Name: Allelotypiczny PCR do identyfikacji serowarów Salmonella enterica Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Poznaj metodę allelotypicznego PCR do szybkiej identyfikacji serowarów Salmonella enterica. Technika ta umożliwia wykrywanie genów O-antygenu i flageliny, co wspiera badania epidemiologiczne i monitoring bezpieczeństwa żywności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez granty USDA 1999-35212-8680, 2005-01378 oraz 2010-04288-01, fundusze formułowe USDA oraz grant stanu Georgia na badania rolnicze w zakresie medycyny weterynaryjnej. Protokół opisany w niniejszej publikacji został opracowany do użytku przez studentów studiów licencjackich w ramach kursów badań kierowanych: MIBO 4900L, GENE 4960H, BCMB 4960L oraz BIOL 4960H na University of Georgia i był wykorzystywany przez studentów w kilku projektach badawczych z zakresu epidemiologii molekularnej w laboratorium Maurera. Pragniemy podziękować wszystkim studentom studiów licencjackich, którzy prowadzili badania w laboratoriach Maurera i Lee, a także kierownikowi naszego wydziału, Johnowi Glissonowi, za wsparcie naszych wysiłków w zakresie integracji nauczania na poziomie licencjackim z działalnością badawczą.

<ol><li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 Forthcoming.</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg%2C+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. ofacre, Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. aurer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li>
<li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li>
<li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li>
<li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory%22">Molecular cloning: a laboratory</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).</li>
<li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Większość dostępnych komercyjnie testów PCR do wykrywania Salmonella celuje w geny unikalne dla tego rodzaju (np. invA). Jednak nie wszystkie szczepy Salmonella wykazują taką samą zdolność do wywoływania chorób u ludzi lub taką samą rozpowszechnioność w populacjach zwierząt. Wczesne rozpoznanie różnic antygenowych w antygenie O LPS Salmonella oraz antygenach flagelliny H1 i H2 doprowadziło do zróżnicowania Salmonella na ponad 2500 serowarów w oparciu o te różnice antygenowe. W rodzaju Salmonella zidentyfikowano 46 różnych antygenów O i 86 różnych antygenów flagelliny (H). Salmonella może posiadać jedną (H1) lub dwie różne (H1&amp;H2) flagelliny. Różne kombinacje antygenów O, H1 i H2 odpowiadają za 2500 serowarów Salmonella rozpoznawanych obecnie. Serowar jest przypisywany na podstawie wzoru antygenowego wynikającego z identyfikacji poszczególnych antygenów O i H. Wzór antygenowy zapisuje się jako O: H1: H2; gdzie znak „-” odnosi się do braku flagelliny H1 lub H2, a „NT” (non-typeable) do Salmonella ujemnych pod kątem antygenu O. Na przykład serowar Typhimurium jest przypisywany izolatowi S. enterica o wzorze antygenowym B: i: 1,2, podczas gdy serowar Enteritidis jest przypisywany izolatowi o wzorze D1: g,m: -. Ta zmienność antygenowa w populacji Salmonella jest zewnętrznym przejawem różnic na poziomie nukleotydów, które można zatem łatwo wykorzystać w metodzie PCR.
