Ilościowa analiza uzupełniania puli pęcherzyków synaptycznych w hodowlanych neuronach ziarnistych móżdżku z wykorzystaniem barwników FM
11 listopada 2011
Opisano technikę obrazowania fluorescencyjnego na żywo, służącą do ilościowego określenia uzupełniania i mobilizacji specyficznych pul pęcherzyków synaptycznych (SV) w centralnych zakończeniach nerwowych. Monitorowane są dwie rundy recyklingu SV w tych samych zakończeniach nerwowych, co zapewnia kontrolę wewnętrzną.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie uzupełniania i mobilizacji specyficznych pul pęcherzyków synaptycznych w centralnych zakończeniach nerwowych przy użyciu technik obrazowania fluorescencyjnego na żywo. Osiąga się to poprzez monitorowanie dwóch cykli recyklingu pęcherzyków synaptycznych z wykorzystaniem barwników FM w tych samych zakończeniach nerwowych, co zapewnia wiarygodną wewnętrzną kontrolę. W drugim kroku pula bezpośrednio wydzielalna oraz pula rezerwowa są kolejno wyczerpywane przy użyciu specyficznych protokołów uwalniania, co pozwala na ilościowe określenie względnych rozmiarów pul.
Następnie należy zmienić warunki ładowania lub rozładowywania, aby zbadać wpływ wybranej modyfikacji na pęcherzyki synaptyczne, uzupełnianie puli lub mobilizację. Wyniki wykazują, że ładowanie FM d różnych fizycznych pul synaptycznych jest powtarzalne na podstawie ilościowego oznaczenia i analizy wywołanego rozładowywania barwnika. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak rodzina genetycznych reporterów fluent, jest to, że pozwala ona śledzić uzupełnianie pul konkretnie przez pęcherzyki synaptyczne, które przeszły endocytozę.
Pozwala to również na dokładną kwantyfikację. Ponieważ protokół ten jest przeprowadzany dwukrotnie w tych samych zakończeniach nerwowych, zapewnia on kontrolę wewnętrzną. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu synaptycznego CLE, endocytozy i egzocytozy, na przykład w kwestii tego, jak manipulacje konkretnymi trybami endocytozy mogą wpływać na odnawianie zarówno całkowitej puli recyklingowej, jak i synaptycznych pul CLE w jej obrębie, takich jak pula łatwo dostępna oraz pula rezerwowa.
Podstawowa konfiguracja eksperymentalna powinna składać się z odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego, chłodzonej kamery CCD, fluorescencyjnego źródła światła, aparatury do perfuzji grawitacyjnej, komory obrazującej z równoległymi elektrodami platynowymi, stymulatora elektrycznego oraz komputera. Eksperymenty należy przeprowadzać w ciemności lub w świetle czerwonym, przy minimalnym oświetleniu fluorescencyjnym próbki, aby uniknąć blaknięcia barwnika FM. Procedurę należy rozpocząć od przygotowania pierwotnych kultur neuronów ziarnistych móżdżku z siedmiodniowych szcząt pupsów szczura linii Sprague-Dawley.
Po przygotowaniu kultur, naniesione neurony umieść w centrum pokrywki szkiełka o średnicy 25 milimetrów, pokrytej poli-D-lizyną, w postaci kropli nieprzekraczającej siedmiu milimetrów średnicy. Po jednej godzinie dodaj do neuronów dwa mililitry pożywki hodowlanej. Po siedmiu dniach umieść pojedyncze szkiełko w roztworze soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby umożliwić stabilizację w nowym medium. Następnie wyjmij szkiełko, a jego dolną stronę oraz obszar wokół przytwierdzonych komórek osusz niewielkim kawałkiem ręcznika papierowego lub papieru chłonnego.
Następnie należy użyć smaru silikonowego, aby przykleić szkiełko nakrywki do dna komory obrazowania. Komórki powinny znajdować się pomiędzy dwoma równoległymi drutami. Należy użyć wystarczającej ilości smaru silikonowego, aby całkowicie uszczelnić komorę, nie dopuszczając do jego przedostania się do środka komory kąpielowej.
