Najpierw należy zdekontaminować powierzchnię roboczą światłem UV oraz przetrzeć ją 10% roztworem wybielacza. Następnie należy użyć pipety przeznaczonej wyłącznie do prac PCR, wyposażonej w końcówkę z filtrem.

Przygotuj roztwór zapasowy starterów, rozcieńczając je początkowo wodą destylowaną do stężenia 5 × 10⁻⁴ M. Następnie rozcieńcz roztwór zapasowy 20-krotnie wodą destylowaną, aby uzyskać stężenie robocze 25 µM. Wyjmij odczynniki do PCR oraz matrycę w postaci całych komórek z zamrażarki i rozmroź na lodzie.

Przechowywać polimerazę DNA tac w zamrażarce do momentu użycia. Połączyć odczynniki do PCR zgodnie z tabelą 1 protokołu pisemnego. Następnie pipetować 9 µL mieszaniny reakcyjnej PCR.

Wlej mieszaninę do dołków sterylnej polistyrenowej mikropłytki 96-dołkowej z okrągłym dnem. Zaczynając od góry pierwszej kolumny, kieruj się w dół kolumny, a następnie przejdź do góry następnej kolumny; do pierwszego dołka dodaj 1 µL wody destylowanej, która będzie służyć jako kontrola negatywna. Następnie do mieszaniny PCR w drugim dołku dozuj 0,5 µL matryc kontroli pozytywnej, a do trzeciego 1 µL e coli K 12 DH five alpha.

Do pozostałych dołków dodajemy 1 µL matrycy trzeciej próbki dla H1 i gyp PCR; Salmonella enterica CVaR TYM oraz Enteritidis posłużą odpowiednio jako kontrole pozytywne dla alleli H1 i GM. Salmonella CVaR Heidelberg oraz Haar są kontrolami pozytywnymi, które zostaną wykorzystane w drugim PCR do typowania alleli H1 w celu wykrycia odpowiednio alleli r i z10. Następnie umieszczamy szklane kapilary o pojemności 10 µL w wyznaczonych uchwytach do technologii Idaho.

Po zamocowaniu urządzenia do szybkiej cyklizacji w uchwycie, należy napełnić każdą kapilarę szklaną mieszaniną reakcyjną PCR, dotykając kapilarami dna dołków. Przechylić uchwyt, aby ciecz spłynęła w dół rurki, pozostawiając wolną przestrzeń między końcami a mieszaniną PCR. Przed zapieczętowaniem szklanych rurek za pomocą palnika butanowego w celu zamknięcia obu końców kapilar, należy umieścić kapilary wraz z uchwytem w urządzeniu do szybkiej cyklizacji firmy Idaho Technology i zastosować programy termocyklera opisane w tabeli 1 pisemnego protokołu dla różnych typów PCR all ELO.

Po zakończeniu programu termocyklera należy przystąpić do etapu elektroforezy żelowej na żelu agarozowym klasy biologii molekularnej o stężeniu 1,5%, wymiarach 15 na 10 cm i zawierającym bromek etydyny, zgodnie ze standardowymi procedurami. Po zestaleniu żelu należy przenieść go do zanurzeniowej poziomej komory elektroforetycznej zawierającej 1× bufor elektroforetyczny TAE z domieszką 200 µL roztworu o stężeniu 0,25 mg/mL.

Do studzienek pierwszej, środkowej i ostatniej nanieś 4,8 µl gotowego markera masy cząsteczkowej DNA z 40 µl sześciokrotnie stężonego barwnika do ładowania DNA. Następnie wyjmij z uchwytu kapilarę szklaną zawierającą produkt reakcji PCR i nacinij oba końce kapilary za pomocą przecinaka do szkła. Następnie uciśnij kciukiem i palcem wskazującym obu dłoni obie strony kapilary w miejscu nacięcia i przełam ją. Umieść dozownik kapilarny na końcu przeciwległym do mieszaniny reakcyjnej PCR i powoli obracaj tłok w prawo, aż ciecz znajdzie się na samym dnie rurki.

Wprowadź kapilarę do otworu, który ma zostać napełniony, i powoli obracaj tłok zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby dozować odważoną próbkę do otworu. Należy uważać, aby nie przebić dna otworu kapilarą ani nie wprowadzić do niego pęcherzyka powietrza poprzez dalsze obracanie tłokiem po tym, jak ostatnia kropla cieczy opuściła kapilarę. Po napełnieniu wszystkich otworów próbkami i wzorcami, ustaw stałe napięcie zasilacza na 90 V.

Po zakończeniu elektroforezy przenieś żel na transiluminator UV, aby zwizualizować fragmenty DNA oraz standardy masy cząsteczkowej, a następnie wykonaj zdjęcia za pomocą systemu gel dock XR. Na koniec umieść uchwyty kapilarne w 10% roztworze wybielacza na 15 do 30 minut. Przepłucz je trzykrotnie wodą destylowaną i odstaw do pomieszczenia z zestawem PCR, aby wyschły na powietrzu.

Ten pierwszy żel barwiony bromkiem etydyny przedstawia wyniki wielokrotnego PCR dla allelu O powiązanego z salmonella entera var, enteritis, hadda Heidelberg.Antifa. Ścieżki jedna i 13 zawierają drabinę DNA 100 pz.

Ścieżka druga zawiera kontrole dla multipleksowej reakcji PCR dla alleli O: B, C1, C2, D1 oraz E. Pozostałe ścieżki od trzech do 12 zawierają izolaty Salmonella. Izolatowi Salmonella przypisuje się oznaczenie allelu na podstawie zgodności wielkości amplikonu z wielkością kontroli PCR oraz zgodnie z przewidywaniami dla zestawów starterów allelicznych użytych od lewej do prawej strony. Wielkości tych amplikonów są następujące: D1 620 par zasad, C2 400 par zasad, E 280 par zasad, C1 340 par zasad oraz B 560 par zasad.

Ten żel barwiony bromkiem irydu przedstawia wyniki multipleksowej reakcji PCR dla alleli H1 w celu identyfikacji alleli eye i gm w żelu FLA. Próbki nałożono na żel w tej samej kolejności, co pokazano wcześniej. Ponownie, każdemu izolatowi przypisano allel H1 w zależności od obecności amplikonu o rozmiarze zgodnym z kontrolą PCR i zgodnie z przewidywaniami dla czterech zestawów starterów alleli H1 użytych od lewej do prawej strony.

Wielkości amplikonów to GM 310 par zasad oraz I 510 par zasad. Ten żel barwiony bromkiem etydyny pokazuje wyniki multipleksowej reakcji PCR dla allelu H1 w celu identyfikacji alleli gelliny r oraz z10. Żel został ponownie załadowany w ten sam sposób, co pokazano wcześniej; każdemu izolatowi przypisano allel H1 w zależności od obecności amplikonu o wielkości zgodnej z kontrolą PCR a zgodnie z przewidywaniami dla czterech zastosowanych zestawów starterów dla allelu H1, wielkości amplikonów to R 170 par zasad i Z10 360 par zasad po przeprowadzeniu analizy.

Tę technikę można przeprowadzić w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie ona wykonana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o fizycznym oddzieleniu przygotowania matrycy, ustawienia reakcji PCR oraz elektroforezy w żelu, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego produktów PCR.