Zidentyfikowaliśmy różnice genetyczne związane z konkretnymi allelami O i H, aby opracować PCR do allelotypowania w celu identyfikacji serowarów S. enterica: Enteritidis, Hadar, Heidelberg oraz Typhimurium (3). Prawidłowe przypisanie i raportowanie serowaru Salmonella wymaga przetestowania wszystkich alleli związanych z formułami antygenowymi O: H1: H2 dla Enteritidis (D1: g,m: -), Hadar (C2: z10: e,n,x), Heidelberg (B: r: 1,2) oraz Typhimurium (B: i: 1,2). Bez znajomości allela O lub antygenu, samo stwierdzenie obecności allela H1 g,m nie musi jednoznacznie identyfikować izolatu Salmonella jako Enteritidis, ponieważ inne serowary Salmonella: Agona, California i Montevideo również posiadają ten sam allel. Choć PCR do allelotypowania został pierwotnie zaprojektowany do wykrywania wspomnianych serowarów Salmonella, test ten może zidentyfikować dodatkowe 19 serowarów (Tabela 3). Nasz PCR do allelotypowania został pierwotnie opracowany do wykrywania alleli O i H. W praktyce, podczas pracy z izolowanymi kulturami Salmonella, bardziej praktyczne i efektywne kosztowo stało się dla nas identyfikowanie antygenu O za pomocą testu aglutynacji na szkiełku, przy użyciu antisera specyficznych dla O, zamiast przeprowadzania PCR do allelotypowania O. Zalecamy jednak stosowanie PCR do allelotypowania O, jeśli laboratorium wykorzystuje ten PCR jako przesiew (2) lub do typowania izolatów Salmonella dostarczonych na kartach FTA (6), oraz dołączenie PCR specyficznego dla Salmonella do pierwszego przesiewu próbek (4). Ogranicz wykonanie PCR do allelotypowania wyłącznie do tych próbek, które zostały zidentyfikowane jako Salmonella za pomocą PCR lub testów biochemicznych/antygenowych.
Protokół opisany w niniejszym artykule został zoptymalizowany do pracy z urządzeniem Idaho Technology Rapidcycler, termocyklerem z ogrzewaniem powietrznym, który umożliwia zmniejszenie objętości reakcji i skrócenie czasu trwania cykli w porównaniu z wieloma termocyklerami z blokiem grzejnym. Adaptacja tego protokołu do pracy z termocyklerem z blokiem grzejnym może wymagać empirycznej optymalizacji warunków reakcji poprzez obniżenie lub podwyższenie temperatury przyłączania, dostosowanie stężeń starterów lub zmiana stężeń MgCl2. Przykładowo, w przypadku termocyklera MJ Research PTC-200 protokół musieliśmy dostosować w następujący sposób: przy zachowaniu tych samych objętości reakcji, które opisano w Tabeli 1, stężenie robocze zestawu starterów i rozcieńczono do 2,5 μM, temperaturę przyłączania obniżono z 55°C do 45°C, a czasy inkubacji w etapach denaturacji, przyłączania i elongacji wydłużono do 20 s dla PCR typowania allelicznego i/g, m. Zastosowanie odpowiednich kontroli pozytywnych i negatywnych jest niezbędne podczas wstępnego uruchamiania i optymalizacji każdej reakcji PCR, w tym w przypadku protokołów opublikowanych. Zalecamy pozyskanie znanych serowarów Salmonella, a konkretnie Anatum (E1: e,h: 1,6), Enteritidis (D1: g,m: -), Hadar (C2: z10: e,n,x), Heidelberg (B: r: 1,2), Montevideo (C1: g,m,s: 1,2,7) oraz Typhimurium (B: i: 1,2), a także laboratoryjnego szczepu Escherichia coli K12 (DH5α, LE393, JM109 itp.) jako odpowiednio kontroli pozytywnych i negatywnych dla testów PCR typowania allelicznego opisanych w tym artykule. Niektóre z tych serowarów Salmonella będą służyć jako kontrole pozytywne lub negatywne, w zależności od tego, który allel jest badany.