Następnie ostrożnie napełnij komorę kąpieli około 260 µL roztworu soli fizjologicznej. Następnie napełnij przewody doprowadzające i odprowadzające tym samym roztworem. Uszczelnij komorę, przyklejając czyste szkiełko nakrywki do górnej części za pomocą smaru silikonowego.
Następnie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w komorze za pomocą rurek doprowadzających i odprowadzających. Potem unieruchom komorę obrazowania na platformie ze stali nierdzewnej. Sprawdź szczelność układu, delikatnie przepłukując go roztworem soli fizjologicznej przez rurkę doprowadzającą.
Kolejnym krokiem jest zamontowanie złożonej komory na stoliku mikroskopu odwróconego. Należy przepłukać wlot systemu perfuzji grawitacyjnej roztworem soli fizjologicznej, a następnie podłączyć komorę do wlotu. Następnie należy podłączyć przewody połączeniowe komory do stymulatora elektrycznego.
Przesiącz neurony 1,5 mililitrami rozcieńczonego barwnika FM. Następnie stymuluj neurony za pomocą dołączonego stymulatora, aby wywołać pobieranie barwnika. Po stymulacji przesyć neurony świeżym roztworem soli fizjologicznej przez dwie minuty, aby wypłukać nadmiar barwnika FM. Następnie pozostaw neurony w roztworze soli fizjologicznej na osiem minut.
W międzyczasie zlokalizuj sieci aksonalne, w których widoczne są poszczególne zakończenia nerwowe obciążone barwnikiem FM D. Użyj długości fal fluoresceiny. Unikaj obszarów z skupiskami komórek.
Następnie ponownie ustaw ostrość obrazu bezpośrednio przed jego akwizycją, ponieważ podczas okresu spoczynku mógł wystąpić niewielki dryft. Rozpocznij akwizycję obrazów w trybie time-lapse z częstotliwością jednej klatki co cztery sekundy. Po zarejestrowaniu od pięciu do 10 obrazów bazowych wywołaj egzocytozę puli łatwo uwalnialnej poprzez podanie stymulacji o częstotliwości 30 hertz przez dwie sekundy.
Po pozyskaniu kolejnych 10 obrazów, wywołaj egzocytozę pęcherzyków synaptycznych z puli rezerwowej, stosując trzy stymulacje o częstotliwości 40 hertz przez 10 sekund z 40-sekundowym odstępem między stymulacjami, a następnie pozyskaj kolejne od pięciu do 10 obrazów. Następnie wstrzymaj akwizycję obrazów. Pozostaw neurony do regeneracji na co najmniej 20 minut i powtórz ten protokół fazy S1 ponownie w fazie S2 dla eksperymentu kontrolnego.
W celu analizy danych przekształć obrazy w stos. Używając wbudowanej funkcji programu ImageJ, dostosuj jasność i kontrast stosu, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny, jeśli wystąpiło znaczne dryfowanie poziome. W trakcie eksperymentu uruchom w programie ImageJ wtyczki stack reg oraz turbo reg, aby wyrównać stos obrazów.
Następnie uruchom wtyczkę analizatora serii czasowych. W kolejnym kroku zdefiniuj obszary zainteresowania (ROI) dla co najmniej 90 zakończeń nerwowych. Pomocne może być przełączanie się między obrazami przed i po wypłukaniu barwnika, aby zidentyfikować aktywne zakończenia nerwowe.
Idealny rozmiar obszaru zainteresowania powinien być nieco większy niż typowe zakończenie nerwowe. Następnie należy wyznaczyć całkowitą intensywność fluorescencji dla każdego obszaru zainteresowania w funkcji czasu. Po tym kroku dane należy wyeksportować do programu Microsoft Excel.
Przedstawiono tutaj schemat blokowy eksperymentu kontrolnego, w którym neurony ziarniste móżdżku zostały załadowane 10 µM FM 1-43 przy zastosowaniu stymulacji o częstotliwości 80 Hz i czasie trwania 10 s. Oto obraz przedstawiający zakończenia nerwowe załadowane FM 1-43. Tutaj znajduje się ten sam obraz z zaznaczonymi 90 ponumerowanymi obszarami zainteresowania (ROI) wybranymi do analizy po zidentyfikowaniu aktywnych zakończeń nerwowych, a poniżej znajdują się obrazy zakończeń nerwowych w wybranych punktach czasowych.
