Analiza ilościowa uzupełniania puli pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach ziarnistych móżdżku przy użyciu barwników FM
November 11th, 2011
Opisano technikę obrazowania fluorescencji na żywo do ilościowego określania uzupełniania i mobilizacji specyficznych pul pęcherzyków synaptycznych (SV) w centralnych zakończeniach nerwowych. Dwie rundy recyklingu SV są monitorowane w tych samych zakończeniach nerwowych, zapewniając kontrolę wewnętrzną.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie uzupełniania i mobilizacji specyficznych pul pęcherzyków synaptycznych w centralnych zakończeniach nerwowych przy użyciu technik obrazowania fluorescencji na żywo. Osiąga się to poprzez monitorowanie dwóch rund recyklingu pęcherzyków synaptycznych, przy użyciu barwników FM w tych samych zakończeniach nerwowych w celu zapewnienia prawidłowej kontroli wewnętrznej. W drugim kroku pula łatwo uwalniająca i pula rezerwowa są kolejno wyczerpywane przy użyciu określonych protokołów rozładunku, które umożliwiają ilościowe określenie względnych rozmiarów puli.
Następnie zmień warunki załadunku lub rozładunku, aby zbadać wpływ wybranej zmiany na pęcherzyki synaptyczne, uzupełnienie puli lub mobilizację. Wyniki pokazują, że obciążenie FM d różnych synaptycznych pul fizycznych jest powtarzalne na podstawie kwantyfikacji i analizy rozładunku wywołanego barwnika. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak płynna rodzina reporterów genetycznych, jest to, że technika ta śledzi uzupełnianie pul specjalnie przez pęcherzyki synaptyczne, które uległy endocytozie.
Pozwala również na dokładną kwantyfikację. Ponieważ protokół ten jest wykonywany dwukrotnie w tych samych zakończeniach nerwowych, zapewniając kontrolę wewnętrzną. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie synaptyki, CLE, endocytozy i egzocytozy, takie jak to, w jaki sposób manipulacja w określonych trybach endocytozy może wpływać na uzupełnianie zarówno całkowitej puli recyklingu, jak i synaptycznych pul CLE w jej obrębie, takich jak pula łatwo nadająca się do ponownego użycia i pula rezerwowa.
Podstawowa konfiguracja eksperymentalna powinna składać się z odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego, chłodzonej kamery CCD, fluorescencyjnego źródła światła, aparatu do perfuzji grawitacyjnej, komory obrazowania z równoległymi elektrodami platynowymi i stymulatorem elektrycznym oraz komputera. Wykonuj eksperymenty w ciemności lub w warunkach czerwonego światła przy minimalnym oświetleniu fluorescencyjnym próbki, aby uniknąć wybielania barwnikiem FM. Rozpocznij tę procedurę od użycia siedmiodniowych szczeniąt szczura spra dolly do przygotowania pierwotnych kultur neuronów ziarnistych móżdżku.
Po przygotowaniu kultur ułóż neurony w środku 25-milimetrowego szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-lizyną D w kropelce o średnicy nieprzekraczającej siedmiu milimetrów po godzinie, po siedmiu dniach dodaj dwa mililitry pożywki hodowlanej. Umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe w roztworze soli w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby umożliwić stabilizację w nowym podłożu. Następnie zdejmij szkiełko nakrywkowe, osusz jego spód i obszar otaczający przyczepione komórki małym kawałkiem ręcznika papierowego lub chłonnego papieru.
Następnie za pomocą smaru silikonowego przyklej szkiełko nakrywkowe do dna komory obrazowania. Ogniwa powinny znajdować się między dwoma równoległymi przewodami. Użyj wystarczającej ilości smaru silikonowego, aby całkowicie uszczelnić komorę bez wchodzenia w środek komory kąpieli.
Następnie delikatnie napełnij komorę kąpieli roztworem soli fizjologicznej o objętości około 260 mikrolitrów. Następnie napełnij rurkę wejściową i wyjściową tym samym roztworem. Uszczelnij komorę, przyklejając do góry czyste szkiełko nakrywkowe ze smarem silikonowym.
Następnie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w komorze za pomocą przewodów wejściowych i wyjściowych. Następnie unieruchomić komorę obrazowania w platformie ze stali nierdzewnej. Sprawdź, czy nie ma wycieków, delikatnie przelewając roztwór soli fizjologicznej przez rurkę wejściową.
Kolejnym krokiem jest zamontowanie zmontowanej komory na stoliku mikroskopu odwróconego. Zalać wlot systemu perfuzji grawitacyjnej roztworem soli fizjologicznej i podłączyć komorę do wlotu. Następnie podłącz przewody łączące komorę do stymulatora elektrycznego.