Podczas przeprowadzania tej oraz każdej innej diagnostycznej reakcji PCR należy przestrzegać określonych środków ostrożności i wytycznych. Po pierwsze, kluczowe dla zapobiegania możliwemu zanieczyszczeniu przeniesionemu (carry-over contamination) oraz błędnemu raportowaniu wyników fałszywie dodatnich jest fizyczne oddzielenie etapu przygotowania matrycy, przygotowania mieszaniny PCR oraz elektroforezy w żelu. Ponadto w każdej rutynowej procedurze PCR niezbędne jest zastosowanie odpowiednich kontroli, ponieważ pozwalają one na identyfikację problemów w momencie ich wystąpienia i pomagają w interpretacji wyników (5). Co najważniejsze, niezbędna jest konsekwencja, zwłaszcza w odniesieniu do warunków elektroforetycznych służących do detekcji amplikonów (produktów PCR) i szacowania ich wielkości. Aby zilustrować ten punkt, na rysunku 1A celowo przerwaliśmy elektroforezę wcześniej niż planowano. Standardy masy cząsteczkowej (ścieżki 1 i 13) oraz kontrola dodatnia (ścieżka 2) nie są wystarczająco rozdzielone, aby można było precyzyjnie oszacować wielkość fragmentów lub zaobserwować ich rozdział w przypadku niewielkich różnic w wielkości (˜50 bp). Odpowiednie rozdzielenie fragmentów DNA, w szczególności standardów masy cząsteczkowej, jest niezbędne, ponieważ raportowanie wyników dodatnich zależy od dokładnego oszacowania wielkości amplikonu i odróżnienia „prawdziwie dodatniego” wyniku od niespecyficznych amplikonów, które czasami obserwuje się podczas codziennego prowadzenia dowolnej reakcji PCR (5). Na przykład na rysunku 1B w ścieżce 7 widoczny jest niespecyficzny amplikon (o wielkości ˜700 bp). Gdyby elektroforezę przerwano zbyt wcześnie, gdyby czoło barwnika znajdowało się dopiero w połowie żelu agarozy, różnica między fragmentami DNA o wielkości 500 bp a 700 bp byłaby niewielka. W konsekwencji próbka w ścieżce 7 zostałaby błędnie zaraportowana jako dodatnia dla alleli i oraz g,m. 
Na koniec należy uznać ograniczenia związane z każdym testem. Kilka procedur PCR do allelotypowania H1/H2 nie posiada mocy dyskryminacyjnej pozwalającej na rozróżnienie subtelnych różnic genetycznych w allelach należących do kompleksu antygenowego H2 1,2; 1,5; 1,6; 1,7, kompleksu antygenowego e,n,x/e,n,z15 oraz kompleksu antygenowego H1 G, który obejmuje allel g,m. Różne epitopy obecne w tych antygenach wiciowych wynikają ze zmiany jednego lub dwóch aminokwasów. Trudne było zatem zaprojektowanie starterów, które mogłyby wykorzystać te, niekiedy pojedyncze, różnice w parach zasad w sekwencji genu flagelliny (3). Na przykład serowary Salmonella Dublin (D1: g,p: -) i Berta (D1: f,g,t: -) dają również wynik dodatni w PCR z użyciem naszych starterów do allelotypowania g,m. Startery do allelotypowania H2 nie potrafią odróżnić szczepu Typhimurium (B: i : 1,2) od Lagos (B: i: 1,5), Heidelberg (B: r: 1,2) od Bradford (B: r: 1,5), Winneba (B: r: 1,6), Remo (B: r: 1,7) lub Hadar (C2: z10: e,n,x) od Glostrup (C2: z10: e,n,z15). Choć prawdopodobieństwo napotkania niektórych z tych serowarów: Lagos, Bradford, Winneba, Remo lub Glustrup jest niewielkie, jest to możliwe i wymaga albo zamieszczenia informacji o ograniczeniach testów, albo przeprowadzenia innego testu potwierdzającego.
Podsumowując, ta metoda serotypowania oparta na PCR pozwala na szybką identyfikację serowarów S. enterica Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium, a także alleli O, H1 i H2 związanych z 19 dodatkowymi serowarami. Analiza ta stanowi szybką i kosztowo efektywną alternatywę dla tradycyjnego podejścia mikrobiologicznego do serotypowania Salmonella.