Obrazy te przedstawiono w pseudokolorach, aby zilustrować zmiany fluorescencji w miarę wyczerpywania się różnych pul pęcherzyków synaptycznych. Na koniec przedstawiono znormalizowane jednostki fluorescencji dla tych 90 zakończeń nerwowych. W fazach S1 i S2 można zmierzyć spadek fluorescencji przy każdej kolejnej stymulacji i porównać go pomiędzy fazami S1 i S2.
W tym eksperymencie kontrolnym zarówno S one, jak i S two doprowadziły do uzyskania tych samych rozmiarów puli łatwo uwalnianej oraz puli rezerwowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak ilościowo określić uzupełnianie i mobilizację specyficznych pul pęcherzyków synaptycznych w centralnych zakończeniach nerwowych przy użyciu technik obrazowania fluorescencyjnego in vivo. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o potwierdzeniu żywotności i responsywności komórek poprzez wykonanie eksperymentów kontrolnych S one przed zmianą warunków eksperymentalnych S two.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje technikę obrazowania fluorescencyjnego na żywo, służącą do ilościowego określenia uzupełniania i mobilizacji specyficznych pul pęcherzyków synaptycznych (SV) w centralnych zakończeniach nerwowych. Metoda ta pozwala na monitorowanie dwóch cykli recyklingu SV w tych samych zakończeniach nerwowych, co zapewnia kontrolę wewnętrzną niezbędną do dokładnej kwantyfikacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Zrozumienie dynamiki pęcherzyków synaptycznych jest kluczowe dla poznania mechanizmów neurotransmisji.
- Techniki obrazowania na żywo zwiększają możliwość badania procesów synaptycznych w czasie rzeczywistym.
- Poprzednie metody nie pozwalały na skuteczne śledzenie konkretnych pul pęcherzyków.
- Celem niniejszego badania jest udoskonalenie istniejących technik poprzez zastosowanie kontroli wewnętrznych.
Cel badania
- W celu ilościowego określenia uzupełniania i mobilizacji pul pęcherzyków synaptycznych.
- W celu monitorowania dwóch cykli recyklingu pęcherzyków synaptycznych w tych samych zakończeniach nerwowych.
- W celu oceny wpływu różnych warunków ładowania i rozładowywania na dynamikę pęcherzyków.
Zastosowane metody
- Obrazowanie fluorescencyjne na żywo z użyciem barwników FM w celu wizualizacji pęcherzyków synaptycznych.
- Sekwencyjne wyczerpywanie puli łatwo uwalnianej oraz puli rezerwowej przy użyciu specyficznych protokołów.
- Obrazowanie poklatkowe w celu zarejestrowania dynamiki pęcherzyków podczas stymulacji.
- Analiza danych z wykorzystaniem oprogramowania do przetwarzania obrazów w celu ilościowego oznaczenia intensywności fluorescencji.
Główne wyniki
- Technika ta umożliwia powtarzalne śledzenie ładowania i rozładowywania pęcherzyków synaptycznych.
- Kontrole wewnętrzne zwiększają wiarygodność uzyskanych wyników.
- Manipulacje trybami endocytozy istotnie wpływają na uzupełnianie pęcherzyków.
- Analiza ilościowa pozwala na poznanie wielkości pul pęcherzyków synaptycznych.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia wiarygodne podejście do badania dynamiki pęcherzyków synaptycznych.
- Oferuje ona potencjał do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu fizjologii synaptycznej.