Perfuzjuj neurony za pomocą 1,5 mililitra rozcieńczonego barwnika fm. Następnie stymuluj neurony za pomocą dołączonego stymulatora, aby wywołać wychwyt barwnika Po stymulacji perfunduj neurony świeżym roztworem soli fizjologicznej przez dwie minuty, aby zmyć nadmiar barwnika FM. Następnie trzymaj neurony w roztworze soli fizjologicznej przez osiem minut.
W międzyczasie zlokalizuj sieci aksonalne, w których widoczne są poszczególne zakończenia nerwowe obciążone FM D. Korzystanie z długości fal fluoresceiny. Unikaj obszarów z klastrami komórek.
Następnie ponownie ustaw ostrość obrazu bezpośrednio przed akwizycją obrazu, ponieważ w okresie odpoczynku mógł wystąpić niewielki dryf. Rozpocznij akwizycję obrazu poklatkowego z szybkością jednej klatki co cztery sekundy. Po uzyskaniu od pięciu do 10 obrazów wyjściowych wywołaj egzocytozę łatwo uwalniającej się puli, dostarczając stymulację 30 Hz przez dwie sekundy.
Po uzyskaniu kolejnych 10 obrazów, wywołaniu pęcherzyka synaptycznego, egzocytozy puli rezerwowej za pomocą trzech stymulacji 40 Hz przez 10 sekund z 40-sekundowym odstępem między stymulacjami, uzyskaj kolejne pięć do 10 obrazów. Następnie wstrzymaj pobieranie obrazu. Pozwól neuronom zregenerować się przez co najmniej 20 minut i powtórz ten protokół S jednej fazy ponownie w S dwufazowym dla eksperymentu kontrolnego.
Na potrzeby analizy danych przekonwertuj obrazy na stos. Korzystając z wbudowanej funkcji obrazu J, dostosuj jasność i kontrast stosu, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny, jeśli wystąpił znaczny dryf poziomy. Podczas eksperymentu uruchom wtyczki stack reg i turbo reg na obrazie J, aby wyrównać stos obrazów.
Następnie wtyczka analizatora szeregów uruchomieniowych. Następnie zdefiniuj obszary zainteresowania na co najmniej 90 zakończeniach nerwowych. Pomocne jest przełączanie się między obrazami przed i po rozładowaniu matrycy, aby odsłonić aktywne zakończenia nerwowe.
Idealny obszar zainteresowania to taki, który jest nieco większy niż typowe zakończenie nerwowe. Następnie uzyskaj całkowitą intensywność fluorescencji każdego obszaru zainteresowania w czasie. Następnie wyeksportuj do programu Microsoft Excel.
Pokazany tutaj jest schemat blokowy eksperymentu kontrolnego, w którym neurony ziarniste móżdżku zostały załadowane 10 mikromolowymi FM 1 43 przy użyciu stymulacji 80 Hz 10 sekund. Oto zdjęcie przedstawiające zakończenia nerwowe załadowane FM 1 43. Oto ten sam obraz przedstawiający 90 ponumerowanych obszarów zainteresowania wybranych do analizy po zidentyfikowaniu aktywnych zakończeń nerwowych, a są to obrazy zakończeń nerwowych w wybranych punktach czasowych.
Obrazy te są przedstawione w pseudokolorze, aby zilustrować zmiany we fluorescencji, gdy różne pule pęcherzyków synaptycznych zostały wyczerpane. Wreszcie, tutaj pokazano znormalizowane jednostki fluorescencyjne tych 90 zakończeń nerwowych. W dwóch fazach S jedna i S spadek fluorescencji każdej stymulacji sekwencyjnej może być mierzony i porównywany między dwiema fazami S i S.
W tym eksperymencie kontrolnym zarówno S jeden, jak i S 2 dały te same rozmiary puli łatwo uwalnialnych i rezerwowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo uzupełnianie i mobilizację określonych pul pęcherzyków synaptycznych w centralnych zakończeniach nerwowych za pomocą technik obrazowania fluorescencji życia. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać o potwierdzeniu żywotności i reaktywności komórki poprzez przeprowadzenie eksperymentów kontrolnych S 1 przed zmianą warunków eksperymentalnych S dwa.
Przegląd
Ten artykuł opisuje technikę żywej obrazowania fluorescencyjnego do ilościowego określania uzupełniania i mobilizacji określonych pul wezykuł synaptycznych (SV) w centralnych zakończeniach nerwowych. Metoda ta pozwala na monitorowanie dwóch rund recyklingu SV w tych samych zakończeniach nerwowych, zapewniając wewnętrzną kontrolę dla dokładnego ilościowego określania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania
Tło
- Rozumienie dynamiki wezykułów synaptycznych jest kluczowe dla poznania neurotransmisji.