<table><tbody><tr><td>Luria Bertani</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>(lub dowolne porównywalne źródło)</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówki</td><td>Fisher Scientific</td><td>pojemność 1.5 ml</td><td>(lub dowolne porównywalne źródło)</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>200 proof</td><td>(lub dowolne porównywalne źródło)</td></tr><tr><td>dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>klasa Molecular Biology Grade</td><td>(lub dowolne porównywalne źródło; tylko do PCR)</td></tr><tr><td>10 x Bufor do PCR:</td><td>Idaho Technologies</td><td>20 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>(bufor zawiera BSA, Ficoll i tartrazynę)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>30 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>40 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Startery do PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Roche Group</td><td></td><td>(lub dowolne porównywalne źródło)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; polimeraza DNA</td><td>Denville Scientific</td><td></td><td>(lub dowolne porównywalne źródło)</td></tr><tr><td>Pipety kapilarne</td><td>Idaho Technologies</td><td>objętość 10 &amp;#181;l</td><td></td></tr><tr><td>Szybki cykler (Rapid Cycler)</td><td>Idaho Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Bio-Rad</td><td>Low EEO; klasa Molecular Biology Grade</td><td>(lub dowolne porównywalne źródło)</td></tr><tr><td>Bufor 50 X TAE lub bufor 5X TBE</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>(lub dowolne porównywalne źródło)</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>(lub dowolne porównywalne źródło)</td></tr><tr><td>Horyzontalna, zanurzeniowa komora do elektroforezy w żelu z formą do żelu</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>(lub dowolne porównywalne źródło)</td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>(lub dowolne porównywalne źródło)</td></tr><tr><td>System obrazowania molekularnego Gel Doc</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>(lub dowolne porównywalne źródło)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 4. Materiały &lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