- Wyniki mogą stać się podstawą dla przyszłych badań nad neurotransmisją i plastycznością synaptyczną.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia precyzyjną kwantyfikację dynamiki pul pęcherzyków synaptycznych, wspierając mechanistyczną minimalizację ryzyka w walidacji celów w programach dotyczących chorób neurodegeneracyjnych. Poprzez zapewnienie kontroli wewnętrznych i analizy różnicowej pul, zwiększa ona pewność prognostyczną na wczesnych etapach odkrywania leków, w których mechanizmy transportu pęcherzyków stanowią cele terapeutyczne. Podejście to eliminuje zmienność między preparatami, poprawiając powtarzalność w ramach współpracy międzyfunkcyjnej w procesach opracowywania testów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie szlaków transportu pęcherzyków synaptycznych w celu walidacji celów zaangażowanych w uwalnianie i recykling neuroprzekaźników.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowe, powtarzalne pomiary puli łatwo uwalnianej oraz uzupełniania puli rezerwowej w różnych warunkach stymulacji.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie gotowych do analizy odczytów kinetyki mobilizacji pęcherzyków, które mogą być wykorzystane do przesiewania związków wpływających na endocytozę lub egzocytozę.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje znakowanie barwnikiem FM do generowania kwantowych sygnałów fluorescencji proporcjonalnych do uwalniania pęcherzyków, co umożliwia zastosowanie zestandaryzowanych, ilościowych formatów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie istotne z punktu widzenia chorób poprzez ilościowe określenie, w jaki sposób manipulacje trybami endocytozy wpływają na konkretne pule pęcherzyków w neuronach ziarnistych móżdżku.
- Wartość operacyjna: Umożliwia porównania w obrębie jednego preparatu (fazy S1 i S2) w celu kontrolowania zmienności biologicznej, co zwiększa niezawodność testu w badaniach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Technika ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, w którym zrozumienie dynamiki pul pęcherzyków pozwala określić mechanizm działania oraz wpływ związków na funkcje presynaptyczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących tego, w jaki sposób szlaki endocytozy (np. endocytoza zależna od klatryny w porównaniu z aktywnością zależną endocytozą masową) regulują mobilizację puli pęcherzyków.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników (kinetyka zaniku fluorescencji), które umożliwiają porównanie wpływu związków na recykling pęcherzyków.
- Analityka: Zapewnia pomiary natężenia fluorescencji rozdzielone w czasie z obszarów zainteresowania, co pozwala na obliczenie tempa uzupełniania specyficznych pul.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez wykorzystanie neuronalnych modeli związanych z chorobami do oceny, w jaki sposób zaburzenia genetyczne lub farmakologiczne zmieniają transport pęcherzyków.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zestandaryzowany przepływ pracy obrazowania, który może być adaptowany w różnych modelach neuronalnych i paradygmatach stymulacji do wielokrotnego użytku w kampaniach odkrywczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez wyizolowanie wkładu konkretnych pul pęcherzyków synaptycznych w dynamikę neurotransmisji.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki kontrolom wewnętrznym (dwufazowe pomiary w tych samych zakończeniach nerwowych) oraz zestandaryzowanym protokołom z użyciem barwników FM.
- Wartość strategiczna: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu presynaptycznego, co wspiera lepsze decyzje go/no-go we wczesnej fazie odkrywania leków.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o efekty wpływające na uzupełnianie pul pęcherzyków, będące kluczowym mechanizmem presynaptycznym.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu fluorescencyjnym na żywo oraz w przygotowywaniu kultur neuronalnych, w szczególności pierwotnych neuronów ziarnistych móżdżku.
- Zależność od mikroskopii epifluorescencyjnej w odwróceniu, chłodzonej kamery CCD, stymulacji elektrycznej oraz systemów perfuzyjnych umożliwiających precyzyjną wymianę roztworów.
- Konieczność standaryzacji czasu barwienia, przemywania i stymulacji w poszczególnych seriach pomiarowych w celu zapewnienia porównywalnego stopnia załadunku i uwalniania pęcherzyków.
- Konieczność uwzględnienia zmienności gęstości i kondycji zakończeń nerwowych, co realizuje się poprzez wybór aktywnych zakończeń oraz stosowanie kontroli wewnętrznych.
- Ograniczenie do preparatów dostępnych optycznie; metoda nie nadaje się do formatów wysokoprzepustowych bez automatyzacji obrazowania i analizy.