- Techniki żywego obrazowania zwiększają zdolność do badania procesów synaptycznych w czasie rzeczywistym.
- Poprzednie metody nie pozwalały na skuteczne śledzenie określonych pul wezykułów.
- Niniejsze badanie ma na celu ulepszenie istniejących technik poprzez zapewnienie wewnętrznych kontroli.
Cel badania
- Ilościowe określanie uzupełniania i mobilizacji pul wezykułów synaptycznych.
- Monitorowanie dwóch rund recyklingu wezykułów synaptycznych w tych samych zakończeniach nerwowych.
- Ocenienie wpływu różnych warunków ładowania i rozładowywania na dynamikę wezykułów.
Zastosowane metody
- Żywe obrazowanie fluorescencyjne z barwnikami FM do wizualizowania wezykułów synaptycznych.
- Sekwencyjne wyczerpywanie łatwo uwalnianych i rezerwowych pul za pomocą specyficznych protokołów.
- Imageria poklatkowa do rejestrowania dynamiki wezykułów podczas stymulacji.
- Analiza danych przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazów w celu ilościowego określania intensywności fluorescencji.
Główne wyniki
- Technika ta pozwala na powtarzalne śledzenie ładowania i rozładowywania wezykułów synaptycznych.
- Wewnętrzne kontrole zwiększają wiarygodność uzyskanych wyników.
- Manipulacje trybami endocytozy znacząco wpływają na uzupełnianie wezykułów.
- Analiza ilościowa ujawnia wgląd w rozmiary pul wezykułów synaptycznych.
Wnioski
- Ta metoda zapewnia niezawodne podejście do badania dynamiki wezykułów synaptycznych.
- Oferuje potencjał do odpowiedzi na kluczowe pytania w fizjologii synaps.
- Wyniki mogą wpłynąć na przyszłe badania nad neurotransmisją i plastycznością synaptyczną.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables precise quantification of synaptic vesicle pool dynamics, supporting mechanistic de-risking in target validation for neurodegenerative disease programs. By providing internal controls and differential pool analysis, it enhances predictive confidence in early discovery stages where vesicle trafficking mechanisms are therapeutic targets. The approach addresses variability across preparations, improving reproducibility for cross-functional collaboration in assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic vesicle trafficking pathways to validate targets involved in neurotransmitter release and recycling.
- Operational Value: Provides quantitative, reproducible measurements of readily releasable and reserve pool replenishment under varying stimulation conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates assay-ready readouts of vesicle mobilization kinetics that can be used to screen compounds affecting endocytosis or exocytosis.
- Operational Value: Uses FM dye labeling to produce quantal fluorescence signals proportional to vesicle release, enabling standardized, quantitative screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by quantifying how manipulations of endocytosis modes affect specific vesicle pools in cerebellar granule neurons.
- Operational Value: Enables within-preparation comparisons (S1 vs S2 phases) to control for biological variability, increasing assay reliability in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where understanding vesicle pool dynamics informs mechanism of action and compound effects on presynaptic function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how endocytosis pathways (e.g., clathrin-dependent vs activity-dependent bulk endocytosis) regulate vesicle pool mobilization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (fluorescence decay kinetics) that enable comparison of compound effects on vesicle recycling.
- Analytics: Provides time-resolved fluorescence intensity measurements from regions of interest, allowing calculation of pool-specific replenishment rates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using disease-relevant neuronal models to assess how genetic or pharmacological perturbations alter vesicle trafficking.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging workflow that can be adapted across neuronal models and stimulation paradigms for repeated use in discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by isolating the contributions of specific synaptic vesicle pools to neurotransmission dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility through internal controls (dual-phase measurements in same nerve terminals) and standardized FM dye protocols.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in presynaptic target validation, supporting better go/no-go decisions in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on vesicle pool replenishment, a key presynaptic mechanism.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live fluorescence imaging and neuronal culture preparation, particularly for primary cerebellar granule neurons.
- Depends on inverted epifluorescence microscopy, cooled CCD camera, electrical stimulation, and perfusion systems for precise solution exchange.
- Necessitates standardization of staining, washing, and stimulation timing across runs to ensure comparable vesicle loading and unloading.
- Must account for variability in nerve terminal density and health, addressed by selecting active terminals and using internal controls.
- Limited to optically accessible preparations; not suitable for high-throughput formats without automation of imaging and analysis.