pcr allelotypowania w celu identyfikacji serowarów salmonella enterica: enteritidis, hadar, heidelberg i typhimurium

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Obecne komercyjne testy PCR służące do identyfikacji Salmonella celują w geny unikalne dla tego rodzaju. Istnieją jednak dwa gatunki, sześć podgatunków i ponad 2500 różnych serowarów Salmonella, a nie wszystkie mają takie samo znaczenie dla zdrowia publicznego. Na przykład wykrycie S. enterica subspecies IIIa Arizona w gospodarstwie zajmującym się produkcją jaj konsumpcyjnych jest nieistotne w porównaniu z izolacją S. enterica subspecies I serowar Enteritidis, który jest główną przyczyną salmonellozy powiązanej ze spożyciem jaj konsumpcyjnych. Serowary są identyfikowane na podstawie różnic antygenowych w lipopolisacharydzie (LPS) (antygen O) i flagellinie (antygeny H1 i H2). Różnice antygenowe te są zewnętrznym przejawem różnorodności genów i alleli genów związanych z tym fenotypem.
Opracowaliśmy metodę allelotypowania z wykorzystaniem wielokrotnej reakcji PCR (multiplex PCR), która opiera się na różnicach genetycznych między czterema głównymi serowariantami S. enterica podgatunku I występującymi u drobiu i wiążącymi się ze znaczącą zapadalnością na choroby u ludzi w USA. Pary starterów PCR zostały skierowane na kluczowe geny lub sekwencje unikalne dla konkretnego serowariantu Salmonella i zaprojektowane tak, aby wytworzyć amplikon o wielkości specyficznej dla danego genu lub allelu. Serowariant Salmonella przypisywany jest do izolatu na podstawie kombinacji wyników testów PCR dla specyficznych alleli genów LPS i flagelliny. Metody multiplex PCR opisane w tym artykule są specyficzne dla wykrywania serowariantów S. enterica podgatunku I: Enteritidis, Hadar, Heidelberg oraz Typhimurium.
W niniejszym materiale demonstrujemy, jak wykorzystać wielokrotny PCR do identyfikacji serowaru izolatu Salmonella.

Opisujemy metodę multipleksowej reakcji PCR do szybkiego wykrywania serowarów Salmonella enterica Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium. Konkretne serowary Salmonella można zidentyfikować, kierując multipleksową reakcję PCR na geny i sekwencje unikalne dla klastra biosyntezy antygenu O oraz flagelliny danego serowaru. Następnie izolatowi Salmonella przypisuje się serowar na podstawie pojawienia się specyficznych amplikonów (produktów PCR) o określonej wielkości, odpowiadających docelowemu allelowi.

PCR allelotypowania w celu identyfikacji serowarów Salmonella enterica: Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium

Obecne komercyjne testy PCR służące do identyfikacji Salmonella celują w geny unikalne dla tego rodzaju. Istnieją jednak dwa gatunki, sześć podgatunków i ponad ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest identyfikacja specyficznych alleli antygenowych salmonelli. Jest to osiągane poprzez zastosowanie reakcji PCR w celu zidentyfikowania specyficznych różnic w sekwencji związanych z tymi allelami. Matrycę próbki dodaje się do mieszaniny reakcyjnej PCR zawierającej primery specyficzne dla alleli oraz typowanie alleli OH1 i H2.Reakcje PCR przeprowadza się w termocyklerze. Następnie próbki PCR rozdziela się według wielkości za pomocą elektroforezy żelowej, aby określić wielkość amplikonu w każdej próbce (jeśli występuje) lub go wyizolować. Wielkość amplikonu koreluje się następnie z oczekiwaną wielkością dla każdego z zestawów starterów użytych w PCR; uzyskane wyniki pozwalają na identyfikację specyficznego antygenu salmonelli.Wyznaczenie serowaru na podstawie alleli uzyskanych metodą PCR odbywa się następnie w oparciu o wyniki multipleksowych testów PCR dla OH1 oraz H2. Główną zaletą protokołu opisanego w tym filmie w porównaniu z metodą SYP jest to, że jest on szybki, łatwiejszy w interpretacji i mniej kosztowny. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu epidemiologii, takie jak określenie rozprzestrzeniania się i trwałości wariantów salmonelli w obrębie lub pomiędzy fermami drobiu lub gospodarstwami mlecznymi.Zastosowanie tej techniki obejmuje szybką diagnostykę salmonellozy wywołanej przez serowary Salmonella arius lub urian. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa dla zrozumienia sposobu wykorzystania tej metody opartej na PCR do typowania salmonelli na poziomie serowaru. Procedurę tę zaprezentują Adriana Pedroso i Yin Chang, naukowcy z laboratoriów Lee Mauera na University of Georgia, w celu przygotowania matrycy DNA z całych komórek do późniejszej reakcji PCR.W pierwszej kolejności zaszczep jeden mililitr bulionu LB bakteriami salmonella. Wyizoluj je z pojedynczej kolonii. Inkubuj kulturę w warunkach wstrząsania przy 200 do 250 obrotach na minutę i temperaturze inkubacji 37 °C.Następnego dnia przenieś 1 mL kultury do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i wiruj zawiesinę przez około dwie minuty przy 4 500 ×g, aby osadzić komórki; następnie odessij nadsącz i resuspenduj osad bakteryjny w 1 mL 100% etanolu. Inkubuj komórki w zawiesinie etanolowej w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie odwiruj komórki w taki sam sposób jak poprzednio. Resuspenduj osad w 1 mL PBS. Po wirowaniu odessij nadsącz i ponownie resuspenduj osad w 1 mL sterylnej wody destylowanej. Na koniec rozcieńcz zawiesinę komórkową.Rozcieńczyć w stosunku 1:20 w wodzie destylowanej i przechowywać w temperaturze -20 °C do jednego miesiąca. Przygotowanie do PCR oraz dozowanie mieszaniny reakcyjnej PCR należy przeprowadzić w fizycznie oddzielonym pomieszczeniu, najlepiej na dedykowanym stanowisku do PCR wyposażonym w lampę UV. Najpierw należy zdekontaminować powierzchnię roboczą światłem UV oraz przetrzeć ją 10% roztworem wybielacza. Następnie należy użyć pipety przeznaczonej wyłącznie do prac PCR, wyposażonej w końcówkę z filtrem.Przygotuj roztwór zapasowy starterów, rozcieńczając je początkowo wodą destylowaną do stężenia 5 × 10⁻⁴ M. Następnie rozcieńcz roztwór zapasowy 20-krotnie wodą destylowaną, aby uzyskać stężenie robocze 25 µM. Wyjmij odczynniki do PCR oraz matrycę w postaci całych komórek z zamrażarki i rozmroź na lodzie.Przechowywać polimerazę DNA tac w zamrażarce do momentu użycia. Połączyć odczynniki do PCR zgodnie z tabelą 1 protokołu pisemnego. Następnie pipetować 9 µL mieszaniny reakcyjnej PCR.Wlej mieszaninę do dołków sterylnej polistyrenowej mikropłytki 96-dołkowej z okrągłym dnem. Zaczynając od góry pierwszej kolumny, kieruj się w dół kolumny, a następnie przejdź do góry następnej kolumny; do pierwszego dołka dodaj 1 µL wody destylowanej, która będzie służyć jako kontrola negatywna. Następnie do mieszaniny PCR w drugim dołku dozuj 0,5 µL matryc kontroli pozytywnej, a do trzeciego 1 µL e coli K 12 DH five alpha.Do pozostałych dołków dodajemy 1 µL matrycy trzeciej próbki dla H1 i gyp PCR; Salmonella enterica CVaR TYM oraz Enteritidis posłużą odpowiednio jako kontrole pozytywne dla alleli H1 i GM. Salmonella CVaR Heidelberg oraz Haar są kontrolami pozytywnymi, które zostaną wykorzystane w drugim PCR do typowania alleli H1 w celu wykrycia odpowiednio alleli r i z10. Następnie umieszczamy szklane kapilary o pojemności 10 µL w wyznaczonych uchwytach do technologii Idaho.Po zamocowaniu urządzenia do szybkiej cyklizacji w uchwycie, należy napełnić każdą kapilarę szklaną mieszaniną reakcyjną PCR, dotykając kapilarami dna dołków. Przechylić uchwyt, aby ciecz spłynęła w dół rurki, pozostawiając wolną przestrzeń między końcami a mieszaniną PCR. Przed zapieczętowaniem szklanych rurek za pomocą palnika butanowego w celu zamknięcia obu końców kapilar, należy umieścić kapilary wraz z uchwytem w urządzeniu do szybkiej cyklizacji firmy Idaho Technology i zastosować programy termocyklera opisane w tabeli 1 pisemnego protokołu dla różnych typów PCR all ELO.Po zakończeniu programu termocyklera należy przystąpić do etapu elektroforezy żelowej na żelu agarozowym klasy biologii molekularnej o stężeniu 1,5%, wymiarach 15 na 10 cm i zawierającym bromek etydyny, zgodnie ze standardowymi procedurami. Po zestaleniu żelu należy przenieść go do zanurzeniowej poziomej komory elektroforetycznej zawierającej 1× bufor elektroforetyczny TAE z domieszką 200 µL roztworu o stężeniu 0,25 mg/mL.Do studzienek pierwszej, środkowej i ostatniej nanieś 4,8 µl gotowego markera masy cząsteczkowej DNA z 40 µl sześciokrotnie stężonego barwnika do ładowania DNA. Następnie wyjmij z uchwytu kapilarę szklaną zawierającą produkt reakcji PCR i nacinij oba końce kapilary za pomocą przecinaka do szkła. Następnie uciśnij kciukiem i palcem wskazującym obu dłoni obie strony kapilary w miejscu nacięcia i przełam ją. Umieść dozownik kapilarny na końcu przeciwległym do mieszaniny reakcyjnej PCR i powoli obracaj tłok w prawo, aż ciecz znajdzie się na samym dnie rurki.Wprowadź kapilarę do otworu, który ma zostać napełniony, i powoli obracaj tłok zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby dozować odważoną próbkę do otworu. Należy uważać, aby nie przebić dna otworu kapilarą ani nie wprowadzić do niego pęcherzyka powietrza poprzez dalsze obracanie tłokiem po tym, jak ostatnia kropla cieczy opuściła kapilarę. Po napełnieniu wszystkich otworów próbkami i wzorcami, ustaw stałe napięcie zasilacza na 90 V.Po zakończeniu elektroforezy przenieś żel na transiluminator UV, aby zwizualizować fragmenty DNA oraz standardy masy cząsteczkowej, a następnie wykonaj zdjęcia za pomocą systemu gel dock XR. Na koniec umieść uchwyty kapilarne w 10% roztworze wybielacza na 15 do 30 minut. Przepłucz je trzykrotnie wodą destylowaną i odstaw do pomieszczenia z zestawem PCR, aby wyschły na powietrzu.Ten pierwszy żel barwiony bromkiem etydyny przedstawia wyniki wielokrotnego PCR dla allelu O powiązanego z salmonella entera var, enteritis, hadda Heidelberg.Antifa. Ścieżki jedna i 13 zawierają drabinę DNA 100 pz.Ścieżka druga zawiera kontrole dla multipleksowej reakcji PCR dla alleli O: B, C1, C2, D1 oraz E. Pozostałe ścieżki od trzech do 12 zawierają izolaty Salmonella. Izolatowi Salmonella przypisuje się oznaczenie allelu na podstawie zgodności wielkości amplikonu z wielkością kontroli PCR oraz zgodnie z przewidywaniami dla zestawów starterów allelicznych użytych od lewej do prawej strony. Wielkości tych amplikonów są następujące: D1 620 par zasad, C2 400 par zasad, E 280 par zasad, C1 340 par zasad oraz B 560 par zasad.Ten żel barwiony bromkiem irydu przedstawia wyniki multipleksowej reakcji PCR dla alleli H1 w celu identyfikacji alleli eye i gm w żelu FLA. Próbki nałożono na żel w tej samej kolejności, co pokazano wcześniej. Ponownie, każdemu izolatowi przypisano allel H1 w zależności od obecności amplikonu o rozmiarze zgodnym z kontrolą PCR i zgodnie z przewidywaniami dla czterech zestawów starterów alleli H1 użytych od lewej do prawej strony.Wielkości amplikonów to GM 310 par zasad oraz I 510 par zasad. Ten żel barwiony bromkiem etydyny pokazuje wyniki multipleksowej reakcji PCR dla allelu H1 w celu identyfikacji alleli gelliny r oraz z10. Żel został ponownie załadowany w ten sam sposób, co pokazano wcześniej; każdemu izolatowi przypisano allel H1 w zależności od obecności amplikonu o wielkości zgodnej z kontrolą PCR a zgodnie z przewidywaniami dla czterech zastosowanych zestawów starterów dla allelu H1, wielkości amplikonów to R 170 par zasad i Z10 360 par zasad po przeprowadzeniu analizy.Tę technikę można przeprowadzić w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie ona wykonana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o fizycznym oddzieleniu przygotowania matrycy, ustawienia reakcji PCR oraz elektroforezy w żelu, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego produktów PCR.

an-allelotyping-pcr-for-identifying-salmonella-enterica-serovars

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

An Allelotyping PCR do identyfikacji Salmonella enterica serowarów Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Test qPCR został opracowany do wykrywania Escherichia coli O157:H7 z unikalnym markerem genetycznym, Z3276. qPCR połączono z leczeniem monoazydkiem propidyny (PMA) w celu wykrywania żywych komórek. Protokół ten został zmodyfikowany i dostosowany do formatu płytki 96-dołkowej w celu łatwej i spójnej obsługi wielu...

Wykrywanie żywych komórek Escherichia coli O157:H7 metodą PMA-qPCR

Ten manuskrypt opisuje dupleksowy cyfrowy test PCR, który może być używany do jednoczesnego ilościowego oznaczania Enterococcus spp. i markerów genetycznych HF183 jako wskaźników ogólnego i związanego z człowiekiem zanieczyszczenia kałem w wodach rekreacyjnych.

Dupleksowy cyfrowy test PCR do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i ludzkiego markera HF183 związanego z kałem w wodzie

Salmonella spp./Shigella spp. są częstymi patogenami przypisywanymi biegunce. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp. przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym w połączeniu z hodowlą sterowaną.

Wysokoprzepustowa platforma do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp.

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek DNA z mikrobiomów żywności i środowiska do wspólnego wykrywania i subtypowania Salmonelli poprzez sekwencjonowanie quasimetagenomiczne. Połączone zastosowanie wzbogacania hodowli, separacji immunomagnetycznej (IMS) i amplifikacji z wielokrotnym przemieszczeniem (MDA) pozwala na skuteczną koncentrację genomowego DNA Salmonelli z próbek żywności i środowiska.

Analiza quasi-metagenomiczna salmonelli z próbek żywności i środowiska

Prezentowany tutaj test wielomiejscowej analizy tandemowo-powtórzeniowej (MLVA) umożliwia niedrogie, solidne i przenośne genotypowanie w wysokiej rozdzielczości bakterii Yersinia ruckeri. Zaczynając od czystych kultur, test wykorzystuje multipleksową reakcję PCR i elektroforezę kapilarną w celu wytworzenia dziesięcioloci-loci profili MLVA do dalszych zastosowań.

Wielolocusowa analiza tandemowo-powtórzeniowa bakterii Yersinia ruckeri patogennej dla ryb metodą Multiplex PCR i elektroforezy kapilarnej

To oparte na molekularnym podejściu do określania sprawności bakterii umożliwia precyzyjne i dokładne wykrywanie mikroorganizmów za pomocą unikalnych kodów kreskowych genomowego DNA, które są określane ilościowo za pomocą cyfrowego PCR. W protokole opisano obliczanie indeksu konkurencyjnego dla szczepów Salmonella; Technologia ta jest jednak łatwa do zaadaptowania do protokołów wymagających bezwzględnej kwantyfikacji każdego genetycznie plastycznego organizmu.

Cyfrowy indeks konkurencyjności oparty na PCR do wysokoprzepustowej analizy sprawności w Salmonelli

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) to test izotermicznej amplifikacji kwasów nukleinowych (iNAAT), który wzbudził szerokie zainteresowanie w dziedzinie wykrywania patogenów. W tym miejscu przedstawiamy zatwierdzony przez wiele laboratoriów protokół Salmonella LAMP jako szybką, niezawodną i solidną metodę badań przesiewowych Salmonelli w żywności zwierzęcej i potwierdzania przypuszczalnej obecności Salmonelli w izolacji hodowli.

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli do badań przesiewowych Salmonelli w karmie zwierzęcej i potwierdzania salmonelli z izolacji hodowli

Ten artykuł przedstawia szereg następujących po sobie metod ekspresji i oczyszczania syntazy tryptofanu Salmonella typhimurium w tym protokole, szybkim systemie do oczyszczania kompleksu białkowego w ciągu jednego dnia. Omówione metody to mutageneza ukierunkowana na miejsce, ekspresja białek w Escherichia coli, chromatografia powinowactwa, chromatografia filtracji żelowej i krystalizacja.

Mutageneza PCR, klonowanie, ekspresja, protokoły szybkiego oczyszczania białek oraz krystalizacja typu dzikiego i zmutowanych form syntazy tryptofanu

Wykonalność strategii sekwencjonowania całego genomu (WGS) przy użyciu narzędzi laboratoryjnych uprościła badanie genomu każdego mikroba istotnego dla zdrowia publicznego w warunkach laboratoryjnych. Opisano adaptację metodologiczną przepływu pracy dla bakteryjnych WGS, a także przedstawiono proces analizy bioinformatycznej.

Charakterystyka patogennego szczepu Escherichia coli pochodzącego z gospodarstw Oreochromis spp. przy użyciu sekwencjonowania całego genomu

Poznaj metodę allelotypicznego PCR do szybkiej identyfikacji serowarów Salmonella enterica. Technika ta umożliwia wykrywanie genów O-antygenu i flageliny, co wspiera badania epidemiologiczne i monitoring bezpieczeństwa żywności.

PCR allelotypowania w celu identyfikacji serowarów Salmonella enterica: Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium

Przeglądaj więcej filmów